우리는 시약 토마스 Lecuit (SQH-Utrophin :: GFP 라인), 블루밍턴 증권 센터 및 발달 연구 브리 도마 은행에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원고의 도움이 토론과 비판에 대한 잡담 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 자금은 국립 과학 재단 MCB-1158527, 그리고 해부학 및 세포 생물학 부서에서 창업 자금, 아이오와의 대학은이 작업을 지원했다. 약리 과학 T32GM067795 건강 Predoctoral 교육 그랜트의 국립 연구소는 AJS을 지원했다. 데이터 스토리지 지원은 연구 자원을위한 국립 센터와 그랜트 UL1RR024979을 통해 번역 상 과학, 건강의 국립 연구소를, 전진을위한 국립 센터에서 지원하는 CTSA 재정 지원을 통해 ICTS에 의해 제공되었다.

1. 초파리는 이전에 격리 스테이지 준비 <ol><li> 증류수 90 ㎖의 활성 건조 효모 50 g의 결합에 의해 젖은 효모 붙여 넣기를합니다. 결합 주걱으로 섞는다. 혼합물이 일관성을 평가하기 전에 ~ 30 분 동안 서 보자. 일관성은 충분한 두께의 비행 병의 측면에 부착하지만 측면을 실행해야합니다. 원하는 일관성을 달성하기 위하여는 다시 10 ㎖의 물 또는 건조 효모의 작은 금액을 추가 할 필요가있다. 4 ° C.에 덮여 용기에 보관 저장 효모 ~ 1 ~ 2 주간 사용할 수 있습니다. </li><li> &lt;원하는 유전자형의 24 시간 이전 파리 성충 (남성과 여성 모두)을 수집하고 비행 음식 플러스 유리 병의 측면에 얼룩 져 젖은 효모 페이스트를 유리 병에 넣어. 해충이 유지되는 온도는 실험에 따라 달라질 것이다. 일상적인 실험에서, 파리, 실온에서 유지된다. 반면 유전자가되는 실험UAS/GAL4 시스템 (15)을 사용하여 과다 발현되는 것은 적절, 25 ° C 이상에서 파리를 유지해야 할 수 있습니다. </li><li> 2 일 동안 매일 효모 붙여 넣기의 신선한 얼룩과 파리를 제공합니다. 참고 : 난포의 개발은 밀접하게 여성 비행의 영양 상태에 의해 규제되기 때문에, 그것을 해부하기 전에 적어도 36 시간 동안 영양이 풍부한 효모 페이스트 비행을 제공하는 것이 필수적입니다. </li></ol> 2. 분리 중후반 초파리 여포에게 단계적 <ol><li> 미디어 실내 온도 (~ 30 분)에 올 수 있습니다. 단계적 모공이 체외 개발 분석으로 사용하는 경우, 갓 IVEM 미디어를 준비 (그레이스의 곤충 미디어, 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신). 단계적 모공의 mRNA 또는 단백질 분리 그레이스의 곤충 또는 IVEM 미디어 중 하나를 사용으로 사용하는 경우. 중요 : 미디어 온도​​가 중요합니다. 미디어가 추운 경우에는 변경합니다말라와 미세 소관 cytoskeletons 블록 개발 모두. </li><li> CO 2 가스를 주입하여 yeasted 유리 병에 파리를 마취 및 CO 2에서 비행 패드에 3-5 여성 파리를 놓습니다. 중요 : 플라이 패드에 10 분 시간에 해부 할 수있는 것보다 더 많은 여성을 두지 마십시오 CO 2에 대한 확장 된 노출로 발생할 수 있습니다 불임과 죽음. </li><li> 미디어 9 자리 플레이트 잘 하나를 입력하고 (블랙 플렉시 글라스의 조각이 잘 작동) 어두운 화면의 상단에 배치합니다. 우물의 바닥에 해부 범위에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 사용 # 5 뒤몽의 집게 (이가 가장 지배적 인 손을 사용하여 수행됩니다) 한 손으로 하나의 여성을 선택합니다. 그것은 날개, 다리, 또는 복부 전환에 흉부에 의해 여성을 선택하는 것이 가장 쉬운 방법입니다. 잘 못 미디어에서 여성의 잠수함. 필요에 따라 현미경의 초점을 조정합니다. </li><li> 잘 쓰지 손에 개최 포셉 번째 쌍을 사용하여, 복부의 전방 단부에 암형 잡아후방 단부는 지배적 인 손 (도 2a)을 향해 위치하도록. 미디어에 빠져들 비행을 유지해야합니다. </li><li> 지배적 인 손으로, 2 번째로 가장 뒤 착색 된 부분에 표피를 잡아 멀리 복부 (그림 2B-C)의 나머지 부분을 찢어 집게를 사용합니다. </li><li> 난소 (그림 2D-E)를 등장 할 때까지 지배적 인 손에 집게를 사용하여 부드럽게 복부의 앞쪽 끝을 짠다. 필요한 경우, 두 개의 난소 사이에 집게를 배치하고 시체에서 나오라고. </li><li> 신선한 미디어 (그림 2 층)과 새도에 난소를 이동하거나 킴 와이프 종이 타월에 시체를 제거 하나. 이것은 모낭이 체외 개발에 고립되는 경우에 특히 중요합니다. </li><li> 난소 ~ 5 쌍의 격리 될 때까지 반복합니다. 참고 : 각 난소는 16 ~ ovarioles 또는 순차적으로 성숙 난포의 사슬로 구성되어있다. 각 ovariole근육 칼집에 포함된다. </li><li> 핀 바이스 그들과 함께 제공되는 바늘을 사용하여 부드럽게 ovarioles (그림 2G) 사이의 바늘을 실행하여 난소를 분리 당깁니다. 이것은 때때로뿐만 아니라 개별 모낭을 발표 할 예정이다. </li><li> 개인 ovarioles 및 난포 발달의 쉽게 구별 형태 단계는 이제 볼 수 있습니다 (그림 2G 떨어져 조롱 난소)해야한다. 도 1 및 다른 단계를 구별하는 데 사용할 수있는 형태의 차이에 대한 2H 참조. 그대로 ovarioles 내에 여전히 근육 칼집에 포함 된 모낭을 분리, 바로 그 뿌리를 다음 위의 여포의 앞쪽에와 여포의 후방에 ovariole에 걸쳐 잘라 바늘을 사용합니다. 이 근육 칼집을 중단하고 멀리 관심의 뿌리는 지금에 손상을주지 않고 멀리 이웃 여포에서 절단 할 수 있습니다. </li&gt; <li> 각각의 단계가 분리되면, 새로운 미디어와 새로운 웰에 유리 피펫을 사용하여, 관심있는 여포를 이동합니다. 체외 개발을위한 모낭을 분리 할 때 특히 중요합니다. 참고 : 잘 전반에 걸쳐 관심의 모낭을 재분배 기포를 방지하기 위해 미디어를 입력하기 전에 피펫 전구를 짜내는 것이 중요합니다. 모낭은 유리 피펫을 고집하는 경우 또한, 피펫 상하 수회 BSA 용액을 피펫 팅하고 해부 미디어 린스하여 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 예비 코팅 될 수있다. </li><li> 충분히 모공이 고립되고 나면, 이후의 실험을 진행합니다. </li></ol> S10B 여포의 3. 체외 개발 <ol><li> IVEM 미디어에서 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 S10B 모낭을 분리합니다. 모공이 빠르게 떨어져 파편에서 이동되어 있는지 확인합니다. 이 난포가 성숙하는 것, 그것은의 impo입니다S10Bs이 30 ~ 60 분 동안 수집 한 다음 선택의 성숙 미디어에 배치되는 rtant. 참고 : S10B은 S10A 여포가 IVEM 문화 미디어 성숙하지 않으므로 신중하게, (1B에 비해 그림 1C) S10A 여포 구별 할 필요가있다. S10A 및 S10B 여포 모두에서, 길이의 절반은 널스 세포로 구성되고, 나머지 반은 난자이지만 S10B에서 모낭의 길이는 S14 여포 동일하다. </li><li> 유리 피펫을 이용하여 24 - 웰 조직 배양 플레이트로 잘 ~ 30 S10B 모낭을 이동. 참고 : 전송되는 모낭의 모든 S10B하고 S11 성숙되지 않았는지 확인해야합니다. </li><li> 즉 IVEM 미디어 플러스 약물 시약, 잘 당 성숙 매체의 1 μl를 준비합니다. </li><li> 뽑아 유리 피펫 *를 사용하여 가능한 한 잘 (단계 3.2)에서 많은 미디어를 제거하고, 신속하게 선택의 성숙 미디어를 추가 할 수 있습니다. 참고 :이 뽑아 유리 주사위를 사용하는 것이 필수적입니다무대 여포로 ETTE 쉽게 Pipetman 유리 피펫이나 피펫 팁 중 하나와 함께 촬영 할 수 있습니다. * 뽑아 피펫을 만들려면 : 1) 유리가 부드럽게 시작 바로 전까지 분젠 버너의 불꽃 긴 유리 피펫의 얇은 부분을 가열, 2) 즉시 불꽃 밖으로 피펫을 이동에 피펫을 그리는 수평으로 당겨 미세한 관 3) 좋은 점을 생성하는 휴식. 주의 : 유리의 파편이 날아 수 있으므로 보안경을 사용하십시오. </li><li> 실험이 필요로 반복 많은 우물에 3.1-3.4 단계를 반복합니다. </li><li> 모공&gt; 10 시간 동안 개발하고 해부 범위에 개발 진행을 득점 할 수 있습니다. 참고 : 실험은 일반적으로 모공이 개발을위한 충분한 시간을 허용하기 위해 다음 날 채점됩니다. S10B가 ~ 5 시간이며, S11은 ~ 30 분이며, S12은 1 ~ 2 시간이며, S13은 다소 시간이 오래 걸릴 것 실내 온도 25 ° C에서 1 개발의 기간에 ~ 1 시간입니다. S10B 여포에 대해 기재 한 것과 유사한 실험을 할 수있다S11-S13 여포를 사용하여 수행. </li></ol> 4. 라이브 이미징 단계 격리 <ol><li> 빨리 떨어져 이물질이 모공을 이동, IVEM 미디어에서 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 선택의 형광 마커를 발현하는 최종 단계의 난포 (S10B-14)를 분리합니다. </li><li> 새로운 미디어에 관심 여포를 이동 한 후 커버 슬립 바닥 페트리 접시에 유리 피펫으로 전송할 수 있습니다. 이 커버 슬립 바닥 면적에 거품 만에 유출되지 않도록 용지를 추가 할주의하십시오. </li><li> 더 이상 시간 경과 영화의 경우, 페트리 접시의 안쪽 가장자리에 물에 적신 올리고 킴 와이프를 추가하여 배양 접시 내에서 습도를 유지하기 위해 때때로 필요하다. 상단에 뚜껑을 놓습니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 이미지. 자세한 해상도는 공 초점 현미경이 필요합니다. 그것은 영상, 조명의 강도, 영상의 길이의 주파수를 균형을 필요가있다, 이것은 각각 독립적으로 L 위해 일해야합니다abeling 도구 및 개발 과정. </li></ol> 5. mRNA의 준비를위한 단계 격리 <ol><li> 그레이스의 또는 IVEM 매체 하나와 함께 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 각각의 단계 모낭을 분리합니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 미디어와 새로운 우물에 관심의 각 단계를 이동, 그것은 한 번에 여러 단계를 수집 할 수 있습니다. </li><li> 1 시간에서 수집 시간을 유지합니다. 1.5 ML의 microfuge 튜브에 유리 피펫을 사용하여 모공을 이동합니다. </li><li> 모공의 모든 펠렛 미니 마이크로 원심에서 간단히 튜브를 스핀. 뽑아 유리 피펫 (단계 3.4 참조)를 사용하여 조심스럽게 용지를 모두 제거합니다. 참고 : 전체 크기의 마이크로 원심을 사용하는 경우, 낮은 속도로 모공을 스핀 다운. </li><li> 트리 졸 100 μl를 추가하고 플라스틱 유를 사용하여 ~ 20 초 동안 손으로 갈기. 마이크로 원심의 전체 속도로 스핀 다운 및 펠렛 D를 방해하지 않도록주의하고 새로운 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 트리 졸 이동ebris. -80 ° C.에 저장 </li><li> 충분히 모공이 실험을 얻을 때까지 반복 5.1-5.5 단계를 반복합니다. 일상적 ~ 75 S10B은, ~ 75 S12 및 S14 ~ 100 여포는 RNA의 ~ 10 μg을 얻을 수 있습니다. </li><li> 얼음에 샘플을 해동. 한 미세 원심 분리 튜브에 적절하게 샘플을 배합하고 800 μL까지 트리 졸 볼륨을 가져온다. 제조업체의 지시에 따라 RNA 분리를 진행합니다. 중요 :의 RNase 무료 DNase의와 격리 된 RNA를 DNA 분해 효소 치료해야합니다. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅을위한 무대 격리 <ol><li> 100 ℃로 가열 블록을 예열 </li><li> 그레이스의 또는 IVEM 매체 하나와 함께 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 각각의 단계 모낭을 분리합니다. 참고 : 경험적으로 각각의 특정 단백질을 관찰하는 데 필요한 방법을 특정 단계 모낭의 수를 결정하는 것이 필요하다. 높은 발현 된 단백질의 경우도 1-3 S10B 여포 /는 서양 얼룩에 강한 신호를 볼 충분하다. 그러나, 확인하는 것이 중요합니다대표 예제, 다수의 여성에서 난포를 복용. 따라서, 특정 단계의 15-20 모공은 일반적으로 수집됩니다. </li><li> 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 유리 피펫을 사용하여 모공을 이동합니다. (단계 5.4 참조) 모공 펠렛 미니 마이크로 원심에서 간단히 스핀. 조심스럽게 (단계 3.4 참조) 뽑아 유리 피펫을 사용하여 용지를 모두 제거하고 1X PBS 50 μL와 배 램리 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 플라스틱 유 봉 20 초 ~에 손으로 갈기. 참고 : 플라스틱 방앗 공이 세탁물에 따라 서부 샘플을 연마하고 압력 가마로 소독을 위해 재사용 될 수있다. </li><li> 열 블록에 10 분 동안 샘플을 끓인다. </li><li> 마이크로 원심에서 15 초 동안 전체 속도로 얼음과 스핀에 간단히 풀어. 즉시 -20 ℃에서 SDS-PAGE 젤 또는 상점에로드 하나 참고 : 샘플이 저장되어있는 경우, 젤에로드하기 전에 샘플을 재비 기억. </li><li> 표준 프로토콜을 다음과 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. </li></ol>

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	<li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament+cables+in+Drosophila+nurse+cells+are+composed+of+modules+that+slide+passively+past+one+another+during+dumping.">Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping.</a> J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).</li><li>Horne-Badovinac, S., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transit:+epithelial+morphogenesis+in+the+Drosophila+egg+chamber.">Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber.</a> Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).</li><li>McCall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggs+over+easy:+cell+death+in+the+Drosophila+ovary.">Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary.</a> Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).</li><li>Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+shell+game:+patterning+genes+and+morphological+change.">The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change.</a> Trends Genet. 21, 346-355 (2005).</li><li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+II.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49, 411-424 (2006).</li><li>Tootle, T. L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pxt:+a+cyclooxygenase-like+facilitator+of+follicle+maturation.">Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation.</a> Development. 135, 839-847 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Fascin+is+a+novel+downstream+target+of+prostaglandin+signaling+during+actin+remodeling.">Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Bianco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+modes+of+guidance+signalling+during+collective+migration+of+border+cells.">Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells.</a> Nature. 448, 362-365 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flytrap,+a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster.">Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+eggshell+production:+identification+of+new+genes+and+coordination+by+Pxt.">Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt.</a> PLoS. One. 6, e19943 (2011).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li></ol>

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초파리의 뿌리는 형태 학적 및 분자 분석 모두에 이상적, 세포 유형의 작은 숫자로 구성되어 있습니다. 한층 인해 난소의 구조, 평범한 해부 범위 및 최소한의 교육 난포 개발의 특정 단계를 다수 구하는 것이 상대적으로 쉽다. 각 단계는 짧은 시간 창을 나타내는 바와 같이, 단 분리는 그 단계에서 발생하는 발달 과정에 중요한 분자 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 S10B, S12...

각 초파리의 난소는 16 ovarioles, 또는 순차적으로 성숙 계란 챔버 또는 여포의 체인 ~로 구성되어있다. 각각의 뿌리가 하나의 난자, 15 세균 라인 파생 간호사 또는 지원 세포, 모낭 세포 (그림 1A)라고 ~ 650 체세포로 구성되어있다. 초파리의 난자가 개발 한 14 형태 학적으로 정의 된 단계로 나누어 져 있습니다. 난포 전개의 각 단계는 비교적 쉽게 스테이지 특정 모낭의 상당수를 분리하게, 단일 플라이 내에 여러 번 관찰된다. 난자 (10B-14 스테이지)의 중후반 단계 (그림 1) 단계의 분리에 특히 적합하다. 단계 10B (S10B)에서, 모낭 완전히 (즉, 그 길이가 14 단계 (S14) 모낭과 동일하다,도 1 및도 2H를 참조)으로 연장되고 모낭의 절반 길이는 널스 세포로 구성된다나머지 절반은 난자 (그림 1C) 동안. 이 단계에서 간호사 세포는 대뇌 피질의 액틴을 강화하고 액틴 필라멘트 2의 병렬 번들을 생성, 극적인 말라 리모델링을 받고있다. 동시에, 모낭 세포의 인구는 간호사 세포와 난자 사이에 마이그레이션, 구심 세포라고하고, 모낭 세포의 두 지느러미 그룹 등의 부속 기관, 배아 3 관 호흡 장치를 형성하기 위해 마이그레이션을 받아야 지정된 될 . 간호사가 배아 (그림 1D)를 완료하는 데 필요한 요인으로 난자를 제공 간호사 전지 덤핑라는 과정에서 난자에 자신의 세포질 내용을 짜내는 다음 계약 (S11), 세포. 간호사 세포는 세포 사멸 (S12-S13) 4를 받아야하고, 여포 세포는 달걀 껍질 5 (그림 1E-G)를 분비 및 패턴입니다. 따라서 난자의 끝이 중요한 발달이 풍부합니다D 형태 형성 과정. 격리 중후반 스테이지 여포 (S10B-S14)는 분자 분석 등 다양한 목적을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 단계적 모낭으로부터의 mRNA를 RT-PCR, 마이크로 어레이에 대해 분리 될 수 있고, 또는-RNA 서열 분석. 이것은 하나의 존재 단지 몇 종류의 세포로, 짧은 개발 윈도우 내에서 유전자 발현을보고, 유전자 발현이 약물이나 유전자 중 하나 섭동에 의해 변경하는 방법을 확인할 수 있습니다. 단 분리는 웨스턴 블로 팅에 의해 단백질을보고하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 하나의 특정 단계에서 돌연변이 대 야생형 단백질의 발현 수준을 정량 할 수 있기 때문에 이러한 분석은 중요하다. 하나를 사용할 수 있지만 면역 형광 정량 인해 모든 화소가 검출 6의 선형 범위 내에 엄격한 요구에 덜 견고, 비슷한 결과를 얻을 분석한다. 또한, 웨스턴 블롯 분석은 다른 정보를 제공 할 수있다 이러한발 단백질 posttranslationally 개질되거나 특정 스플 라이스 이소로부터 발현되는 경우. 격리 단계는 세포 이하 분획 또는 coimmunoprecipitation 포함한 상기 단백질 정제를 위해 사용될 수있다. 스테이지 별 모낭 분리는 체외 개발 분석 7과 라이브 영상 8 사용할 수 있습니다. 고립 된 S10B-S13 여포 (아래 참조) 간단한 배지에 S14을 개발하는 것입니다. 그것은 S10A 모낭이 원고에서 논의 된 배양 조건을 사용하여 덤핑 간호사 셀을 진행하지 않을 것을주의하는 것이 중요합니다. 우리는 읽기 아웃 7,9로 간호사 덤핑 세포 및 개발을 사용하여 말라 리모델링을 조절하는 두 약리학 적 및 유전, 프로스타글란딘의 역할을 정의 할 수 S10B 체외 개발 분석을 사용했다. 마찬가지로, 개발 후기 단계는 약물 치료 또는 유전자 남자의 효과를 결정하기 위하여 분리 될 수있다이러한 구심 세포 이동, 등의 부속기 마이그레이션 / 대형 10, 간호사 세포의 죽음과 같은 특정 프로세스에 대한 ipulations. 이러한 분석이 지배적 인 상호 작용 화면이나 분석을 수행 할 수 있습니다, 예를 들어, PXT 또는 fascin 혼자 돌연변이 이형은 S10B 체외 발달에 영향을주지하면서, 이중 이형 전시 간호사 세포 결함 및 개발 9 블록을 덤프에서 난포. S10B-13 배양에서 발전 할 수 있기 때문에 또한,이 시간 동안 발생하는 모든 프로세스는 실시간 이미징에 의해 관찰 될 수있다. 이러한 영상은 단순히 형광 프로브 또는 라이브 영상 염료로 염색 모공을 표현 형질 전환 초파리를 사용하여 (한 형태의 심한 변화에만 관심이있는 경우) 투과광을 사용하거나 공 초점 현미경을 수행 할 수 있습니다. 라이브 영상은 실질적으로 발달 과정에 대한 우리의 이해를 사전에 사용하고 있습니다. 실제로, 걸 보면 라이브말기 여포의 G는 등의 부속기 이주의 지식, 세뇨관 (10)의 예를 확장했다. 우리는 투기 간호사 셀 동안 말라 역학 등의 추가 최종 단계 프로세스의 라이브 영상이 발달 이벤트에 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 기대합니다. 그것은 S10A 및 난포 발달의 초기 단계는 문화 S14에 개발을 계속하는 것은 아니지만 개발하는 단계에서 발생하는 이벤트의 라이브 영상은 (이상 설명을 참조 다른 배양 조건에게 11 ~ 14를 사용 할 수 있습니다하는 것이 중요합니다 정보). 여기에서 우리는 하나의 생체 개발을위한 최종 단계 모낭 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 라이브 영상, 또는 분자 분석 (mRNA와 단백질 격리).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

초파리의 난자 또는 난포 발달 널리 복잡한 발달 및 세포 생물학 프로세스의 이해를 사전에 이용되고있다. 이 방법 종이 중후반 단계 여포 (단계 10B-14)를 분리하고 개발 시간을 꽉 창 중에 발생하는 분자 형태 학적 이벤트에 새로운 통찰력을 제공하기 위해이를 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 격리 모낭 체외 개발 분석법, 라이브 영상, mRNA 발현 분석 및 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 포함한 실험 기법의 다양한 위해 사용될 수있다. 단계 (b) (S10B)에서 이상 모공 문화 개발을 완료 할 것이다, 이것은 하나의 개발의 특정 기간 동안 발생하는 과정에서 이러한 조작의 효과를 정의하기 위해 체외 개발 유전 약리학 적 교란을 결합 할 수 있습니다. 이러한 모공은 문화 발전하기 때문에 또한, 그들은 이상적으로 라이브 영상 연구에 적합종종 형태 학적 사건을 중재 새로운 메커니즘을 공개한다. 격리 여포 또한 분자 분석을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 유전 섭동 인한 유전자 발현의 변화는 특정 발달 윈도우에 대해 정의 될 수있다. 또한, 소낭 개발 특정 단계 동안 단백질 수준, 안정성 및 / 또는 번역 후 변형 상태는 웨스턴 블롯 분석을 통해 검사 할 수있다. 따라서, 초파리 여포의 단계 별 분리 개발 및 형태 형성의 널리 보존 프로세스에 풍부한 정보를 제공한다.

초파리 여포 개발의 특정 단계를 분리 할 때 정확하게 상이한 형태 학적 단계를 구별 할 수있을 것이 필수적이다. 간호사 세포와 난자 각 (그림 1B는 1C에 비해)이 단계에서 뿌리 길이의 반을 차지로이, S10A 및 S10B에 대한 다소 도전이다. S10B 모낭이 완전히 신장 및 S14 여포 (1G에 비해 그림 1C)에 길이에 따라서 동일 그러나, S10A 여포는, S10B 여포보다 길이가...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K 조회수.  University of Iowa Carver College of Medicine.  중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다. 