細胞培養の準備での専門家の助言と支援のためのカスタム電子機器やソフトウェアの開発のための洞察に満ちた議論を、ジャコモPruzzoとアレッサンドロパロディのためのリアルタイム制御システム、エヴェリーナChieregattiと花子対馬を開発するためのアルベルトGuiggiani、とクラウディアキアブレーラとマリーナナンニ。

1。光学装置光学系全体は、前述15について説明した。簡単に言えば、光ピンセットシステムは波長1064nm（IPGレーザー社）におけるイッテルビウム連続波（CW）ファイバレーザの動作に基づいている。空間光変調器（SLM）（LCOS-SLM、モデルX10468-07 - 浜松）はコンピュータ生成ホログラムによって培養皿上でトラッピング焦点スポットの位置を制御するために、着信IRレーザービームの位相を変化させる。自由に利用できるブルーピンセットソフト（機器·テーブル上のWebリンク）空間光変調器に投影された生成されたホログラム。フォトダイオード（PD、PDA100A-EC - ソーラボ） - 力分光測定用干渉計は、4象限フォトダイオード（浜松C5460SPL 6041ボードとQPD、S5980）に基づいていた。 355nmの（ - ティームフォトニクスPNV-001525から040、パワーチップのナノパルスUVレーザー）でのYAGレーザー：レーザー解剖ソースはパルスサブナノ秒のUV Ndのだった。音響光学変調器は、（MQ110-A3-UV、355nmの溶融シリカ-AA-光電子）のサンプルに配信UVレーザーのパワーを制御した。 顕微鏡のobjective.The段は3軸リニアDCモータマイクロポジショニングで構成されている浸60X、0.9 NA水装備 - ホログラフィック光ピンセットやレーザーマイクロ切開は修正正立顕微鏡（オリンパスBX51）に統合されましたのサブナノメートルの分解能で試料の粗動を結合する別個の3軸圧電ナノ位置決めステージ（P-733.3DD、物理学機器）を搬送するシステム（M-126.CG1、物理学機器）ピエゾ舞台。顕微鏡ステージ·システムは、2つのコントロールが相乗的に、右側の位置に捕捉焦点スポットを維持するために作用する選択された作業モード（位置またはクランプ力、静的または動的）16に応じたループを備えていた。具体的には、内部フィードバックループは、選択時にビードを維持するために、圧電ステージに作用するトラップ中心からED距離。他の外部ループは、その利用可能なストローク17よりも大きな面積にピエゾアクチュエータで張ら地域を悪用する電動ステージの位置を制御する。それが試料に付着した捕捉されたビードを追跡しているので、ピエゾステージが一方向に利用可能なストロークの限界に達したときに、外部ループは反対方向に微小ステージを移動させ、これによりピエゾは、その中心位置に向かって回復する。ピエゾステージはそのコース範囲の中心位置に到達すると、マイクロステージが停止する。 システムのさらなる詳細はGuiggiani ら 16,17に報告されている。 ペルチェ素子（TC-344BデュアルチャネルヒータコントローラとQE1抵抗加熱 - ワーナーインスツルメンツ）顕微鏡（37°C）の下での細胞培養の温度を制御する。文化では、pHと湿度は、カスタム設計されたポリジメチルシロキサンを通気することにより生理的条件に維持した加湿カーボゲン（95％O 2、5％CO 2）とシロキサン（PDMS）スリーブ（顕微鏡対物レンズを統合）。 2。細胞培養の準備全ての実験プロトコルは、イタリア保健省によって承認された。初代培養物は、胎生18（E18）において、マウスの海馬（C57BL6J、チャールズリバー）から入手した。 <ol><li>ニューロンは、ガラス底ペトリ皿（ - MaTek社P35G-0-14-C）上に25,000細胞/ mlの濃度で播種した。培養細胞の低濃度は、in vitroでの最初の数日間に既に密なネットワークの形成を回避するために必要とされる。上述の細胞濃度で、他のセルに接続していない長い突起を有する単離された細胞を発見する可能性がはるかに高い。 </li></ol> 3。ビーズコーティング<ol><li>ポリマー微小球は（Ø4ミクロン、COOH終端-前髪研究所、製品コードPC05N/6700）ポリで被覆したpolyLinkタンパク質結合キット（Polysciences社、製品コード19539）に記載の手順に従って-D-リジン。ビーズを培養支持体と好意細胞接着をカバーするために使用される同じ分子で被覆されている。 </li></ol> 4。隔離されたニューロンを選択してください。培養基質、トラップからビーズをデタッチし、ニューロンの隣にそれを移動します<ol><li>顕微鏡ステージ上で文化ペトリ皿を置く。ステージ運動により試料上にフォーカスを設定した後、ケーラー照明を設定する照明客観コンデンサーの位置を修正します。 Kolher、照明条件を設定する照明光学系を位置合わせすると、明視野像品質を向上させる必要がある。このような整列条件を用いて、それがQPDとPDによって、その干渉追尾を実行するように、散乱閉じ込められたプローブから、また、IRレーザ集効率（対物レンズを介して凝縮器）を最大化することが必要である。 </li><li>でコーティングされたマイクロスフェア原液を数μlのピペット培養皿へ。ミクロスは、預金と培養基質に付着する。培養皿に注入液の数は、原液のミクロスフェア濃度に依存する。理想的な条件は、1と2のビューの画像につきミクロスフェアフィールド間を持つことです。あまりに多くの微小球培養皿に追加されると、彼らはすでに培養ニューロンにランダムに添付することができます。 </li><li>長い神経突起（軸索）孤立ニューロンを探し、培養皿の中を移動し、顕微鏡ステージの位置を保存します。 </li><li>周りに移動し、培養支持体に付着したビーズを検索。 </li><li> IRトラッピングレーザーをオンにします。この段階では、まだホログラムがSLM上に投影されず、IRレーザスポットの位置は、UVレーザスポットの位置と一致する。顕微鏡ステージの運動によって2-3μmの培養支持体表面上のIRスポットの軸方向の位置を設定します。 </li><li> 1未満μW、サンプルに送達UVレーザパワーを設定する。ザUVレーザー解剖器具は、以前14をキャリブレーションされています： 5-6μWガラス支持体がアブレーションさ 4μWニューロンの接続が完全に解剖される 神経突起の一部が損傷されている2.5μW &lt;1μW衝撃波は、培養皿で製造される。光衝撃波は、ガラス支持体からビードを取り外すのに十分な強度である。 </li><li>にIRレーザーを残しながら、UVレーザーをオンにし、顕微鏡ステージの運動によって付着ビーズ上記UVスポットを移動します。ビーズ表面から切り離され、そしてそれがIRレーザーによって捕捉される。その後、UVレーザーをオフにします。 </li><li>ガラス支持体（20〜30ミクロン）上にトラップされたビーズの数μmを移動します。この位置にビーズを持ち上げると、それは以前に選択したニューロンに向かって移動している間、他の細胞に接触するからそれを防ぐことができます。以前に保存したステージ位置にビーズを持参。ドラグ流体力光学トラップを超えないように、低い値（10ミクロン/秒）にステージ速度を設定するpingの力。 </li></ol> 5。計算機ホログラムによるレーザーディセクタスポットとアクソン位置に対するトラップの位置を移動し、光ピンセットの剛性を校正<ol><li>軸索を可視化するためにガラス支持体に向かってビーズを移動します。ビードは、それ（約5μmのガラス支持体上）との接触を避けるために、セルの上方に保持されている。 </li><li>軸索の幅の中心にUV焦点スポットを移動するために顕微鏡のステージを移動します。現在のステージ位置を保存します。 </li><li>計算機ホログラムによりIR焦点スポット位置を移動します。このステップでは、ステージが前のステップで選択した位置で停止される。計算機ホログラムがSLM上に投影されるとき、捕捉ビーズは、軸索に対して移動される。我々はあまりにも同じ神経突起を中心としたUVレーザスポットで、追い込まれたビーズは、神経突起の中央に揃えているようにIRレーザスポットを移動します。 IRスポットしたがって、トラップビードが神経突起に沿って配置されている5-10程度離れてUVスポットから。私たちは、神経突起の形状に応じて、UVスポットに対するIRの位置を移動。光ピンセットは、SLMシステムが装備されていない場合には、位置がIR光路上の可傾ミラー、又は音響光学偏向素子によって変化させることができる。 IRレーザスポットは、そのブラウン運動に影響を及ぼす力分光法トレースを変えることができる閉じ込められたプローブを有する切開ビームの光の相互作用を避けるために、UVスポットから離れる5-10ミクロンを配置することができる。 </li><li> UVスポットと軸索の位置に対して新しいIRスポット位置を定義した後、軸索から閉じ込められたビーズを配置し、それとの衝突を避けるために、ステージを移動します。カバーガラス上の2程度にトラップされたビーズの軸方向の位置を移動します。 </li><li>その上に干渉縞がセンターにQPDを合わせ：xとy QPD差動信号はQPDが中央に配置さゼロです。 interferoによってトラップビーズのブラウン運動の5秒を取得メートル、50 kHzのサンプリングレートで。パワースペクトル法18による光学トラップの剛性（PN / nm）で、感度（V / nm）を取得します。 </li></ol> 6。アクソンにビーズを取り付けます。軸索切断と同時力測定を実行<ol><li>カバーガラス上が4μm程度トラップビーズの位置を上げ、以前に保存したステージ位置（ステップ3.2を参照）に移動します。 </li><li>軸索に向かって閉じ込められたビーズダウンを移動し、それが接触する神経突起をするまで。捕捉されたビードと軸索との間の衝突を軸方向に捕捉されたビードの変位を検出zのQPD信号により監視される。 </li><li>トラップされたビーズと10秒待つと、神経突起の膜への密着性を支持する軸索に押し付け。 </li><li>軸索から閉じ込められたビーズを変位させるマイクロステージを移動し、これにより細胞膜への付着を確認します。ビーズが付着した場合、それは光学トラップから逃げる。 </li><li>付着したビーズ上のレーザートラップを戻すとゼロに等しい力条件を持つ力クランプ·ループをオンにします。光学トラップ中心のセルに添付されたように、ピエゾステージ再配置ビーズ、、で。システムは、フィードバックループ制御を持たない場合、レーザトラップ位置を中心it onに付着したプローブ顕微鏡ステージによって移動させることができる。 QPD信号が捕捉ビーズおよび細胞（xおよびy QPD信号がゼロに等しく、およびz QPD信号は、4つの象限の同じ電圧の和を与えるに接着されていない場合と同じである場合、トラップの中心に到達する）ビーズは、任意の表面から遠くにトラップされたときなど。 </li><li>付着閉じ込めプローブ上のプリテンションを生成するために、ビーズ（約100nm）の中央やや上のトラップレーザーを配置、z軸上の力クランプ条件を設定します。システムは力クランプ制御が装備されていない場合には、光学トラップ位置を顕微鏡ステージによって25nmのステップで最大上昇させることができる。 Z QPD信号が監視できます。したがって、THIを使用sが付着したプローブに対するレーザトラップの位置を設定するシグナル。このようなプリテンションは、軸索病変後の膜の緊張、および付着したプローブのブラウン運動の結果として生じる減少を感知するために必要とされる。同様のアプローチは、ビデオ撮像19による膜テザーに張力の放出を測定することが提案されている。 </li><li>スイッチオフ位置クランプ条件（ピエゾステージがブロックされている）に付着したプローブ上の力を測定するための力クランプフィードバック。 </li><li>レーザー軸索切断タイムラプス明視野イメージング（20 Hzのフレームレート）の間の干渉計（20 kHzのサンプリング周波数）と、セルを閉じ込めプローブ位置の同時録画を開始します。 </li><li>病変は軸索の画像上に見えるようになるまでのレーザパルスを提供するためにUVレーザーをオンにします（通常は200-400光パルスが必要とされるパルスあたりのエネルギー：25 NJ）、その後、UVレーザーをオフにします。 </li><li>約3マイルのために干渉計によって記録を継続にn、x、y及びz QPDトレースがプラトーに達するまで。 </li></ol> 7。合計テンションリリースを定量<ol><li>ナノメートルのそれぞれのトレースを取得するために、光学トラップの校正された感度で録音しQPDトレース（ボルト）に変換します。 </li><li> 10Hzでカットオフを有するハイパスフィルタによってx、y、およびz変位トレースをフィルタリングする。 </li><li>トラップされたビーズのブラウン運動を表すフィルタトレースの全​​分散を計算します。 500ミリ秒（10,000データポイント）20の時間ウィンドウの重複は25ミリ秒ステップで分散を計算します。トレースのフィルタリングハイパス、膜変動または皮質アクチン運動によるブラウン運動の変化を除外します。ビードのブラウン運動は、細胞膜上の光学力及び密着力によって低減される。膜は、その粘度が増加する張力の解放ので、ビードのブラウン運動の緊張したとき、直ちに、検出されたately軸索切断後、減少し始める。 </li><li> UVレーザーエネルギーの送達後に、ブラウン運動の分散の減少の始まり：T0を定義します。時刻t0においては、膜の株の始まりを示す。 </li><li>ブラウン運動の差異（それはプラトーに達したとき）の減少の終了：T1を定義します。時刻t1は、膜株の終了を示す。 </li><li>力測定時の試料のいずれかのドリフトを測定するために、カバーガラス支持体上に破片や傷のビデオトラッキングを行う。ガラス支持体上に粒子を追跡するには、まず、黒の背景に白の粒子とバイナリイメージのスタックを取得するために、明視野画像にしきい値を適用する。そこで、サブピクセル精度（フリーのImageJソフトウェアを使用して）質量の粒子の中心を追跡する。 </li><li>変位QPDトレースから測定されたドリフトを減算。それぞれの校正された光学剛性（K X、kでドリフト補正QPD痕跡を掛ける<suB&gt; Y、K z）はピコニュートンのFX、FY、Fzはトレースを取得します。 </li><li> F TOT =√（Fxの2 + Fyを2 + Fzの2）と全体の力トレースを計算します。 </li><li> F TOT（T0） - F 解放 = F TOT（T1）としてt0とt1の間の力の合計のリリースを計算します。それはトラップの中心からのプローブの変位によるものですので、t0で測定された力は、減算されなければならないときに神経突起にビーズ付着。 </li><li>捕捉されたビーズとUVレーザスポット位置との間の神経突起の接触面積を計算する：明視野像に捕捉されたビーズとUVレーザスポット位置との間の神経突起（L）の長短（D）の軸を測定する。軸索の接触面積が軸索である=長さ×D. </li><li>によって放出合計解放力Fを正規 軸索接触面積軸索 。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々は、この研究でレーザー誘起細胞の病変中に同時力分光測定を行うことにより、培養基板への密着性神経突起を比較する定量的な方法を報告する。緊張の測定されたリリースは、基板への細胞の付着の度合いに関係している：接着斑数の多い細胞が少なく緊張を解放する必要があります。ピコニュートンの面で緊張の放出を測定することは、異なる実験条件14で培養支持体に軸索...

光学顕微鏡は、生きた細胞を観察するために使用できる、低侵襲イメージング·システムの一つである。そのような放射圧（光ピンセット1のように）、または高エネルギー光子束（レーザディセクタ2のように）として作用の利用では、この技術は、ナノ操作まで延長された。光学撮像システムは、3つのサブ細胞標的を視覚化して操作するための正確な制御を供給する。同時に、送達レーザパワーの正確な較正のおかげで、光ツールは前例のない再現性のいずれかまたはソフト侵襲試料操作を実現する。 いくつかの研究室は、異なるセル5が互いに融合したり、光学的に貨物6,7を駆動することにより細胞を刺激し、細胞小器官4を焼灼するために、同じ実験設定、光ピンセット、レーザディセクタに、統合された。光ピンセットは、光学剛性のキャリブレーションした後、可能にする一方でピコニュートンスケールのセルに印加される力の制御は、レーザ切開システムは、膜の光ポレーションからサブ細胞構造の単一細胞小器官又は解剖の切除の範囲光学的操作を調節することができる。しかし、レーザー解剖校正は、主に試料8に生じた形態学的変化を示す画像分析に基づいてサンプルに送達されるエネルギー、光に対する操作のエンティティの定性的評価に依存している。提示手法では、ピコニュートンスケール、サブ細胞区画9の細胞骨格構造の変化した平衡によって生成力に、定量化するために、開発ニューロンのレーザー軸索の解剖時に力の分光測定を実行する方法を示します。培養されたニューロンは、基板に付着し、開発中に分極する。偏光位相は、in vitroで最初の5日の間に発生します。偏光の第二段階では、EXTRUDの一つるの突起が長くなり、それが軸索10になるように分化する。成長円錐での牽引力に応じて、軸索の伸びが以前Dennerlのモデル11でモデル化されています。最近では、このモデルは、細胞外マトリックスの基材への密着性神経突起の役割を含むように12を拡張されている。実験観察13後提案この生物物理学的モデルは、神経突起に沿って伝搬する、成長円錐に力を引っ張ったことを示した、基材への接着斑によって変調される。同様に、軸索の病変は、細胞体に向かって伝播する緊張の局所放出を生成します。従って、我々は病変と細胞相馬間軸索に沿った位置でこのような解放の張力を測定することは影響を受けない接着斑の減衰成果を評価するための可能性を提供することを提案。 私たちは、招いた軸索damagの程度を制御するために必要なエネルギーレーザーディセクタのフォトンフラックスを校正電子、完全離断からの部分的な病変へ。キャリブレーションに続いて、我々はいくつかの差別化ニューロンの軸索への部分的な病変を繰り返すとテンション放出を定量化するためのプロトコルを開発し、これにより基板14に軸索の密着性を推定するための定量的なパラメータを取得しました。 本研究では、詳細にはそのような化学的処理14、または細胞培養担体異なるタイプのような異なる実験条件では、基板への軸索の密着性を評価し、ピコニュートンの感度と比較する正確な実験手順を表す開発されたプロトコルを記述する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

現像神経回路網内の機能的な結合の形成は、外因性の合図によって影響される。開発ニューロンの神経突起成長は化学的および機械的信号、および機械的な信号に、それは感覚や反応があまり理解されているのメカニズムに従うものとします。細胞成熟の力の役割を解明することは、基板に細胞接着および細胞骨格の結合を促進し、従って損傷後の神経再生するために、異なるタイプの能力を向上させることができる足場の設計を可能にする。 ここでは、レーザ誘起細胞の病変中に同時力分光測定を適用する方法について述べる。私たちは、軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブの同時干渉追跡によって部分的に病変軸索に張力放出を測定。我々の実験的なプロトコルは、ピコニュートン感度の張力解放を検出し、テンションリリースの動的にミリ秒の時間分解能。従って、細胞と基質との間の機械的結合が薬物治療及び/又は基板の別個の機械的特性により変調することができる方法を研究するための高解像度の方法を提供する。

セルは、その焦点癒着により基板上に牽引力を発生。細胞骨格要素によって生成された力は、培養基質の反作用力と平衡状態にある。神経突起のレーザ誘起病変した後、細胞骨格緊張ケーブルの一部が破壊され、基板密着性の対向する力が除去されているので、それらの平衡化張力が解除される。解放張力は、部分的に影響を受けない接着斑に分布し、細胞膜に付着ビード、光学トラップに?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

我々は部分的に軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブで行わ同時力分光測定によってレーザーディセクタで損傷された軸索の緊張放出を測定した。開発された実験プロトコルは、培養基板に軸索の接着性を評価します。

ピコニュートンとミリ秒の分解能で基板への軸索の接着性を評価するために、レーザー誘起軸索病変の間にテンションリリースの測定

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K ビュー.  National Research Council of Italy. 我々は部分的に軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブで行わ同時力分光測定によってレーザーディセクタで損傷された軸索の緊張放出を測定した。開発された実験プロトコルは、培養基板に軸索の接着性を評価します。

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

生物工学

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

ウサギの乳腺への管内配達

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

神経のインプラントの軟化挙動を予測する環境の動的機械分析

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

イメージング インテグリン張力と細胞の力でサブミクロン解像度統合テンション センサーで

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...