Este trabalho foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde Grant DK083327 e DK093491 (a SZH).

1. Preparando células pancreáticas acinares para Imagem de cálcio <ol><li> Preparar tampão de incubação contendo HEPES a 20 mM HEPES, 95 mM de NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM de glucose, 2 mM de glutamina e 1 × aminoácidos não essenciais do meio mínimo de Eagle. Ajuste da solução final a pH 7,4 com NaOH. </li><li> Preparar um tampão de incubação de BSA por adição de BSA (1% w / v final) a 25 ml de tampão de incubação de HEPES (descrito acima). </li><li> Preparar um tampão de digestão de colagenase por adição de 1,1 mg / mL (200 unidades / ml), colagenase tipo 4 e 1 mg / ml de inibidor de tripsina de soja a 6 ml de tampão de incubação de BSA (descrito acima). </li><li> Ácido-lavagem mm lamelas 22x22 por imersão em duas partes HNO 3 e uma parte de HCl por 2 horas. Decantar com água DI e armazenar em etanol 70%. </li><li> Sacrificá um rato por asfixia CO 2. Orientar o animal em decúbito dorsal, e preparar a superfície abdominal por cledesmame com etanol a 70%. Realizar uma laparotomia para expor a cavidade abdominal. Dissecar o pâncreas e lave imediatamente em um pequeno barco pesar contendo 6 ml de tampão de digestão colagenase. </li><li> Dissecar afastado qualquer grandes pedaços de vasos sanguíneos de gordura ou visível, em seguida, retire 5 ml de tampão de digestão colagenase e adicioná-lo de volta para o tubo cônico de 15 ml. </li><li> Com uma tesoura de dissecção fina picar o pâncreas no pequeno barco pesando contendo 1 ml de tampão de digestão colagenase. Tritura até que a solução resultante aparece uniformemente dispersas. </li><li> Transferir o produto triturado para um frasco de plástico ml de Erlenmeyer de 125, e adicionar os restantes 5 ml de tampão de digestão de colagenase para o recipiente. Certifique-se de que o tecido é completamente submerso em tampão. </li><li> Colocar o balão num banho de água a 37 ° C e agitar a 90 rpm por 30 min. Durante este curto período de tempo de inatividade, preparar agonistas ativação de cálcio (por exemplo ceruleina, carbacol) e lavar o mm capa ácido lavado 22x22desliza com água DI. A seco, e, em seguida, colocar em cima de uma superfície plana, revestida por filme de laboratório. </li><li> Após 30 min a digerir está completa, transferir a suspensão de volta para o tubo de 15 ml cónica e permitir que as células assentar. Pipetar cuidadosamente o tampão de digestão colagenase e substituir com 6 ml de tampão de incubação BSA. Agitar vigorosamente o tubo à mão durante 10 segundos, a fim de dispersar as células em agrupamentos mais pequenos. Imediatamente após a agitação, retirar qualquer grande, detritos flutuantes da mídia não liquidados. </li><li> Permitir que as células restantes para resolver, e trocar os meios de comunicação com tampão de incubação fresco BSA. </li><li> Repetir o passo 1.11, duas vezes, até a suspensão é composta por apenas pequenos aglomerados que só são finamente visível a olho nu. As células devem se assemelham aos descritos na Figura 1A (linha superior). </li><li> Remover o tampão de incubação de BSA e HEPES substituir com tampão de incubação. </li><li> Prepare um 750 mM, estoque 100X de Fluo-04:00 em 10% DMSO. </li><li> Carregar as células no tubo cónico de 15 ml contendo a suspensão de células e o tampão de incubação de BSA livre de HEPES. Para fazer isso, adicionar um volume apropriado (diluição 1:100) da solução à suspensão de células. Então placa 500 ul desta suspensão em cada lamela 22x22 mm. </li><li> Mantenha lamelas no escuro à temperatura ambiente. Dê o primeiro Ca 2 + medições 30 min após o carregamento. O corante é automaticamente removida do meio após o início da perfusão, o que deve ocorrer após 30 min de carga de corante. </li></ol> 2. Medição de cálcio em células pancreáticas acinares <ol><li> Lavar cada perfusão set-up com água DI e preencha com uma quantidade adequada de tampão ou agonista. Primeiro cada seringa com tampão ou agonista para garantir o fluxo adequado. Grampo seringas a um anel de ficar cerca de 1-2 metros acima do palco microscópio. </li><li> Use uma pinça fina para agarrar com cuidado a partir de sua borda uma suspensão de células contendo lamela. Inclinar a tampaescorregar 45 °, e permitir que o excesso de tampão para fugir. Coloque a lamela sobre a vedação de borracha com as células na parte superior da lamela e montar a câmara (Figuras 2A e 2B). </li><li> Fixar a câmara de perfusão para a fase e inserir o tubo que contém tampão para a primeira entrada da câmara (Figura 2C). Rodar a seringa contendo tampão e permitir que o tampão para perfundir sobre toda a superfície da lamela. Uma vez que o tampão tenha atingido a extremidade oposta da câmara, inserir uma linha de vácuo para a boca de aspiração. Insira quaisquer outros tubos (contendo agonistas, inibidores, etc) em sua posição apropriada ao longo da câmara. </li><li> Visualizar as células utilizando qualquer um, 1,4 objectiva 200X ou 400X abertura numérica e de um laser de árgon para excitar o corante Fluo-04:00 comprimento de onda de 488 nm (Figura 1A, parte inferior). As configurações do laser de potência deve ser ajustada de modo que o tubo fotomultiplicador (PMT) Não está saturado com a luz emitida. Além disso, a tensão através do PMT tem de ser optimizado para a detecção de luz máxima. </li><li> Sinais de&gt; 515 nm de emissão de passa-longo são coletados em velocidades de quadro de 2-5 seg / frame para a visualização de padrões oscilatórios lentos e 0,2-0,3 seg / quadro para a visualização rápida, ondas de cálcio globais (Figuras 3 e 4). </li><li> Depois de imagens estiver concluída, feche as seringas e remover toda a tubulação. Desmonte a câmara e repita os passos de 2,2-2,4. </li><li> Coletar dados como valores numéricos de intensidade de fluorescência ao longo do tempo e transferência à Imagem J (pacote de software fornecido como freeware pelo National Institutes of Health e podem ser encontradas em <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). </li><li> Veja as imagens de celular em tempo real e identificar regiões de interesse (ROI, ou seja, apical, basolateral, nuclear, etc) </li><li> Adquirir intensidades de fluorescência para estes ROIs erepresent como intensidade de fluorescência / linha de base da intensidade da fluorescência (isto é F/F0). </li><li> Gerar traçados traçando F / F 0 vs tempo. Além de traçados de imagens representativas são geralmente fornecidas e exibida usando pseudo. </li></ol> 3. Preparação de células pancreáticas acinares para Ensaios lesão celular <ol><li> Quentes DMEM F-12 mídia (sem vermelho de fenol) a 37 ° C. </li><li> Adicionar BSA (0,1% w / v final), e HCl (50 mM final) para os F-12 DMEM mídia. </li><li> Alíquotas de 50 ml de DMEM para um tubo cónico. </li><li> Preparar um tampão de colagenase por adição de 0,5 mg / ml (12 U / mL) de colagenase tipo IV de 10 ml de DMEM suplementado F-12 media. </li><li> Sacrificá um rato por asfixia CO 2. Orientar o animal em decúbito dorsal, e preparar a superfície abdominal por limpeza com álcool 70%. Realizar uma laparotomia para expor a cavidade abdominal. Dissecar o pâncreas e lave imediatamente em um pequeno barco pesando containing 6 ml de tampão de colagenase. </li><li> Picar o tecido com uma tesoura de dissecção multa para 3-5 minutos ou até que a solução resultante aparece uniformemente dispersas. </li><li> Transferir o tecido triturada para um balão de Erlenmeyer de 125 ml com 5 ml de tampão de colagenase adicional, em seguida, colocar num banho de água em ° C 37 ° C com agitação a 90 rpm durante 5 min. </li><li> Retire do agitador, para permitir que as células assentar brevemente, e troca com 5 ml de tampão de colagenase fresco. Em seguida incubar durante um adicional de 35 min num banho de água a 37 ° C com agitação a 90 rpm. </li><li> Vigorosamente ressuspender a digest, utilizando uma pipeta de transferência até a suspensão se torna homogénea, sem grumos de células visíveis. Em seguida, pipeta suavemente a suspensão de células através de nylon de malha pré-molhado num erlenmeyer. </li><li> Vigorosamente pipetar um adicional de 3 ml de DMEM fresco F-12, com meios (colagenase) através da malha, a fim de forçar através de quaisquer células restantes. </li><li> Adicionar outro 6-10 ml de DMEM F-12 mídia e umGUARDE as células que se contentar com 2-3 min. Repetir este passo duas vezes, e remover o sobrenadante, após a última lavagem. </li><li> Adicionar DMEM fresco F-12 media, ressuspender as células, e placa de 500 ul de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços. As células devem assemelhar-se aos representados na Figura 1B. </li><li> Permitir que a placa para se sentar em um banho de água 37 ° C a 90 rpm por 5 min antes de adicionar agonistas. </li><li> Estimular as células com diferentes agonistas para 2-4 horas. </li><li> Inclinação da placa em um ângulo para permitir que as células que se contentar com cuidado e pipetar uma aliquota dos meios de comunicação (normalmente 100 l) e congelamento de flash em azoto líquido. </li><li> Flash congelar a suspensão de células remanescente. Congelamento de inflamação não é essencial para a medição de LDH. Como uma alternativa as amostras podem ser mantidas em gelo, se eles vão ser testadas no mesmo dia, ou armazenado em -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 4. Medição de lactato desidrogenase Vazamento <ol><li&gt; Medida de lactato desidrogenase (LDH) essencialmente o vazamento utilizando os reagentes e as instruções fornecidas no kit de ensaio Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Promega (ver Tabela de reagentes e materiais específicos). </li><li> Reconstituir o substrato LDH (que é fornecido com o kit) com 12 ml de tampão de ensaio (também fornecidos). </li><li> Descongelar suspensão de células congeladas e amostras de meio num banho de água à temperatura ambiente. </li><li> Placa de 50 ul de cada amostra de material em uma placa de 96 poços. </li><li> Para a suspensão de células, adiciona o volume necessário de 10X de tampão de lise de modo que a concentração final é de 1X. Brevemente Vortex e incubar a 37 ° C durante 60 min. </li><li> Centrifugar as amostras lisadas a 250 xg durante 4 min a detritos sedimento celular. </li><li> Para lisados ​​celulares, placa 50 ul de uma diluição de 1:10 para cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Adicionar 50 ul de substrato reconstituído a cada poço, incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Parar a reacçãoadição de 50 ul da solução de paragem (fornecida com o kit) para cada poço. </li><li> Medir a absorvância a 490 nm. </li><li> Use a seguinte fórmula para calcular% LDH fugas. As densidades ópticas abaixo são corrigidos subtraindo uma leitura OD em branco de um poço contendo apenas PBS, substrato e solução de paragem. </li></ol> LDH em media = (Media OD492) x (fator de diluição media) x (vol. de mídia) * Uma vez que não é normalmente necessário para diluir amostras de mídia, o fator de diluição na maioria das vezes equal1. Total de LDH = ((Lysate OD 490) x (fator de diluição lysate) x (vol. em suspensão de células)) + ((Media OD 490) x (fator de diluição) x (vol. de mídia alíquota para amostragem)) <img alt="Equação 1" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1.jpg" /> 5. Infectando células pancreáticas acinares com Adenovirus <ol><li> Prepararcélulas acinares pancreáticas, como descrito na seção 3. </li><li> Seguindo o passo 3.12, adicionar 10 7 unidades infecciosas (IFUs) de adenovírus para a suspensão de células e incubar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Uniformemente placa de 2 ml de suspensão de células numa placa de 6 poços. </li><li> Para a maioria das construções de expressão, as células devem ser adequadamente infectado dentro de 18 horas, e para algumas construções luciferase, apenas dentro de 6 horas. </li></ol>

<ol>
	<li>Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+agonist-evoked+cytoplasmic+Ca2++signals+in+exocrine+acinar+cells+analysed+by+digital+image+microscopy.">Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy.</a> Embo J. 11, 1623-1629 (1992).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolar+and+submicromolar+Ca2++spikes+regulating+distinct+cellular+functions+in+pancreatic+acinar+cells.">Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells.</a> Embo J. 16, 242-251 (1997).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor+mediates+early+zymogen+activation+in+pancreatitis.">The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).</li><li>Raraty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+enzyme+activation+and+vacuole+formation+in+the+apical+granular+region+of+pancreatic+acinar+cells.">Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+mitigates+caerulein-induced+pancreatitis+in+vivo+in+mice.">Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).</li><li>Shah, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+Activation+during+in+vivo+Pancreatitis+is+Dependent+upon+Calcineurin+Activation.">Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).</li><li>Muili, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+and+genetic+inhibition+of+calcineurin+protects+against+carbachol-induced+pathologic+zymogen+activation+and+acinar+cell+injury.">Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+carbachol-induced+protease+activation+and+accelerates+Ca2++waves+in+isolated+rat+pancreatic+acini.">Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini.</a> J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).</li><li>Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Ca2++wave+propagation+in+pancreatic+acinar+cells.">Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).</li><li>Reed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+extracellular+pH+induces+damage+in+the+pancreatic+acinar+cell+by+enhancing+calcium+signaling.">Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling.</a> J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Van Acker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+progression+locus-2+is+a+critical+regulator+of+pancreatic+and+lung+inflammation+during+acute+pancreatitis.">Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis.</a> J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+multiple+forms+of+Ca(2+)+spikes+by+inositol+trisphosphate+in+pancreatic+acinar+cells.">Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells.</a> J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).</li><li>Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+require+sequential+activation+of+inositol+trisphosphate+receptors+and+ryanodine+receptors+in+pancreatic+acini.">Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+calcium+entry+through+calcium+channels+in+olfactory+receptor+neurones+using+a+laser+scanning+microscope+and+the+calcium+indicator+dyes+Fluo-3+and+Fura-Red.">Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red.</a> Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).</li><li>Saluja, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretagogue-induced+digestive+enzyme+activation+and+cell+injury+in+rat+pancreatic+acini.">Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+contribute+to+bile+acid-induced+pathological+calcium+signaling+and+pancreatitis+in+mice.">Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+activates+pancreatic+calcineurin-NFAT+signaling+in+vitro+and+in+vivo.">Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).</li></ol>

Não há conflito de interesse declarados.

O método de isolamento de células e ensaios subseqüentes descritos aqui representam poderosas ferramentas com as quais estudam os aspectos fisiológicos e fisiopatológicos do pâncreas exócrino. O método de isolamento de células pancreáticas acinares dispersas foi descrita pela primeira vez por Amesterdão e Jamieson, em 1972, 11. Os métodos aqui apresentados foram adaptados a partir de métodos de isolamento mais recentes descritos por Van Acker e colegas 12. Embora estas técnicas são a...

Estas alterações dinâmicas em cálcio intracelular são necessárias para os eventos de células acinares tanto fisiológicos e patológicos. Estes efeitos divergentes de cálcio são pensados ​​para resultar de padrões espaciais e temporais distintos de cálcio de sinalização 1. Por exemplo, a enzima e a secreção de fluido a partir da célula acinar estão ligadas a pontos do cálcio a partir de uma região limitada do pólo apical onde ocorre a secreção de 2. Em contraste, uma onda de cálcio global seguida de sinais de cálcio não-oscilatórias intensas está associada com eventos patológicos iniciais que conduzem a pancreatite aguda 3,4. Estes incluem a ativação intra-acinar protease, a secreção de enzimas reduzida e lesão celular acinar. O nosso laboratório utiliza isolado ácinos pancreáticos de estudar estes eventos patológicos iniciais que conduzem a doença, tanto in vivo como in vitro 5-7. Os métodos descritos aqui descrevem o isolamento de células acinares primárias com a finalidade de medir cyníveis de cálcio tosolic e lesão celular. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mice</td>
 <td>NCI</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>AB00892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3624-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3040-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M-8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C79</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextrose</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>1916-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G-8540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11140-050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>EM</td>
 <td>SX0593</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T-9003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbon Dioxide</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td> 124-38-9 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>125 ml Erlenmeyer plastic flask</td>
 <td>Crystalgen </td>
 <td>26-0005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection kit</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14161-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td>LabChem</td>
 <td>LC222102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000, P100, P10 pipettes</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>FA10005P</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weighing boat</td>
 <td>Heathrow Scientific</td>
 <td>HS1420A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1020-2500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352095</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.65 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20170-293</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>22 x 22 mm glass coverslips</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>032811-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A483-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A142-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized water</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 x 18 mm coverslips</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>021510-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laboratory film</td>
 <td>Parafilm</td>
 <td>PM-996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luer lock</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>932777</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 ml syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>DG567805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 &frac34; gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>9328270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE50 tubing</td>
 <td>Clay Adam</td>
 <td>PE50-427411</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flat head screwdriver </td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM F-12, no Phenol Red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21041-025 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30.5 gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 CC syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>309603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml Erlenmeyer flask</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FB50025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh filter </td>
 <td>Nitex</td>
 <td>03-150/38</td>
 <td>150 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3548</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well tissue culture plate </td>
 <td>Costar</td>
 <td>3795</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td>7727-37-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytotoxicity assay kit</td>
 <td>Promega</td>
 <td>G1782</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adeno-GFP</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Gift from J. Williams</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring stand with clamps</td>
 <td>United Scientific</td>
 <td>SET462</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perifusion chamber</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum line</td>
 <td>Manostat</td>
 <td>72-100-000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water bath with shaker</td>
 <td>Precision Scientific</td>
 <td>51220076</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>LSM 710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BioTek Synergy H1 plate reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td>11-120-534</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>Nuaire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture Incubator</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>3110</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of pancreatic acinar cells for the purpose of calcium imaging, cell injury measurements, and adenoviral infection

As células acinares do pâncreas é a principal célula do parênquima do pâncreas exócrino e desempenha um papel primordial na secreção de enzimas pancreáticos no ducto pancreático. É também o local para o início da pancreatite. Aqui, nós descrevemos como células acinares são isolados a partir de sinais de cálcio intracelular tecido e pâncreas todo são medidos. Além disso, descrevem-se as técnicas de transfecção destas células com as construções adenovirais, e, subsequentemente, medindo a fuga de lactato desidrogenase, um marcador de lesão da célula, em condições que induzem a lesão das células acinares, in vitro. Estas técnicas proporcionam uma ferramenta poderosa para caracterizar acinar celular fisiologia e patologia.

Um exemplo de medições de cálcio de células acinares, em resposta a estímulos fisiológicos é fornecido na Figura 3. As células acinares foram carregados com o corante Fluo-cálcio 4 e perfundido com a acetilcolina análogo carbacol (CCh, 1 uM)) 8. Células reagiu, sob a forma de uma onda de cálcio, que tem início na região apical e propaga à região basolateral de 3,9. Traçados representativos mostrados na Figura 3B mostram o padrão típico de pico-pl...

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Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Nós descrevemos um método reprodutível de preparação de células acinares pancreáticas de rato de um rato com a finalidade de examinar os sinais de cálcio de células acinares e lesão celular com estímulos fisiologicamente e patologicamente relevantes. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.

Preparação de células pancreáticas acinares para Fins de cálcio Imaging, celulares Medidas ferimento e infecção adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

preparation-pancreatic-acinar-cells-for-purpose-calcium-imaging-cell

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K visualizações.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. Nós descrevemos um método reprodutível de preparação de células acinares pancreáticas de rato de um rato com a finalidade de examinar os sinais de cálcio de células acinares e lesão celular com estímulos fisiologicamente e patologicamente relevantes. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.