このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いた若年マウスまたは成体マウス由来のミエリン化軸索中のニューロフィラメント集団の直接画像化を可能にし、単離された神経セグメントにおけるニューロフィラメント輸送の方向性および速度を測定することを可能にする。この方法は、目的のタンパク質の光活性化可能な蛍光融合を発現するマウスの入手可能性に依存するが、任意の容易に解剖された神経での使用に適合させることができる。まず、酸素化した生理食塩水を60ミリリットルのシリンジに注ぎ、注射器に残っている空気が最小限であることを確認します。
注射器をチューブに接続し、流出管を廃棄物フラスコに入れます。外側のガスケットを灌流室ハウジングに入れ、フローインレットと出口ポストがガスケットの穴に合っていることを確認し、内側のガスケットを1.5円形のカバースリップに置き、ガスケットのシワを慎重に滑らかにして密封を確保します。ペーパータオルの上にカバースリップとガスケットを置くか、ガスケットを上に向けてタスクワイプします。
大きな解剖はさみを使用して、脊椎の真ん中付近の皮膚に背部切開を行い、動物の腹側の側面を切り回し続けます。ゆっくりと筋肉から皮膚を引き離し、筋膜を切断します。次に、マイクロ切除ハサミを使用して、尾と膝の中間の太ももの筋肉を切開して坐骨神経を露出させます。
筋肉を通して見える神経が切れていないことを確認してください。切開を背部および腹通筋に伸ばして筋肉を取り除き、ふくらはぎの筋肉を取り除き、切り傷を浅く短くして神経にダメージを与えないようにします。脛骨神経が坐骨神経からかかとに分岐するポイントから完全に露出するまで筋肉を取り除き続けます。
脊椎近位端の脛骨神経を鉗子でつかみ、マイクロディセクザーで切り取り、神経にあまり緊張を加えないようにします。慎重に筋肉から離れて持ち上げ、神経に緊張を置かないように注意して、任意の添付ファイルをカットします。脛骨神経の背骨遠端を切り取り、室温酸素化生理食前の小さなペトリ皿に移します。
神経の近位端から始めて、露出した軸索の端を非常に細かい先端鉗子でそっとつかむ。鉗子の第二のペアで、近位の神経鞘をつかみ、ゆっくりと神経の遠位端に向かって引っ張り、このプロセス中に過度の緊張が加えられないようにする。神経の近位端をつかみ、ゆっくりとカバースリップの上に置き、穏やかな緊張の下でそれをまっすぐにします。
マイクロ水道管スライドを下に溝付きスライドで神経の上に置き、神経に平行な流れの方向を配置します。カバースリップとマイクロ水道アセンブリを裏返し、外側のガスケットに反対するスライドで灌流室ハウジングに置きます。拡散チャンバを固定するには、金属ハウジングに置き、ロックリングを回転させます。
生理食いのシリンジプランジャーをゆっくりと落ち込ませ、灌流チャンバーを満たします。インレットと出口チューブ、アウトレットフラスコ、シリンジを常に設定とイメージングの間、チャンバー自体の上に高く保ちます。拡散アセンブリを反転した顕微鏡ステージに移し、シリン注射器をシリンジポンプに取り付け、モーターを始動し、毎分0.25ミリリットルの流量に合わせて速度を調整します。
インライン溶液ヒーターを接続し、摂氏37度に設定します。目的のヒーターを接続し、摂氏37度に設定します。目的に油を適用し、ステージマウントに拡散チャンバーを挿入します。
チャンバーヒーターパッドにオイルを塗布し、それを灌流室に取り付け、それを接続し、摂氏37度に設定します。ステージアダプターに拡散チャンバーをロックし、チャンバーの下側のカバースリップに接触する目的油を持って来ます。明視野照明を使用して、カバースリップ表面に最も近い神経の底面の軸索の層に焦点を合わせます。
ミエリー化軸索は、コントラスト強化なしにブライトフィールド透過光照明の下で可視であるミエリンシースの存在によって識別することができる。ブライトフィールド参照画像を取得し、神経の方向性を記録し、488ナノメートルレーザーと光活性化可能なGFPに適した発光フィルタを使用して共焦点画像を取得します。レーザーパワーを通常の約5倍の撮像電力に設定し、3〜4分の露光時間で画像を取得し、次に別の共焦点像を取得して、漂白工程後の活性化前の自己蛍光を記録します。
明視野イメージの目的のアクティベーションウィンドウサイズと等しい長さで軸索に平行な線を描きます。この線をガイドとして使用して、軸索に対して垂直な視野をまたいで目的の矩形領域を描画します。405ナノメートル光でパターン励起することにより、この領域のGFP蛍光を活性化し、活性化の直前および直後に画像が取得されることを確認します。
アクティベーションが完了したら、1 分間のタイマーを開始します。それが消えたら、タイムラプスシリーズの取得を開始します。250ミリグラムのフルオレセインパウダーを0.5ミリリットルの二重蒸留水に加え、目に見える粒子がなくなるまで混ぜ、卓上遠心分離機で30秒間溶液を回転させて、未溶解の材料を沈下します。
8マイクロリットルのフルオレセイン溶液をスライドに加え、1.5個のカバースリップを適用します。余分な液体をブロットし、カバースリップをマニキュアで密封し、スライドを乾燥させます。スライドカバースリップを反転した顕微鏡ステージの下に置き、カバースリップの表面の蛍光の薄い面に焦点を合わせます。
スライドを動かして、気泡や大きなフルオレセイン粒子を含まない視野を見つけ、中央の画像が元のフォーカス平面になるように、0.2マイクロメートル間隔で6マイクロメートルにわたるZスタックを取得します。カメラのシャッターを含むすべてのライトパスシャッターを閉じ、レーザーパワーと露出時間をゼロ秒に設定します。これらの設定で 100 枚の画像のスタックを取得し、この値を平均して暗いフィールド イメージを生成します。
パルスエスケープとパルス拡散実験の代表的な画像をここに示します。パルスエスケープ法では、活性化領域の蛍光減衰運動学は、長期的および短期的な一時停止行動に関する情報を得ることができます。活性化領域は、これらの実験の略であることができます。
より長い活性化領域は、蛍光ニューロフィラメントのより大きなプールを提供するためにパルス拡散法に使用される。これは、隣接する領域の蛍光増加が直線的に残る時間を長くする。ここでは15マイクロメートルの横たわる窓が使用されています。
測定窓からの全蛍光を定量した。減衰は、オントラックニューロフィラメントの出発を表す初期指数崩壊と、オフトラックフィラメントの出発を表す10〜20分の2番目の遅い指数関数的減衰を持つパルスエスケープ法の二価性です。パルス拡散戦略では、移動の速度と方向の計算は、隣接するウィンドウの斜面にのみ依存します。
ここで使用するウィンドウ長の場合、線形フェーズは約 5 分間延長されます。ここに、解糖的に阻害された神経からのタイムラプスが示され、活性化領域からの輸送の明らかな減少を示す。実際、遠位斜面と近位斜面は、阻害剤で治療された神経において有意に低い。
これら2つの条件間の母集団速度の有意な減少もあります。このプロトコルを試みるとき、動物の犠牲に続いて神経の健康が低下するので、解剖およびチャンバーアセンブリ部分を急ぐことが重要であることを覚えておいてください。神経細胞培養は、個々の神経フィラメントの動きの測定と分析を可能にし、このプロトコルを使用して収集された人口規模のデータを補完する。
