私たちは、試薬についてトーマスLecuit（SQH-ユートロフィン:: GFPライン ）、ブルーミントンストックセンター、発達研究ハイブリドーマバンクに感謝したいと思います。我々はさらに、原稿の有用な議論や批判のためにゆっくり吹き続けるラボのすべてのメンバーに感謝します。国立科学財団MCB-1158527からの資金調達、および解剖学と細胞生物学部門の立ち上げ資金、アイオワ大学は、この作品を支持した。薬理学T32GM067795保健博士号を取得する前のトレーニンググラントの国立研究所は、AJSを支持した。データ·ストレージのサポートは研究資源のための国民の中心とグラントUL1RR024979した翻訳科学、国立衛生研究所を進めるためのナショナルセンターでサポートされているCTSAを通じて資金を供給されるICTS、提供された。

1。前段の分離にショウジョウバエの準備<ol><li>蒸留水90ミリリットルとドライイーストの50グラムを組み合わせることにより、ウェット酵母ペーストを作る。組み合わせるためのへらで混ぜる。混合物は一貫性を評価する前に、約30分間放置してみましょう。一貫性は、ハエのバイアルの側面に付着するのに十分なだけの厚さであるが、側面を下に実行しないでください。所望のコンシステンシーを達成するためには、さらに10 mlの水または乾燥酵母を少量まで追加することが必要であり得る。 4℃で覆われた容器に保管してください記憶された酵母は、約1〜2週間以内に使用することができる。 </li><li> &lt;希望の遺伝子型の24時間古い成虫ハエ（男女とも）を収集し、フライフードプラスバイアルの側面に塗抹湿った酵母ペーストをバイアルに入れます。ハエが維持される温度は、実験に依存して変化する。ルーチンの実験のために、ハエは室温で維持される。一方、遺伝子がある、実験UAS/GAL4系15は 、必要に応じて、25°C以上でハエを維持することが必要な場合があり使用して過剰発現されている。 </li><li> 2日間、毎日酵母ペーストの新鮮なスミアとハエを提供する。 NOTE：卵胞発育がしっかり雌ハエの栄養状態によって調節されるように、解剖の前に少なくとも36時間、栄養豊富な酵母ペーストでフライを提供することが不可欠である。 </li></ol> 2。隔離半ばから後半ショウジョウバエ卵胞の段階的<ol><li>メディアは、室温（約30分）に来ることができます。段階的な卵胞がインビトロ現像アッセイに使用する予定の場合は、新たにIVEM媒体（グレース昆虫培地、10％熱不活性化ウシ胎児血清、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン）を調製。上演包がmRNAまたはタンパク質の単離に使用する予定の場合はグレース昆虫やIVEMメディアのいずれかを使用します。重要：メディア温度が非常に重要です。メディアが冷えている場合は、変更されますアクチンと微小管細胞骨格とブロックの開発の両方。 </li><li> CO 2ガスを注入してyeastedバイアル内のハエを麻酔して、CO 2の下でフライパッドに3-5女性のハエを置く。重要：無菌性や死を引き起こす可能性があり、CO 2に長時間さらさようにその場パッド上の10分の時間帯で解剖することができるよりも多くの女性を放置しないでください。 </li><li> （黒いプレキシガラスのピースがうまく機能）メディアと9スポットプレートの1つのウェルを埋めると暗い面の上に置きます。井戸の底に解剖スコープを当てる。 </li><li> ＃5を使用して、デュモン鉗子は、（これは最高の利き手を使用して行われます）片手で独身女性を拾う。それは翼、脚、腹部への遷移胸部で女性をピックアップして、多くの場合、最も簡単です。よく満たされたメディアで女性を沈める。必要に応じて顕微鏡の焦点を調整します。 </li><li>非優位手で開催された鉗子の第二のペアを使用して、腹部の前端にメスをつかむ後方端部は、利き手（ 図2A）に向かって配置されるように。メディアに沈めフライを保つようにしてください。 </li><li>利き手で、2番目に人気の後部色素沈着したとき、セグメントのキューティクルをつかんで離し腹部（ 図2B-C）の残りの部分からそれをリッピングする鉗子を使用しています。 </li><li>卵巣が（図2D-E）を出てくるまで、利き手での鉗子を使用して、静かに腹部の前端を絞る。必要に応じて、2卵巣の間に鉗子を配置し、カーカスからそれらを引き出します。 </li><li>新鮮な培地（図2F）で新しいウェルに卵巣を移動したり、キムワイプまたは紙タオルに死骸を取り除くのどちらか。卵胞がインビトロ開発のために単離されている場合、これは特に重要である。 </li><li>卵巣の3-5ペアが分離されるまで繰り返します。注：各卵巣は〜16 ovariolesまたは連続して成熟卵胞の鎖から構成されている。各卵巣管筋鞘内に含まれる。 </li><li>ピン万力、それらに付属の針を使用して、静かにovarioles（ 図2G）との間に針を実行することで、卵巣を引き離す。これは時々だけでなく、個々の卵胞をリリースする予定です。 </li><li>個々のovariolesと卵胞発育の容易に区別形態学的な段階になりました（ 図2Gは 、卵巣を離れてからかった）表示されるはずです。 図1および異なる段階を区別するために使用することができる形態学的差異について2Hを参照してください。そのままovarioles内にあり、まだ筋肉のシース内に含まれる卵胞を単離するために、前の卵胞の前で、すぐに関心のある毛包を次卵胞の後で卵巣管を横切る針を使用しています。これは筋肉の鞘を破壊すると離れて興味のある卵胞は今それを損傷することなく、隣接する卵胞から離れて切断することができる。 </li&gt; <li>個々の段階が分離されているように、新鮮な培地で新しいウェルに、ガラスピペットを使用して、関心のある毛包を移動します。 in vitroでの開発のための卵胞を分離する場合に特に重要です。注：これはよく全体に関心のある毛包を再配布から気泡を防止するために、メディアに入る前に、ピペット球を絞ることが重要です。卵胞はガラスピペットに付着している場合に加え、ピペットを数回上下にBSA溶液をピペッティングし、解剖培地で洗浄することによって、3％ウシ血清アルブミン（BSA）でプレコートすることができる。 </li><li>十分な卵胞が単離されたら、その後の実験を進める。 </li></ol> S10B包の3。 インビトロ開発<ol><li> IVEMメディアステージ単離プロトコール（ステップ2）を使用して、S10B包を隔離する。卵胞が急速に離れて破片から移動していることを確認してください。これらの卵胞が成熟していきますように、それはIMPOですS10Bsは30〜60分のために収集した後、選択した成熟培地中に配置されていることをrtant。注：S10BはS10A包がIVEM培養培地中で成熟していないよう慎重に、（1Bと比較した図1C）S10A包とは区別する必要がある。 S10A及びS10B包の両方で、長さの半分を、ナース細胞から構成され、他の半分は卵母細胞であるが、S10Bにおいて卵胞の長さはS14包のと同じである。 </li><li>ガラスピペットを用いて、24ウェル組織培養プレートのウェルに30〜S10B包を移動させる。注：転送中の卵胞がすべてS10Bで、S11に成熟していないことを確認してください。 </li><li>ウェルあたり成熟メディアの1μL、 すなわち IVEMメディアプラス理学的試薬を準備します。 </li><li>プルガラスピペットを使用すると、*、可能な限り十分に（ステップ3.2）から、できるだけ多くのメディアを削除し、すぐに選択の成熟メディアを追加。注：プルガラスPIPを使用することが不可欠である段階的な卵胞としてディスケットを簡単にピペットマンでガラスピペットまたはピペットチップのいずれかで、最大撮影することができます。 *プルピペットを作成するには：1）ガラスが軟化し始めるちょうどまで、ブンゼンバーナーの炎で長い、ガラスピペットの薄い部分を加熱し、2）すぐにフレームの外にピペットを移動し、ピペットを描画するために水平に引っ張る清澄管; 3）細かい点を生成するために分割します。注意：ガラスの破片が飛んで可能性がある目の保護を使用してください。 </li><li>実験が必要と繰り返して、できるだけ多くのウェルについて3.1から3.4を繰り返します。 </li><li>卵胞が&gt; 10時間開発し、解剖顕微鏡下で発達の進行を獲得することができます。注：実験は通常、卵胞が発達するのに十分な時間を確保するために、次の日採点する。 S10Bが約5時間である、S11が約30分で、S12が〜2時間であり、S13が室温で25℃、1と発展を持続時間は約1時間である少し時間がかかります。 S10B包のために記載したのと同様の実験をすることができるS11-S13包を用いて行った。 </li></ol> 4。ライブイメージングのための段階の分離<ol><li>すぐに離れ破片から卵胞を移動IVEM媒体にステージ単離プロトコール（ステップ2）を用いて、選択した蛍光マーカーを発現する後期卵胞（S10B-14）を単離する。 </li><li>新しいメディアに関心のある毛包を移動し、カバーガラス底ペトリ皿にガラスピペットで移す。それはカバースリップ下の領域にバブルアップが、こぼれないようにメディアを追加するように注意してください。 </li><li>より長い時間経過映画のために、ペトリ皿の内側縁部に、水で湿らせたキムワイプ巻き上げを加えることによってペトリ皿内の湿度を維持することが必要な場合がある。上部の蓋を置きます。 </li><li>倒立顕微鏡の画像。詳細な解像度は、共焦点顕微鏡が必要になります。これは、撮像、照明の強さ、および撮像の長さの周波数をバランスさせる必要があり、これは、各々独立してlのために解決される必要がありますabelingツールや発達過程。 </li></ol> 5。 mRNAの準備のための段階の分離<ol><li>グレースやIVEMメディアのいずれかで、ステージ単離プロトコール（ステップ2）を使用して、個々の段階の卵胞を分離します。 </li><li>ガラスピペットを使用して、メディアを含む新しいウェルに関心のある個々のステージを移動させ、それは、一度に複数のステージを回収することができる。 </li><li> 1時間の下で収集時間を保つ。 1.5mlマイクロチューブに、ガラスピペットを使用して、卵胞を移動します。 </li><li>卵胞のすべてをペレットにしたミニ微量チューブを軽くスピン。引っ張られたガラスピペットを用いて（ステップ3.4参照）を慎重にすべてのメディアを削除します。注：フルサイズのマイクロを使用している場合は、低速での卵胞をスピンダウン。 </li><li>トリゾールの100μl加え、プラスチック乳棒を用いて約20秒間、手で挽く。微量フルスピードでスピンダウンし、任意のペレット化Dを乱さないように注意しながら、新しい1.5mlマイクロチューブにトリゾールを移動ebris。 -80℃で保存</li><li>十分な卵胞が実験のために得られるまで繰り返して5.1から5.5を繰り返します。日常、〜75 S10B、〜75、S12、およびS14〜100の卵胞は、RNAの〜10μgのをもたらす。 </li><li>サンプルを氷上で解凍する。 1マイクロチューブに、必要に応じて、サンプルを結合し、800μLまでトリゾール容積を。製造業者の指示通りにRNAの単離を進める。重要：RNaseを含まないDNA分解酵素で単離されたRNAを扱うDNA分解酵素を忘れないでください。 </li></ol> 6。ウェスタンブロッティングのための段階の分離<ol><li> 100℃に加熱ブロックを予熱</li><li>グレースやIVEMメディアのいずれかで、ステージ単離プロトコール（ステップ2）を使用して、個々の段階の卵胞を分離します。注：それは経験的に、それぞれ特定のタンパク質を観察するために必要とされているどのように多くの特定の段階包の決定する必要がある。高度に発現されたタンパク質については1-3 S10B包/ウェルは、ウェスタンブロットに強いシグナルを参照するのに十分である。しかし、それは確認することが重要です代表的なサンプルは、複数の雌から卵胞を取る。したがって、特定の段階の15〜20は、通常、卵胞収集される。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブに、ガラスピペットを使用して、卵胞を移動します。 （ステップ5.4参照）卵胞をペレットにしたミニ微量で簡単にスピン。慎重に引っ張っガラスピペットを使用してメディアをすべて削除する（ステップ3.4を参照）、1×50μlのPBSと2Xレムリ緩衝液50μlを加える。 </li><li>プラスチック乳棒で〜20秒間手で挽く。注：プラスチック乳棒を洗浄によって西部のサンプルを粉砕して、それらをオートクレーブに再利用することができます。 </li><li>ヒートブロック中で10分間サンプルを沸騰させる。 </li><li>微量での15秒間フルスピードで氷とスピンで簡単に冷やす。すぐに-20℃でのSDS-PAGEゲルまたはストアにロードのどちらか注：サンプルが保存されている場合は、ゲルにロードする前にサンプルを再沸騰することを忘れないでください。 </li><li>標準プロトコルに従ってウェスタンブロット解析を行う。 </li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Bianco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+modes+of+guidance+signalling+during+collective+migration+of+border+cells.">Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells.</a> Nature. 448, 362-365 (2007).</li><li>Brand, A. 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L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+eggshell+production:+identification+of+new+genes+and+coordination+by+Pxt.">Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt.</a> PLoS. One. 6, e19943 (2011).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li></ol>

開示することは何もありません。

ショウジョウバエの卵胞は形態学的および分子解析の両方に最適です、細胞種の数が少ないから構成されている。さらに、卵巣の構造に起因し、それは一般的な解剖範囲および最小のトレーニングで卵胞発育の特定の段階を大量に得ることは比較的容易である。各ステージは短い時間窓を表すように、ステージの分離は、そのステージ中に発生する発生過程に重要な分子の洞察を提供...

各ショウジョウバエ卵巣は〜16 ovarioles、または連続して卵室や卵胞を成熟の鎖から構成されている。各卵胞が単一の卵母細胞、15生殖系列に由来する看護師やサポート細胞、および濾胞細胞（ 図1A）と呼ばれる〜650体細胞で構成されている。 ショウジョウバエの卵形成は、開発1の14形態学的に定義されている段階に分けられる。卵胞の各発達段階は、それが比較的容易段階特異卵胞の実質的な数を単離すること、単一のフライ内で何度も観察される。 卵形成（ステージ10B-14）の半ばから後半のステージは、ステージの分離（ 図1）に特に適している。ステージ10B（S10B）では、毛包が完全に伸長される（ すなわち、その長さは、ステージ14のそれと等しい（S14）卵胞、 図1と図2Hを参照）、卵胞の半分の長さは、ナース細胞から構成されている他の半分は、卵母細胞（ 図1C）であり、一方。この段階では、看護師の細胞は、皮質アクチンを強化し、アクチンフィラメント2の並列バンドルを生成し、劇的なアクチンリモデリングを受ける。同時に、毛包細胞の集団は、求心性細胞と呼ばれる、背側付属物を形成するために、移行を受けるために指定なっナース細胞および卵母細胞および卵胞セルの2つの背側基との間で移行する、胚、3管状の呼吸装置。それは胚発生（ 図1D）を完了するために必要な要因と卵母細胞を提供し、看護師のセルはダンプと呼ばれるプロセスに卵母細胞にそれらの細胞質の内容を絞るナース細胞その後契約（S11）。ナース細胞は、次いで、細胞死（S12-S13）4を受け、卵胞細胞が卵殻5（ 図1E-G）を分泌し、パターン。このように、卵形成の終わりには、重要な発達ANと豊富であるD形態形成のプロセス。 単離された半ばから後期の卵胞（S10B-S14）は、分子分析など、さまざまな目的に使用することができる。例えば、段階的な卵胞からのmRNAは、RT-PCR、マイクロアレイのために単離することができ、又はRNA-seqの分析。これは1が存在する少数の細胞型と、短い発達ウィンドウ内の遺伝子発現を調べ、遺伝子発現を薬理学的または遺伝のどちらかの摂動によってどのように変化するかを決定することができます。ステージの分離もウェスタンブロッティングによってタンパク質を調べるために使用することができます。それは一つの特定の段階での突然変異体対野生型タンパク質の発現レベルを定量することを可能にするので、そのような分析は重要である。一つは免疫蛍光は、同様の結果を達成するために分析を使用できるが、蛍光の定量化は、全ての画素が検出6の線形範囲内である厳密な要件によりロバストである。さらに、ウェスタンブロット分析は、他の情報を提供することができるようなSタンパク質が翻訳後修飾されているか、特定のスプライスアイ​​ソフォームから発現されている場合。単離されたステージはまた、細胞下分画または免疫沈降を含むさらなるタンパク質精製のために使用することができる。 段階特異的な卵胞の分離はまた、 インビトロのアッセイの開発7および8ライブイメージングのために使用することができる。孤立S10B-S13包（下記参照）の単純な培養培地中で、S14に開発していきます。これは、S10A包が看護セルは、この原稿で説明した培養条件を使用してダンプを経て進行しないことに注意することは重要である。我々はリードアウト7,9として看護師電池投棄や開発を使用することにより、アクチンリモデリングを調節する上で、両方の薬理学的および遺伝学的に、プロスタグランジンの役割を定義するためにS10B のin vitroアッセイの開発を使用している。同様に、発達の後期段階はまた、薬理学的治療または遺伝子人間の効果を決定するために、単離することができるこのような求心細胞移動、背側付属器の移行/形成10、看護師の細胞死のような特定のプロセスに関するipulations。このようなアッセイは、支配的な相互作用スクリーニングまたはアッセイを実行するために使用することができ、例えば、単独でPXTにおける突然変異のためにヘテロ接合性またはファシンは S10B インビトロ発達に影響を及ぼさないが、二重ヘテロ接合展示看護欠陥をダンプ細胞および現像9のブロックからの卵胞。 S10B-13培養で開発することができるので、さらに、この時間の間に発生するすべてのプロセスは、ライブイメージングによって観察することができる。そのような画像は、透過光（一方は形態の総変化にのみ関心がある場合）またはライブ画像形成色素で染色し、蛍光プローブ又は卵胞を発現するトランスジェニックハエを用いて共焦点顕微鏡とを使用して簡単に行うことができる。ライブイメージングは​​、実質的に発達過程の理解を進めるために使用されている。実際、ライブイマジン後期包のGは、背側付属器の移行、細管形成10の例の知識を拡大してきました。私たちは、看護師細胞中のアクチン動態を含む追加の後期過程のライブイメージング、ダンピングは、これらの発生事象に新たな洞察を提供することを期待しています。それは、S10Aと卵胞の発達の初期段階は、文化の中で、S14へと発展していきませんが、開発のそれらのステージ中に発生するイベントのライブイメージング（詳細のための議論を参照して、代替の培養条件を11から14を使用して可能であることに注意することが重要です情報）。 ここでは、in vitroでの開発やライブ映像、または分子解析（mRNAおよびタンパク質の分離）のいずれかのために後期包を単離するための詳細なプロトコルを提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

ショウジョウバエの卵形成または卵胞の発達が広く複雑な発達および細胞生物学的過程の理解を進めるために使用されている。この方法は紙は半ばから後期の卵胞（ステージ10B-14）を単離及び発達時間のタイトな窓の間に発生する分子および形態学的事象に新たな洞察を提供するために、それらを利用する方法について説明します。単離された毛包は、in vitroアッセイを開発、ライブイメージング、mRNA発現解析およびタンパク質のウェスタンブロット分析を含む実験技術、様々に使用することができる。卵胞期10B（S10B）で以降は文化の中で、開発を完了し、これは1、開発の特定の期間中に発生したプロセスに対するそのような操作の影響を定義するためのin vitro開発に遺伝的または薬理学的摂動を組み合わせることができます。これらの卵胞は文化の中で発展されるためさらに、それらは、理想的にライブイメージング研究に適しています、多くの場合、形態学的事象を仲介する新しいメカニズムを明らかにした。単離された毛包はまた、分子分析のために使用することができる。例えば、遺伝子の摂動から生じる遺伝子発現の変化は、特定の発達のウィンドウのために定義することができる。さらに、タンパク質レベル、安定性、および/または卵胞発育の特定の段階の間に翻訳後修飾の状態は、ウェスタンブロット解析を介して検査することができる。このように、 ショウジョウバエ包の段階特異的分離は、開発と形態形成の広く保存プロセスに豊富な情報源を提供しています。

ショウジョウバエの卵胞発育の特定の段階を単離する場合、それは正確に異なる形態学的段階を区別することができることが不可欠である。ナース細胞と卵母細胞は、これらの各段階で卵胞の長さの半分を占めるので、これは（1Cと比較した図1B）、S10AおよびS10Bのためやや困難である。 S10B包が完全に細長い、S14の包（1Gと比べて図1C）</stron...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

半ばから後半ショウジョウバエ濾胞の段階特異的分離は、様々な目的に有用である。このような卵胞は、in vitroの開発アッセイとライブイメージングと結合される遺伝的および/ ​​または薬理学的な操作を可能にする、文化の中で開発しています。さらに、毛包には、mRNAおよびタンパク質を単離するなどの分子的研究のために使用することができる。

ステージ固有の半ばから後半のユーティリティ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵胞の分離

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K ビュー.  University of Iowa Carver College of Medicine. 半ばから後半ショウジョウバエ濾胞の段階特異的分離は、様々な目的に有用である。このような卵胞は、in vitroの開発アッセイとライブイメージングと結合される遺伝的および/ ​​または薬理学的な操作を可能にする、文化の中で開発しています。さらに、毛包には、mRNAおよびタンパク質を単離するなどの分子的研究のために使用すること...

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Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

ex vivoでのウイルス形質導入を用いた毛包におけるGFPの標的発現

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

生物学

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

の単離と精製ショウジョウバエ</em磁気ビーズソート別>末梢ニューロン

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

新生児肝外胆管細胞を単離する

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...