우리는 시약 토마스 Lecuit (SQH-Utrophin :: GFP 라인), 블루밍턴 증권 센터 및 발달 연구 브리 도마 은행에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원고의 도움이 토론과 비판에 대한 잡담 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 자금은 국립 과학 재단 MCB-1158527, 그리고 해부학 및 세포 생물학 부서에서 창업 자금, 아이오와의 대학은이 작업을 지원했다. 약리 과학 T32GM067795 건강 Predoctoral 교육 그랜트의 국립 연구소는 AJS을 지원했다. 데이터 스토리지 지원은 연구 자원을위한 국립 센터와 그랜트 UL1RR024979을 통해 번역 상 과학, 건강의 국립 연구소를, 전진을위한 국립 센터에서 지원하는 CTSA 재정 지원을 통해 ICTS에 의해 제공되었다.

1. 초파리는 이전에 격리 스테이지 준비 <ol><li> 증류수 90 ㎖의 활성 건조 효모 50 g의 결합에 의해 젖은 효모 붙여 넣기를합니다. 결합 주걱으로 섞는다. 혼합물이 일관성을 평가하기 전에 ~ 30 분 동안 서 보자. 일관성은 충분한 두께의 비행 병의 측면에 부착하지만 측면을 실행해야합니다. 원하는 일관성을 달성하기 위하여는 다시 10 ㎖의 물 또는 건조 효모의 작은 금액을 추가 할 필요가있다. 4 ° C.에 덮여 용기에 보관 저장 효모 ~ 1 ~ 2 주간 사용할 수 있습니다. </li><li> &lt;원하는 유전자형의 24 시간 이전 파리 성충 (남성과 여성 모두)을 수집하고 비행 음식 플러스 유리 병의 측면에 얼룩 져 젖은 효모 페이스트를 유리 병에 넣어. 해충이 유지되는 온도는 실험에 따라 달라질 것이다. 일상적인 실험에서, 파리, 실온에서 유지된다. 반면 유전자가되는 실험UAS/GAL4 시스템 (15)을 사용하여 과다 발현되는 것은 적절, 25 ° C 이상에서 파리를 유지해야 할 수 있습니다. </li><li> 2 일 동안 매일 효모 붙여 넣기의 신선한 얼룩과 파리를 제공합니다. 참고 : 난포의 개발은 밀접하게 여성 비행의 영양 상태에 의해 규제되기 때문에, 그것을 해부하기 전에 적어도 36 시간 동안 영양이 풍부한 효모 페이스트 비행을 제공하는 것이 필수적입니다. </li></ol> 2. 분리 중후반 초파리 여포에게 단계적 <ol><li> 미디어 실내 온도 (~ 30 분)에 올 수 있습니다. 단계적 모공이 체외 개발 분석으로 사용하는 경우, 갓 IVEM 미디어를 준비 (그레이스의 곤충 미디어, 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신). 단계적 모공의 mRNA 또는 단백질 분리 그레이스의 곤충 또는 IVEM 미디어 중 하나를 사용으로 사용하는 경우. 중요 : 미디어 온도​​가 중요합니다. 미디어가 추운 경우에는 변경합니다말라와 미세 소관 cytoskeletons 블록 개발 모두. </li><li> CO 2 가스를 주입하여 yeasted 유리 병에 파리를 마취 및 CO 2에서 비행 패드에 3-5 여성 파리를 놓습니다. 중요 : 플라이 패드에 10 분 시간에 해부 할 수있는 것보다 더 많은 여성을 두지 마십시오 CO 2에 대한 확장 된 노출로 발생할 수 있습니다 불임과 죽음. </li><li> 미디어 9 자리 플레이트 잘 하나를 입력하고 (블랙 플렉시 글라스의 조각이 잘 작동) 어두운 화면의 상단에 배치합니다. 우물의 바닥에 해부 범위에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 사용 # 5 뒤몽의 집게 (이가 가장 지배적 인 손을 사용하여 수행됩니다) 한 손으로 하나의 여성을 선택합니다. 그것은 날개, 다리, 또는 복부 전환에 흉부에 의해 여성을 선택하는 것이 가장 쉬운 방법입니다. 잘 못 미디어에서 여성의 잠수함. 필요에 따라 현미경의 초점을 조정합니다. </li><li> 잘 쓰지 손에 개최 포셉 번째 쌍을 사용하여, 복부의 전방 단부에 암형 잡아후방 단부는 지배적 인 손 (도 2a)을 향해 위치하도록. 미디어에 빠져들 비행을 유지해야합니다. </li><li> 지배적 인 손으로, 2 번째로 가장 뒤 착색 된 부분에 표피를 잡아 멀리 복부 (그림 2B-C)의 나머지 부분을 찢어 집게를 사용합니다. </li><li> 난소 (그림 2D-E)를 등장 할 때까지 지배적 인 손에 집게를 사용하여 부드럽게 복부의 앞쪽 끝을 짠다. 필요한 경우, 두 개의 난소 사이에 집게를 배치하고 시체에서 나오라고. </li><li> 신선한 미디어 (그림 2 층)과 새도에 난소를 이동하거나 킴 와이프 종이 타월에 시체를 제거 하나. 이것은 모낭이 체외 개발에 고립되는 경우에 특히 중요합니다. </li><li> 난소 ~ 5 쌍의 격리 될 때까지 반복합니다. 참고 : 각 난소는 16 ~ ovarioles 또는 순차적으로 성숙 난포의 사슬로 구성되어있다. 각 ovariole근육 칼집에 포함된다. </li><li> 핀 바이스 그들과 함께 제공되는 바늘을 사용하여 부드럽게 ovarioles (그림 2G) 사이의 바늘을 실행하여 난소를 분리 당깁니다. 이것은 때때로뿐만 아니라 개별 모낭을 발표 할 예정이다. </li><li> 개인 ovarioles 및 난포 발달의 쉽게 구별 형태 단계는 이제 볼 수 있습니다 (그림 2G 떨어져 조롱 난소)해야한다. 도 1 및 다른 단계를 구별하는 데 사용할 수있는 형태의 차이에 대한 2H 참조. 그대로 ovarioles 내에 여전히 근육 칼집에 포함 된 모낭을 분리, 바로 그 뿌리를 다음 위의 여포의 앞쪽에와 여포의 후방에 ovariole에 걸쳐 잘라 바늘을 사용합니다. 이 근육 칼집을 중단하고 멀리 관심의 뿌리는 지금에 손상을주지 않고 멀리 이웃 여포에서 절단 할 수 있습니다. </li&gt; <li> 각각의 단계가 분리되면, 새로운 미디어와 새로운 웰에 유리 피펫을 사용하여, 관심있는 여포를 이동합니다. 체외 개발을위한 모낭을 분리 할 때 특히 중요합니다. 참고 : 잘 전반에 걸쳐 관심의 모낭을 재분배 기포를 방지하기 위해 미디어를 입력하기 전에 피펫 전구를 짜내는 것이 중요합니다. 모낭은 유리 피펫을 고집하는 경우 또한, 피펫 상하 수회 BSA 용액을 피펫 팅하고 해부 미디어 린스하여 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 예비 코팅 될 수있다. </li><li> 충분히 모공이 고립되고 나면, 이후의 실험을 진행합니다. </li></ol> S10B 여포의 3. 체외 개발 <ol><li> IVEM 미디어에서 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 S10B 모낭을 분리합니다. 모공이 빠르게 떨어져 파편에서 이동되어 있는지 확인합니다. 이 난포가 성숙하는 것, 그것은의 impo입니다S10Bs이 30 ~ 60 분 동안 수집 한 다음 선택의 성숙 미디어에 배치되는 rtant. 참고 : S10B은 S10A 여포가 IVEM 문화 미디어 성숙하지 않으므로 신중하게, (1B에 비해 그림 1C) S10A 여포 구별 할 필요가있다. S10A 및 S10B 여포 모두에서, 길이의 절반은 널스 세포로 구성되고, 나머지 반은 난자이지만 S10B에서 모낭의 길이는 S14 여포 동일하다. </li><li> 유리 피펫을 이용하여 24 - 웰 조직 배양 플레이트로 잘 ~ 30 S10B 모낭을 이동. 참고 : 전송되는 모낭의 모든 S10B하고 S11 성숙되지 않았는지 확인해야합니다. </li><li> 즉 IVEM 미디어 플러스 약물 시약, 잘 당 성숙 매체의 1 μl를 준비합니다. </li><li> 뽑아 유리 피펫 *를 사용하여 가능한 한 잘 (단계 3.2)에서 많은 미디어를 제거하고, 신속하게 선택의 성숙 미디어를 추가 할 수 있습니다. 참고 :이 뽑아 유리 주사위를 사용하는 것이 필수적입니다무대 여포로 ETTE 쉽게 Pipetman 유리 피펫이나 피펫 팁 중 하나와 함께 촬영 할 수 있습니다. * 뽑아 피펫을 만들려면 : 1) 유리가 부드럽게 시작 바로 전까지 분젠 버너의 불꽃 긴 유리 피펫의 얇은 부분을 가열, 2) 즉시 불꽃 밖으로 피펫을 이동에 피펫을 그리는 수평으로 당겨 미세한 관 3) 좋은 점을 생성하는 휴식. 주의 : 유리의 파편이 날아 수 있으므로 보안경을 사용하십시오. </li><li> 실험이 필요로 반복 많은 우물에 3.1-3.4 단계를 반복합니다. </li><li> 모공&gt; 10 시간 동안 개발하고 해부 범위에 개발 진행을 득점 할 수 있습니다. 참고 : 실험은 일반적으로 모공이 개발을위한 충분한 시간을 허용하기 위해 다음 날 채점됩니다. S10B가 ~ 5 시간이며, S11은 ~ 30 분이며, S12은 1 ~ 2 시간이며, S13은 다소 시간이 오래 걸릴 것 실내 온도 25 ° C에서 1 개발의 기간에 ~ 1 시간입니다. S10B 여포에 대해 기재 한 것과 유사한 실험을 할 수있다S11-S13 여포를 사용하여 수행. </li></ol> 4. 라이브 이미징 단계 격리 <ol><li> 빨리 떨어져 이물질이 모공을 이동, IVEM 미디어에서 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 선택의 형광 마커를 발현하는 최종 단계의 난포 (S10B-14)를 분리합니다. </li><li> 새로운 미디어에 관심 여포를 이동 한 후 커버 슬립 바닥 페트리 접시에 유리 피펫으로 전송할 수 있습니다. 이 커버 슬립 바닥 면적에 거품 만에 유출되지 않도록 용지를 추가 할주의하십시오. </li><li> 더 이상 시간 경과 영화의 경우, 페트리 접시의 안쪽 가장자리에 물에 적신 올리고 킴 와이프를 추가하여 배양 접시 내에서 습도를 유지하기 위해 때때로 필요하다. 상단에 뚜껑을 놓습니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 이미지. 자세한 해상도는 공 초점 현미경이 필요합니다. 그것은 영상, 조명의 강도, 영상의 길이의 주파수를 균형을 필요가있다, 이것은 각각 독립적으로 L 위해 일해야합니다abeling 도구 및 개발 과정. </li></ol> 5. mRNA의 준비를위한 단계 격리 <ol><li> 그레이스의 또는 IVEM 매체 하나와 함께 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 각각의 단계 모낭을 분리합니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 미디어와 새로운 우물에 관심의 각 단계를 이동, 그것은 한 번에 여러 단계를 수집 할 수 있습니다. </li><li> 1 시간에서 수집 시간을 유지합니다. 1.5 ML의 microfuge 튜브에 유리 피펫을 사용하여 모공을 이동합니다. </li><li> 모공의 모든 펠렛 미니 마이크로 원심에서 간단히 튜브를 스핀. 뽑아 유리 피펫 (단계 3.4 참조)를 사용하여 조심스럽게 용지를 모두 제거합니다. 참고 : 전체 크기의 마이크로 원심을 사용하는 경우, 낮은 속도로 모공을 스핀 다운. </li><li> 트리 졸 100 μl를 추가하고 플라스틱 유를 사용하여 ~ 20 초 동안 손으로 갈기. 마이크로 원심의 전체 속도로 스핀 다운 및 펠렛 D를 방해하지 않도록주의하고 새로운 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 트리 졸 이동ebris. -80 ° C.에 저장 </li><li> 충분히 모공이 실험을 얻을 때까지 반복 5.1-5.5 단계를 반복합니다. 일상적 ~ 75 S10B은, ~ 75 S12 및 S14 ~ 100 여포는 RNA의 ~ 10 μg을 얻을 수 있습니다. </li><li> 얼음에 샘플을 해동. 한 미세 원심 분리 튜브에 적절하게 샘플을 배합하고 800 μL까지 트리 졸 볼륨을 가져온다. 제조업체의 지시에 따라 RNA 분리를 진행합니다. 중요 :의 RNase 무료 DNase의와 격리 된 RNA를 DNA 분해 효소 치료해야합니다. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅을위한 무대 격리 <ol><li> 100 ℃로 가열 블록을 예열 </li><li> 그레이스의 또는 IVEM 매체 하나와 함께 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 각각의 단계 모낭을 분리합니다. 참고 : 경험적으로 각각의 특정 단백질을 관찰하는 데 필요한 방법을 특정 단계 모낭의 수를 결정하는 것이 필요하다. 높은 발현 된 단백질의 경우도 1-3 S10B 여포 /는 서양 얼룩에 강한 신호를 볼 충분하다. 그러나, 확인하는 것이 중요합니다대표 예제, 다수의 여성에서 난포를 복용. 따라서, 특정 단계의 15-20 모공은 일반적으로 수집됩니다. </li><li> 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 유리 피펫을 사용하여 모공을 이동합니다. (단계 5.4 참조) 모공 펠렛 미니 마이크로 원심에서 간단히 스핀. 조심스럽게 (단계 3.4 참조) 뽑아 유리 피펫을 사용하여 용지를 모두 제거하고 1X PBS 50 μL와 배 램리 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 플라스틱 유 봉 20 초 ~에 손으로 갈기. 참고 : 플라스틱 방앗 공이 세탁물에 따라 서부 샘플을 연마하고 압력 가마로 소독을 위해 재사용 될 수있다. </li><li> 열 블록에 10 분 동안 샘플을 끓인다. </li><li> 마이크로 원심에서 15 초 동안 전체 속도로 얼음과 스핀에 간단히 풀어. 즉시 -20 ℃에서 SDS-PAGE 젤 또는 상점에로드 하나 참고 : 샘플이 저장되어있는 경우, 젤에로드하기 전에 샘플을 재비 기억. </li><li> 표준 프로토콜을 다음과 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. </li></ol>

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공개 아무것도 없다.

초파리의 뿌리는 형태 학적 및 분자 분석 모두에 이상적, 세포 유형의 작은 숫자로 구성되어 있습니다. 한층 인해 난소의 구조, 평범한 해부 범위 및 최소한의 교육 난포 개발의 특정 단계를 다수 구하는 것이 상대적으로 쉽다. 각 단계는 짧은 시간 창을 나타내는 바와 같이, 단 분리는 그 단계에서 발생하는 발달 과정에 중요한 분자 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 S10B, S12...

각 초파리의 난소는 16 ovarioles, 또는 순차적으로 성숙 계란 챔버 또는 여포의 체인 ~로 구성되어있다. 각각의 뿌리가 하나의 난자, 15 세균 라인 파생 간호사 또는 지원 세포, 모낭 세포 (그림 1A)라고 ~ 650 체세포로 구성되어있다. 초파리의 난자가 개발 한 14 형태 학적으로 정의 된 단계로 나누어 져 있습니다. 난포 전개의 각 단계는 비교적 쉽게 스테이지 특정 모낭의 상당수를 분리하게, 단일 플라이 내에 여러 번 관찰된다. 난자 (10B-14 스테이지)의 중후반 단계 (그림 1) 단계의 분리에 특히 적합하다. 단계 10B (S10B)에서, 모낭 완전히 (즉, 그 길이가 14 단계 (S14) 모낭과 동일하다,도 1 및도 2H를 참조)으로 연장되고 모낭의 절반 길이는 널스 세포로 구성된다나머지 절반은 난자 (그림 1C) 동안. 이 단계에서 간호사 세포는 대뇌 피질의 액틴을 강화하고 액틴 필라멘트 2의 병렬 번들을 생성, 극적인 말라 리모델링을 받고있다. 동시에, 모낭 세포의 인구는 간호사 세포와 난자 사이에 마이그레이션, 구심 세포라고하고, 모낭 세포의 두 지느러미 그룹 등의 부속 기관, 배아 3 관 호흡 장치를 형성하기 위해 마이그레이션을 받아야 지정된 될 . 간호사가 배아 (그림 1D)를 완료하는 데 필요한 요인으로 난자를 제공 간호사 전지 덤핑라는 과정에서 난자에 자신의 세포질 내용을 짜내는 다음 계약 (S11), 세포. 간호사 세포는 세포 사멸 (S12-S13) 4를 받아야하고, 여포 세포는 달걀 껍질 5 (그림 1E-G)를 분비 및 패턴입니다. 따라서 난자의 끝이 중요한 발달이 풍부합니다D 형태 형성 과정. 격리 중후반 스테이지 여포 (S10B-S14)는 분자 분석 등 다양한 목적을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 단계적 모낭으로부터의 mRNA를 RT-PCR, 마이크로 어레이에 대해 분리 될 수 있고, 또는-RNA 서열 분석. 이것은 하나의 존재 단지 몇 종류의 세포로, 짧은 개발 윈도우 내에서 유전자 발현을보고, 유전자 발현이 약물이나 유전자 중 하나 섭동에 의해 변경하는 방법을 확인할 수 있습니다. 단 분리는 웨스턴 블로 팅에 의해 단백질을보고하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 하나의 특정 단계에서 돌연변이 대 야생형 단백질의 발현 수준을 정량 할 수 있기 때문에 이러한 분석은 중요하다. 하나를 사용할 수 있지만 면역 형광 정량 인해 모든 화소가 검출 6의 선형 범위 내에 엄격한 요구에 덜 견고, 비슷한 결과를 얻을 분석한다. 또한, 웨스턴 블롯 분석은 다른 정보를 제공 할 수있다 이러한발 단백질 posttranslationally 개질되거나 특정 스플 라이스 이소로부터 발현되는 경우. 격리 단계는 세포 이하 분획 또는 coimmunoprecipitation 포함한 상기 단백질 정제를 위해 사용될 수있다. 스테이지 별 모낭 분리는 체외 개발 분석 7과 라이브 영상 8 사용할 수 있습니다. 고립 된 S10B-S13 여포 (아래 참조) 간단한 배지에 S14을 개발하는 것입니다. 그것은 S10A 모낭이 원고에서 논의 된 배양 조건을 사용하여 덤핑 간호사 셀을 진행하지 않을 것을주의하는 것이 중요합니다. 우리는 읽기 아웃 7,9로 간호사 덤핑 세포 및 개발을 사용하여 말라 리모델링을 조절하는 두 약리학 적 및 유전, 프로스타글란딘의 역할을 정의 할 수 S10B 체외 개발 분석을 사용했다. 마찬가지로, 개발 후기 단계는 약물 치료 또는 유전자 남자의 효과를 결정하기 위하여 분리 될 수있다이러한 구심 세포 이동, 등의 부속기 마이그레이션 / 대형 10, 간호사 세포의 죽음과 같은 특정 프로세스에 대한 ipulations. 이러한 분석이 지배적 인 상호 작용 화면이나 분석을 수행 할 수 있습니다, 예를 들어, PXT 또는 fascin 혼자 돌연변이 이형은 S10B 체외 발달에 영향을주지하면서, 이중 이형 전시 간호사 세포 결함 및 개발 9 블록을 덤프에서 난포. S10B-13 배양에서 발전 할 수 있기 때문에 또한,이 시간 동안 발생하는 모든 프로세스는 실시간 이미징에 의해 관찰 될 수있다. 이러한 영상은 단순히 형광 프로브 또는 라이브 영상 염료로 염색 모공을 표현 형질 전환 초파리를 사용하여 (한 형태의 심한 변화에만 관심이있는 경우) 투과광을 사용하거나 공 초점 현미경을 수행 할 수 있습니다. 라이브 영상은 실질적으로 발달 과정에 대한 우리의 이해를 사전에 사용하고 있습니다. 실제로, 걸 보면 라이브말기 여포의 G는 등의 부속기 이주의 지식, 세뇨관 (10)의 예를 확장했다. 우리는 투기 간호사 셀 동안 말라 역학 등의 추가 최종 단계 프로세스의 라이브 영상이 발달 이벤트에 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 기대합니다. 그것은 S10A 및 난포 발달의 초기 단계는 문화 S14에 개발을 계속하는 것은 아니지만 개발하는 단계에서 발생하는 이벤트의 라이브 영상은 (이상 설명을 참조 다른 배양 조건에게 11 ~ 14를 사용 할 수 있습니다하는 것이 중요합니다 정보). 여기에서 우리는 하나의 생체 개발을위한 최종 단계 모낭 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 라이브 영상, 또는 분자 분석 (mRNA와 단백질 격리).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

초파리의 난자 또는 난포 발달 널리 복잡한 발달 및 세포 생물학 프로세스의 이해를 사전에 이용되고있다. 이 방법 종이 중후반 단계 여포 (단계 10B-14)를 분리하고 개발 시간을 꽉 창 중에 발생하는 분자 형태 학적 이벤트에 새로운 통찰력을 제공하기 위해이를 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 격리 모낭 체외 개발 분석법, 라이브 영상, mRNA 발현 분석 및 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 포함한 실험 기법의 다양한 위해 사용될 수있다. 단계 (b) (S10B)에서 이상 모공 문화 개발을 완료 할 것이다, 이것은 하나의 개발의 특정 기간 동안 발생하는 과정에서 이러한 조작의 효과를 정의하기 위해 체외 개발 유전 약리학 적 교란을 결합 할 수 있습니다. 이러한 모공은 문화 발전하기 때문에 또한, 그들은 이상적으로 라이브 영상 연구에 적합종종 형태 학적 사건을 중재 새로운 메커니즘을 공개한다. 격리 여포 또한 분자 분석을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 유전 섭동 인한 유전자 발현의 변화는 특정 발달 윈도우에 대해 정의 될 수있다. 또한, 소낭 개발 특정 단계 동안 단백질 수준, 안정성 및 / 또는 번역 후 변형 상태는 웨스턴 블롯 분석을 통해 검사 할 수있다. 따라서, 초파리 여포의 단계 별 분리 개발 및 형태 형성의 널리 보존 프로세스에 풍부한 정보를 제공한다.

초파리 여포 개발의 특정 단계를 분리 할 때 정확하게 상이한 형태 학적 단계를 구별 할 수있을 것이 필수적이다. 간호사 세포와 난자 각 (그림 1B는 1C에 비해)이 단계에서 뿌리 길이의 반을 차지로이, S10A 및 S10B에 대한 다소 도전이다. S10B 모낭이 완전히 신장 및 S14 여포 (1G에 비해 그림 1C)에 길이에 따라서 동일 그러나, S10A 여포는, S10B 여포보다 길이가...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K 조회수.  University of Iowa Carver College of Medicine.  중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다. 

비디오: The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

예 VIVO 바이러스성 전달을 사용하여 헤어 대과에 GFP 타겟팅 표현

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

연구

생물학

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

에 잔 심장을 떠올리 Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...