この作品は、米国·イスラエルのBSFからBSとEDSBSに助成金​​によって賄われていた分子遺伝学におけるヒルダとセシル·ルイス教授の椅子の責務であると信ずる。

注：動物を対象とする手順は、科学のワイツマン研究所の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されている。 1試料の調製<ol><li>膵臓腺房の​​単離<ol><li>開始する前に、新鮮なクレブス - リンガー重炭酸HEPES（KRBH）培地の300ミリリットルを用意してください。 140mMのNaCl、4.7のKClを、ミックス1.16のMgCl 2、1mMのCaCl 2、11mMのグルコース、10mMのHEPES。ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1 mg / mlのダイズトリプシンインヒビター（STI）（再懸濁媒体）を加える。コラゲナーゼ（〜0.75 mg / ml）を（消化培地）を補充した再懸濁培地10ml - 5を準備します。 </li><li> 〜30分間、KRB培地に酸素。泡立ちを防ぐために、酸素化した後、BSAを追加します。 37℃に再懸濁し、消化媒体を持参してください。注：メディアを酸素化すると、細胞の死亡率を減少させ、分泌促進物質に対する応答性を向上させます。酸素化の効果は、少なくとも6時間、明らかである。 </li><li&gt;は制度的動物保護ガイドラインに従って、頸椎脱臼またはCO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げる。その背中に屠殺動物を置き解剖パッドに添付し、エタノールで腹部表面を清掃してください。 NOTE：汚染を避けるために、切開ツールおよび使用前にKRBH培地に使用する水をオートクレーブ。 0.2μmのフィルターを介してKRBH培地をフィルタリングします。膵臓の切除に先立ち、70％エタノールで解剖ツールをすすぎ、クリーンベンチ上で解剖を実施しています。レベル3のバイオ安全キャビネット内のウイルス感染を行ってください。 O / N培養培地に抗生物質を追加します（セクション4を参照してください）​​。 </li></ol></li><li>ネズミ膵臓の切除<ol><li>切開広く腹部皮膚と皮下層。肝臓、胃、腸、膵臓および脾臓（ 図1）を特定。注：以下の手順では、静かに膵臓組織を処理し、過度の機械FORCが適用されることを避けるため電子組織および細胞死の自己消化を防止する。 </li><li> 2つの平滑鉗子を使用することにより、小腸を引き出します。胃からの出口の近くに、小腸近位端で開始します。腸から膵臓を分離し、体腔内にそれを保持している。一度大腸に到達し、ピンク/ホワイトの結合組織に気づく。膵臓と混同しないようにしてください。 </li><li>脂肪または結合組織を収集せずに、できるだけ多くの膵臓組織をクリアします。 （ 図1A-C）脾臓、胃からそれを取り外し、その下に腹部血管を切断することにより、膵臓を削除します。 注：単一の動物から膵臓腺房の​​収率が高いので、一方が他方の組織を収集しないようにするために、すべての膵臓組織を収集控えることができる。 </li></ol></li><li>コラゲナーゼ消化<ol><li>膵臓の37℃に加熱し、再懸濁培地中で数回すすぎ、非膵臓の残りの部分を削除組織。 20ミリリットルのシンチレーションバイアルに予熱した消化培地の〜5ミリリットル中に膵臓を浸し。 1〜3ミリメートルの部分に膵臓をみじん切りに。 （最適〜100rpmで攪拌​​下で）加熱された水浴中に置きます。消化を促進するために、消化された組織の上下に一回数分毎にピペット。 NOTE：コラゲナーゼ消化の持続時間は、主にコラゲナーゼ濃度にし、組織に適用される機械力の量に依存する。 30個の細胞 - 10の腺房、その結果、5分 - 約15分間、0.75 mg / mlのコラゲナーゼの使用と2ミリメートルと5ミリリットルポリスチレンピペットを用いて組織をピペットでは、すべての3オリフィス。消化後、懸濁液は、組織の可視部分を含む濁って見える。コラゲナーゼ効率が異なる市販タイプやロット間で変化するので、経験的に消化のタイミングを決定する。 </li><li>洗濯とフィルタリング<ol><li> 50ミリリットルチューブに消化された組織を移し、DIGを終了再懸濁培地45mlのを追加することによってestion。新しいチューブに粗い（〜1mm）の金属メッシュを通して懸濁液をろ過。遠心分離し、フロースルー100×gで3分間。 </li><li>上澄みを捨て、再懸濁培地50ml中で消化膵臓を再懸濁した。 70または100μmのナイロンメッシュを通して懸濁液をろ過。前と遠心する。 </li><li>再懸濁培地5ml - 、フローティング、損傷した腺房を削除する上清を破棄し、3に膵臓組織を再懸濁するために。再懸濁培地7mlので満たされた15ミリリットルコニカルチューブに膵臓腺房1mlの部分を適用します。 3分 - 腺房は2のために解決できるようにします。 1ミリリットルピペットでチューブの底に沈殿した腺房を収集し、このステップを繰り返して、2 - 3回。 </li><li>彼らの状態をテストするために、光または解剖顕微鏡下で膵臓腺房を表示します。 図2では、対応時間は限ら細胞に与えた隔離の純度及び損害賠償を観察ngの分離。これらの直後に腺房や文化には、最大20時間使用してください。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2アミラーゼ分泌アッセイ注：アミラーゼ分泌アッセイは、膵臓腺房の​​分泌能のグローバル尺度として役立つ。これは、通常、市販のキットを用いて、膵臓腺房をインキュベートしている培地を収集し、培地のアミラーゼ活性を測定することによって達成される。 <ol><li> （ 例えば非刺激対刺激）検査される実験条件の数を決定します。各条件について少なくとも3回の反復を使用してください。また、全細胞アミラーゼ含量（ &#39;合計&#39;サンプル）と中のアミラーゼ活性のためのセット（「ゼロ」のサンプル）を決定するためにレプリケートのセットを追加。マルチウェルアッセイが実施されたプレート、および複製物のそれぞれについて、マイクロチューブの二組の標識が使用される。 注：12または24ウェルプレートsは、それぞれ、腺房懸濁液の1 0.5mlのを監視するために使用することができる。 </li><li> KRBH再懸濁培地30mlで二回腺房を洗浄し、37℃で30分間再懸濁培地中でインキュベートする。マルチウェルプレートに適切な最終濃度に達するように分泌10μlの滴を加える。 </li><li>膵臓腺房は二相性様式で分泌の傾きに反応する。コレシストキニン（CCK）およびカルバコールの1μM（ 図3A）の100pMの5 -最適な分泌値を持つ濃度は50である。 </li><li>洗って再懸濁培地中で腺房を懸濁します。腺房はマルチウェルプレートにと &#39;total&#39;で標識されたマイクロチューブにサスペンションのサスペンションや分量等量で均一に分布していることを確認します。 37℃で30分間、プレートをインキュベートする。 （好ましくは、穏やかな攪拌（〜50回転）の下で水浴中）。 注：腺房の正確な数はexperimen間で異なる場合がありますtsは、各実験内での複製に類似していなければならない。このように、腺房懸濁液の正確な分注が異なるの反復や条件の間で比較するために重要です。 </li><li>インキュベーションの間、「合計」と「ゼロ」のサンプルを生成します。遠心分離機は、「合計」5,000×gで数秒間マイクロチューブとは「zero&#39;で標識されたマイクロチューブに上清から50μlのを削除し、4℃で配置します。溶解は、マイクロチューブにトリトンX-100を添加することにより「合計」サンプル中の腺房は、1％の最終濃度に到達する。精力的にマイクロチューブをボルテックスする。 注：「合計」は実験の反復実験と同様に複製等分。腺房を溶解し、総アミラーゼ含量の放出を導く。あるいは、各反復の細胞含量を決定するために、実験終了時の各条件と溶解で腺房を収集します。 </li><li>腺房サスペンションiの大部分を収集予め標識マイクロチューブの最初のセットNtoの。 5,000×gで数秒間マイクロチューブを遠心。前標識されたマイクロチューブの第二セットに上清を移す。 </li><li>市販のキットでアミラーゼ活性のために上清をアッセイ。分泌されたアミラーゼの割合を計算します。 注：それはその線形範囲でアミラーゼ活性を読むことが重要です。初期全コンテンツから放出されたアミラーゼの割合として分泌アミラーゼの割合を提示。各三連からの培地のバックグラウンドアミラーゼ値を減算し、同様に正規化された初期の含有量の合計で割ります。 </li></ol>膵分泌の3。ライブイメージング膵臓腺房からの分泌は、ライブイメージングによって直接監視することができます。さまざまな蛍光色素やセンサを使用して、ライブイメージングは​​、細胞内の解像度で分泌の特徴付けを可能にする。 <ol><li> iと新鮮に酸素化され再懸濁媒体を準備nは1.1に進み、37ºCに持ってきて。顕微鏡を設定し、温度コントローラーを装備している場合、37ºCにそれを調整します。 </li><li>再懸濁培地30mlに腺房細胞を洗浄し、ガラスまたはプラスチックスライドに配置します。注：親油性色素、親油性色素で標識した原形質膜について標識するために使用される場合、エンドサイトーシスによって内部の膜の標識化を防止するためには5分以上房を染色する。仕事を通して、優しく腺房を処理し、過剰なピペッティングを避ける。 </li><li>一度、その形態は明らかであり、側底ブレブまたは細胞内の液胞を表示腺房の画像化を避けるため、顕微鏡、画像腺房で。賢明な中または直前に撮影の開始にいずれか、灌流チャンバーを使用することにより分泌低下を追加します。 注：高い数値の開口を有する高倍率レンズ（ 例：×63 / 1.4または100 / 1.4×）は、細胞内構造を観察することをお勧めします。 </li></ol> 4。膵臓腺房の​​O / N培養（代替細胞培養技術） 注：O / N培養は、しばしば、アデノウイルス感染のために使用される。検査前16時間-感染は、9、10 6〜10 7 PFU / mlで実施される。 <ol><li>最大20時間、培養膵臓腺房。 25ミリリットルの培地（DMEM、単一の膵臓から得られる再懸濁腺房は、ウシ胎児血清（FCS）（5％）、ピルビン酸ナトリウム（1％）、抗生物質（1％）、L-グルタミン（0.5％）、BSAを補充した（10 mg / ml）をとSTI（0.2 mg / ml）を、5 10センチメートルプレートに分けた。レベル3のバイオ安全キャビネット内でウイルスと腺房に感染。 </li><li> 5％CO 2の加湿空気中で37°Cでの膵臓腺房インキュベートした。腺房は、その後の検査の3,8の前に30分間酸素化再懸濁培地中で回復することを許可します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

ex vivoでの文化だけでなく、外分泌の研究のための代替セットアップは膵管からの流体の生体顕微鏡や測定が含まれる。生体顕微鏡は、マウス唾液腺10で良好に動作することが示された。この方法は、無傷の動物において、リアルタイムでの分泌を記録することができますが、その解像度と外分泌組織を操作するための手段によってのみ制限される。膵管から流体を収集するこ?...

外分泌膵臓は、哺乳動物の膵臓の質量の大部分を構成し、消化酵素1の産生および分泌に捧げられています。外分泌膵臓、腺房の機能ユニットは、関節腔を形成し、株式上皮細胞のクラスタである。ホルモンまたは神経刺激を受けると、酵素で満たされた小胞は、頂端細胞表面に輸送され、それと融合し、内腔1-3にその内容を追放。分泌された酵素は、それらが栄養素に食物の分解を触媒する小腸内へのダクトの合体セットによって排出される。 このビデオでは、全体の膵臓から単離され、それらの分泌能力がどのように評価することができる方法を無傷で腺房を示しています。このセットアップを使用して、膵臓の分泌が刺激後に放出されたアミラーゼの相対量を測定することによって定量される。あるいは、分泌は異なるの使用によって、ライブ画像化することができるセンサーや染料。 無傷の膵臓の多くの特性を保持して孤立した腺房は、操作し、全動物4-6よりも容易に監視することができるので、膵臓腺房のex vivoセットアップが有利で ​​ある。このセットアップは、もともと1970年代後半に開発され、そのような唾液や乳腺3-7のようないくつかの外分泌組織の研究のために拡張されているためであった。注目すべきことに、これらの偏光の上皮の複雑な細胞組織への最小限の干渉分泌の研究を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

膵臓腺房細胞が生産し、消化酵素を分泌する。これらの細胞は、関節腔を形成し、株式のクラスタで構成されています。この作品は、これらの細胞の分泌能力が孤立した腺房の文化によって評価することができる方法を示しています。無傷の外分泌膵臓の多くの特性を保持して孤立した腺房は、操作し、全動物におけるよりも容易に監視することができるため、セットアップが有利である。膵臓腺房の適切な分離は、ex vivo培養は腺房のin vivo性質を表現するように、重要な要件です。プロトコルは、マウスの膵臓から無傷の腺房を分離する方法を示します。続いて、膵臓の分泌を評価するための2つの相補的な方法が提示される。膵臓分泌の直接画像化は、サブセルラー解像度で分泌の特徴付けを可能にしながら、アミラーゼ分泌アッセイは、世界的な尺度として役立つ。総称して、技術はPRESENテッドは、ここで外分泌を研究するための実験の広いスペクトルを可能にする。

、透過光で見ると適切に分離された膵臓腺房はステレオタイプの形態を表示する。彼らの基底外側ドメインは、ラウンドとブレブの欠い表示されます。頂端ドメインは、分泌小胞の数百人に囲まれており、色（ 図2A、B）中の暗く表示されます。核は水疱性の領域に基礎を置かれている。細胞残屑および膵管系及び腺房の分離（ 図2C、D）の初期段階で検出することが...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

単離された膵臓腺房はそれらのインビボの形態および活性を保持し、監視し、分泌を操作するための強力な方法を提供します。この作品は、腺房、マウスの膵臓から単離することができ、それらの分泌能力がどのように評価することができる方法を示しています。

膵臓腺房細胞の分泌能力を評価する

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

assessing-the-secretory-capacity-of-pancreatic-acinar-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K ビュー.  Weizmann Institute of Science. 単離された膵臓腺房はそれらのインビボの形態および活性を保持し、監視し、分泌を操作するための強力な方法を提供します。この作品は、腺房、マウスの膵臓から単離することができ、それらの分泌能力がどのように評価することができる方法を示しています。 

ビデオ: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

生物学

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

カルシウムイメージング、細胞傷害測定、およびアデノウイルス感染の目的のための膵臓腺房細胞の調製

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

表現型マウス肺機能<em&gt;インビボ</em&gt;肺拡散能力を持つ

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

ミトコンドリアの熱発生能力を研究するためのパッチクランプ技術の使用

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

レチナール色素上皮食作用とリポフスチン蓄積の定量化

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

著者スポットライト:高度に分極したヒト網膜色素上皮培養における改良されたリポフスチンモデルと外側セグメント食作用能力の定量化  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...