このプロトコルは、細胞、特に免疫細胞によって生成される分子力をマッピングする方法を提供します。このプロトコルは、メカノバイオロジーにおけるメカノトランスダクションの研究に関心のあるラボにとって重要です。この技術の主な利点は、非常に簡単で、従来の蛍光顕微鏡を使用して不死化細胞および初代細胞における力伝達を定量化できることです。
まず、25ミリメートルのカバーガラスを50ミリリットルのビーカーのポリテトラフルオロエチレンラックに置き、カバーガラスを水に浸して3回すすぎます。等量のエタノールと水を混合し、ラックとカバーガラスを含むビーカーにこの溶液40ミリリットルを加えます。次に、パラフィルムテープを使用してビーカーを密封します。
超音波洗浄機で15分間ビーカーを超音波処理してカバーガラスを洗浄し、超音波処理後に液体を廃棄します。次に、ラックとカバーガラスを含むビーカーを水で少なくとも6回すすぎ、残っている有機溶剤を取り除きます。新鮮なピラニア溶液を調製するには、50ミリリットルのビーカーに30ミリリットルの硫酸を加え、10ミリリットルの過酸化水素をゆっくりと加えます。
ガラスピペットの端を使用してピラニア溶液を静かに混合します。エッチングを開始するには、カバーガラスを保持しているラックをピラニア溶液の入ったビーカーに移し、室温で30分間インキュベートしてカバーガラスをクレンジングしてヒドロキシル化します。次に、スチールまたはポリテトラフルオロエチレンピンセットを使用してラックを清潔な50ミリリットルのビーカーに移し、水で6回すすぎます。
水を完全に除去するには、カバーガラスを保持しているラックを40ミリリットルのエタノールを入れた50ミリリットルのビーカーに浸します。その後、エタノールを廃棄する。次に、ラックを3%アミノプロピルトリエトキシシランを含むエタノール40ミリリットルに室温で1時間浸し、カバーガラス上のヒドロキシル基との反応を開始します。
カバーガラスの表面を40ミリリットルのエタノールに浸して6回すすぎ、摂氏80度のオーブンで20分間乾燥させます。カバーガラスがペトリ皿の内側に滑り込まないように、ペトリ皿の内側の底をパラフィルムテープで覆います。次に、アミンで覆われたカバーガラスを、DNA張力プローブで機能化する側を上に向けて配置します。
将来の使用のために摂氏20度でカバーガラスを覆います。カバーガラス上のアミン基を変更するには、リポ酸PEG NHSおよびmPEG NHSを追加し、ペトリ皿を室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、表面を水で3回すすいでください。
その後、1ミリリットルのスルホ-NHS-アセテート1ミリグラムを含む100マイクロリットルの0.1モル重炭酸ナトリウムをサンドイッチカバースリップのセットに加え、不動態化が起こるまで30分間インキュベートします。各カバーガラスに0.5ミリリットルの金ナノ粒子を加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、カバーガラスを水で3回すすいでください。
ブラックホールクエンチャー2鎖をアニールしたDNAテンションプローブに10対1の比率で添加した後、2つのカバーガラスあたり100マイクロリットルの混合物を加えてサンドイッチを作ります。湿ったラボティッシュボールをカバーガラスから離れたペトリ皿に慎重に置き、溶液が乾燥しないようにパラフィルムテープで皿を密封します。その後、皿をホイルで覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、チャンバーを締め付けながら表面にひびが入らないように注意しながら、イメージングチャンバーを組み立てます。次に、0.5〜1ミリリットルのハンクバランスソルト溶液をイメージングチャンバーに追加します。100倍対物レンズのCy3Bチャネルを使用して、DNAヘアピンテンションプローブにプレーティングされた細胞の蛍光シグナルを、拡散し始めたときに捕捉します。
100マイクロモルの非蛍光ロッキングストランドストックを調製した後、所望の時点で、イメージングチャンバー内の最終濃度1マイクロモルで細胞に添加し、張力シグナルを保存し、ピペッティングによって細胞と混合します。約10分間のロック後、定性的張力マッピングと定量分析の両方のために、落射蛍光でタイムラプス動画またはエンドポイント画像を取得します。成功した表面は淡いピンク色でした。
表面の高品質は、クリーンな背景と反射干渉コントラスト顕微鏡またはRICMチャネル、およびCy3Bチャネルでの均一な蛍光強度で実証されました。テンションロックのタイムラプス画像は、TCR抗CD3イプシロンとTCR-ペプチド-MHCテンションシグナルの両方がヘアピンロックとシグナル蓄積のために増幅されていることを示しました。ロッキング鎖は、ゼロ分から始まるTCRペプチドMHCN4の短寿命の機械的引っ張りイベントを記録し、定量分析を容易にし、免疫シナプスのブルズアイパターンに似たTCRペプチドMHC力の明確なパターンを明らかにしました。
すべてのステップで、意図プローブ基板の準備には、細部への注意と材料の慎重な取り扱いが必要です。この技術により、細胞表面が環境と相互作用する際に発生する一過性の分子力、特に抗原を探す免疫細胞で発生する一過性の分子力を可視化することができます。
