当社のプロトコルは、Acinar-to-導体転移の直接可視化を提供し、このプロセスに対する異所性に投与された因子またはタンパク質変調の寄与の研究を可能にする。この技術の主な利点は、アシナル-導体代謝がリアルタイムで見ることができ、細胞シグナル伝達研究が行われることである。安楽死させたマウスから膵臓を解剖するには、まずマウスの足をポリスチレン蓋にピン留めし、尾部が研究者に向き合うように向き、腹部に70%エタノールを吹き付ける。
オートクレーブ鉗子を使用して中線で毛皮と皮膚を持ち上げ、オートクレーブハサミで、尿道開口部から横隔膜リブケージ領域まで毛皮と皮膚を切開します。毛皮と皮膚を切り取るために左右に追加の切開を行い、腹腔の明確なビューを作成します。その後、腹膜の裏地に切り込み、真ん中と左右に切り込み、臓器から引き離します。
鉗子を使って腸を持ち上げ、マウスの左側に移動し、暗い赤い卵形の脾臓に取り付けられた薄いピンクの膵臓を見るスペースを作ります。膵臓組織は柔らかく、スポンジ状の質感を持つことになります。胃に沿って走る膵臓を切り取り、腸と絡み合う。
脾臓を膵臓から分離し、10ミリリットルのHBSSを含む50ミリリットルのチューブに膵臓を1回ペニシリンレンサプトマイシンで入れ、ラミナーフローフードに移します。チューブの内容物を空の計量ボートに注ぎ、鉗子を使用して膵臓を渦巻いて洗います。次に、鉗子を使用して、ペニシリンストレプトマイシンを搭載したHBSSを含む第2の計量船に膵臓を移動させ、旋回して再び洗浄する。
ペニシリンストレプトマイシンを搭載したHBSSを含む3番目の計量船に膵臓を移動し、5ミリメートルまたは小さな部分に膵臓を切断開始します。重量を量るボートの内容物を新鮮な50ミリリットルの管に注ぐには、まず鉗子を使って、ボートが転倒する時に、膵臓片を液体に移動させる。ピースがボートに取り付けられなくなったら、その内容物をチューブに注ぎます。
鉗子で残った部分を拾い、管の鉗子を洗う。2分間摂氏4度で931倍の重力でチューブを遠心した後、5ミリリットルのピペットを使用してHBSSと浮遊脂肪を取り除きます。HBSSで希釈したコラゲターゼを5ミリリットル加えます。
チューブを閉じ、プラスチックパラフィンフィルムでチューブを包んで密閉した蓋を確認します。インキュベーターに入れ、摂氏37度で220RPMで20分間揺れます。これは濁った溶液をもたらすでしょう、そして少数の残りのティッシュピース。
解離を止めるには、チューブを氷の上に置き、5%FBSで5ミリリットルの冷たいHBSSを加えます。摂氏4度で931倍の重力で2分間遠心した後、5ミリリットルのピペットを使用して上清を取り除きます。ペレットを5%FBSのHBSSの10ミリリットルで再懸濁し、摂氏4度で2分間931倍の重力で再び遠心分離機を再び中断する。
5ミリリットルのピペットを使用して上清を取り除き、5%FBSでHBSSの別の10ミリリットルでこのステップを繰り返します。その後、5%FBSで5ミリリットルのHBSSでペレットを再懸濁します。P1000ピペットを使用して、500マイクロメートルのメッシュを通して50ミリリットルのチューブに一度に1ミリリットルの細胞懸濁液をろ過します。
残りの膵臓細胞をメッシュで洗浄するには、5%FBSでHBSSを5ミリリットル追加します。次に、P1000ピペットを使用して、105マイクロメートルメッシュを通して1ミリリットルを50ミリリットルのチューブに通します。この細胞懸濁液を30%FBSのHBSSを含む50ミリリットルチューブにそっとピペットを入れ、上部に細胞懸濁液の層を形成する。
この細胞懸濁液を摂氏4度で233倍の重力で2分間遠心し、上清を取り除く。アシナル細胞を含むペレットをウェイマスの完全培地の1回に再懸濁する。1つの膵臓は2つのウイルス感染に十分であるため、細胞懸濁液を2つの35ミリメートルプレートの蓋の間に分割し、懸濁液中の感染を可能にする。
アデノウイルス感染の場合は、各プレートの蓋に1/1000希釈でウイルスを加え、渦巻く。プレートをセル培養インキュベーターに摂氏37度、5%CO2に入れる。最初の1時間は15分ごとに旋回し、さらに2時間インキュベーションを続けます。
コラーゲンゲルを作るためには、1ラットの尾コラーゲンの7ミリリットル、ウェイマスの媒体の10倍の700マイクロリットル、氷上の50ミリリットルのチューブに0.34モル水酸化ナトリウム466.6マイクロリットルを組み合わせてコラーゲンゲルを作ります。50ミリリットルのチューブで、3時間のインキュベーション後に等量の細胞懸濁液とコラーゲンゲルを組み合わせ、穏やかに混ぜます。プレート2000マイクロリットルは、氷の上にプレートを維持しながら、6ウェルプレートに一度に1つの井戸、均一にコラーゲン細胞層を分配するために渦巻く。
培地を固めるには、37°Cの細胞培養インキュベーターでプレートを30分間インキュベートし、5%の二酸化炭素を20%ずつインキュベーターします。その後、所望の刺激または阻害剤とウェイマスの完全な媒体の1回の井戸あたり1.5ミリリットルを追加します。翌日にメディアを変更し、その後1日おきに変更します。
使用される刺激に応じて、Acinar-to-導管代謝またはADMは3日目から5日目の間に観察することができる。GFPアデノウイルスへの感染後24時間、コラーゲンまたは基体膜マトリックスに埋め込まれた細胞の画像は、感染が効率的であることを示した。感染後5日で、コラーゲンに埋め込まれた細胞は、TGFアルファの1ミリリットル当たり50ナノグラムで刺激されたときにダクト様構造を形成した。
基部膜マトリックスに埋め込まれた細胞は、感染後5日間の刺激がない場合にダクト状の構造を形成した。一方、より大きなダクトは、TGFアルファのミリリットル当たり50ナノグラムの刺激で形成された。プロトコルの中で最も重要なポイントの1つは、コラゲナーゼ消化の長さです。
適切な消化は濁った溶液と少数の残りの組織部分によって示される。
