Gostaríamos de agradecer a Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: linha GFP), o Bloomington Stock Center, ea Developmental Studies Hybridoma Banco de reagentes. Agradecemos ainda todos os membros do Laboratório Tootle para discussões úteis e críticas do manuscrito. O financiamento da National Science Foundation MCB-1158527, e fundos de arranque da Anatomia e Departamento de Biologia Celular da Universidade de Iowa apoiaram este trabalho. National Institutes of Health Predoctoral Training Grant em Ciências Farmacológicas T32GM067795 apoiado AJS. Suporte de armazenamento de dados foi fornecido pela ICTS, que é financiado através do CTSA apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Institutos Nacionais de Saúde, através Grant UL1RR024979.

1. Preparando Drosophila Antes de encenar isolamento <ol><li> Faça molhado pasta levedura, combinando 50 g de fermento seco ativo com 90 ml de água destilada. Misture com uma espátula para combinar. Deixe a mistura repousar por ~ 30 min antes de avaliar a consistência. A consistência deve ser apenas espessa o suficiente para aderir ao lado de um frasco de voar, mas não correr para o lado. Para atingir a consistência desejada, pode ser necessário adicionar-se a 10 ml de água adicional, ou uma pequena quantidade de fermento seco. Guarde em um recipiente coberto a 4 ° C. A levedura armazenada pode ser usada para a ~ 1-2 semanas. </li><li> Colete &lt;24 hr velhas moscas adultas (ambos machos e fêmeas) dos genótipos desejáveis ​​e colocá-los em um frasco com alimentos voar mais molhado pasta levedura manchada no lado do frasco. A temperatura a que as moscas são mantidas irá variar, dependendo da experiência. Para as experiências de rotina, as moscas são mantidas à temperatura ambiente. Considerando que as experiências em que um gene ésendo sobre-expresso utilizando o sistema 15 de maio UAS/GAL4 requerem manutenção das moscas, a 25 ° C ou mais, conforme apropriado. </li><li> Fornecer as moscas com uma nova mancha de levedura pasta por dia durante 2 dias. NOTA: Como o desenvolvimento folicular é rigidamente controlado pelo estado nutricional da mosca fêmea, é essencial para fornecer a voar com o nutriente rico colar leveduras por pelo menos 36 horas antes da dissecção. </li></ol> 2. Isolando Mid-de-final Encenado Drosophila Folículos <ol><li> Permita que os meios de comunicação para atingir a temperatura ambiente (~ 30 min). Se os folículos encenadas vai ser utilizado para ensaios in vitro de desenvolvimento, recentemente preparar meios de IVEM (meios de insecto de Grace, 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, e 1x penicilina / estreptomicina). Se os folículos encenadas vão ser utilizados para mRNA ou isolamento de proteínas usar qualquer inseto de Grace ou mídia IVEM. IMPORTANTE: temperatura de mídia é fundamental. Se a mídia é frio que vai alterartanto o citoesqueleto de actina e de microtúbulos e desenvolvimento do bloco. </li><li> Anestesiar as moscas no frasco yeasted injetando CO 2 gás e coloque 3-5 moscas fêmeas em uma almofada de mosca sob CO 2. IMPORTANTE: Não deixe mais mulheres do que pode ser dissecados em um período de tempo de 10 minutos na plataforma de fly como a exposição prolongada ao CO 2 pode causar esterilidade e à morte. </li><li> Encha um poço de uma placa 9-ponto com a mídia e coloque-o em cima de uma superfície escura (um pedaço de acrílico preto funciona bem). Concentre o escopo de dissecação sobre a parte inferior do poço. </li><li> Usando # 5 fórceps Dumont pegar uma única fêmea com uma mão (este é o melhor feito usando a mão dominante). Muitas vezes, é mais fácil de pegar a fêmea pelas asas, pernas, tórax ou abdômen para a transição. Submergir o feminino na mídia bem cheios. Ajustar a focagem do microscópio, conforme necessário. </li><li> Usando um segundo par de fórceps na mão não dominante, pegue a fêmea na extremidade anterior do abdômende modo que a extremidade posterior é posicionada para o lado dominante (Figura 2A). Certifique-se de manter a mosca submerso na mídia. </li><li> Com a mão dominante, use a pinça para agarrar a cutícula no 2 º segmento pigmentada mais posterior e rasgá-lo longe do resto do abdômen (Figuras 2B-C). </li><li> Usando a pinça na mão dominante, aperte delicadamente a extremidade anterior do abdome até os ovários emergir (Figuras 2D-E). Se necessário, coloque a pinça entre os dois ovários e puxá-los para fora da carcaça. </li><li> Ou mover os ovários para um novo poço com meio fresco (Figura 2F) ou remover a carcaça de uma toalha ou papel Kimwipe. Isto é particularmente importante se os folículos são isolados para o desenvolvimento in vitro. </li><li> Repita até 3-5 pares de ovários têm sido isolados. NOTA: Cada ovário é composto de ~ 16 ovaríolos ou cadeias de folículos sequencialmente amadurecendo. Cada ovaríoloestá contido dentro de uma bainha de músculo. </li><li> Usando tornos de pinos e as agulhas fornecidas com eles, puxe para além do ovário, executando as agulhas entre os ovaríolos (Figura 2G). Isso às vezes vai liberar os folículos individuais também. </li><li> Ovaríolos individuais e os estágios morfológicos facilmente distinguíveis de desenvolvimento folicular agora deve ser visível (Figura 2G, brincou além ovário). Referem-se Figuras 1 e 2H para diferenças morfológicas que podem ser utilizados para distinguir as diferentes fases. Para isolar os folículos que estão dentro ovarioles intactas e ainda contidos dentro de um invólucro do músculo, utilizar uma agulha de atravessar a ovaríolo no anterior do folículo anterior e na parte posterior do folículo imediatamente após o folículo de interesse. Isto vai quebrar a bainha do músculo e do folículo de interesse distância pode agora ser cortado a partir dos folículos vizinhas, sem danificá-la. </li&gt; <li> Como etapas individuais são separados, mova os folículos de interesse, com uma pipeta de vidro, para um novo poço com meios frescos. Isto é particularmente importante quando se isola folículos para o desenvolvimento in vitro. NOTA: É importante apertar o bulbo da pipeta antes de entrar nos meios de comunicação para evitar que as bolhas de ar de redistribuir os folículos de interesse ao longo do poço. Além disso, se os folículos estão aderindo à pipeta de vidro, a pipeta pode ser pré-revestido com 3% de albumina sérica bovina (BSA), pipetando a solução de BSA cima e para baixo várias vezes e lavagem com meio de dissecação. </li><li> Uma vez que os folículos suficientes têm sido isolados, prosseguir com as experiências posteriores. </li></ol> 3. Desenvolvimento in vitro de folículos S10B <ol><li> Isolar folículos S10B utilizando o protocolo de isolamento de fase (passo 2) em meios IVEM. Certifique-se de que os folículos estão rapidamente se afastou de detritos. Como estes folículos continuará a amadurecer, é important S10Bs que são recolhidos durante 30-60 minutos e, em seguida, colocado no meio de maturação de escolha. NOTA: S10B precisam ser cuidadosamente distinguida de folículos S10A (Figura 1C, em comparação com 1B), como folículos S10A não vencerão nos meios de cultura IVEM. Em ambos S10A e S10B folículos, metade do comprimento é constituído por células de enfermagem e a outra metade é o oócito, mas em S10B o comprimento do folículo é igual à dos folículos S14. </li><li> Usando uma pipeta de vidro, mover ~ 30 folículos S10B para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. NOTA: Certifique-se de verificar se todos os folículos sendo transferidos são S10B e não amadureceram para S11. </li><li> Prepare 1 ml de meio de maturação por bem, ou seja, mídia IVEM mais reagentes farmacológicos. </li><li> Usando uma pipeta de vidro * puxado, retire o máximo de mídia do bem (passo 3.2) possível, e rapidamente adicionar mídia maturação de escolha. NOTA: É essencial usar um pip vidro puxadoette como folículos encenado pode ser facilmente absorvido tanto com pipetas de vidro ou pontas de pipeta com um Pipetman. * Para fazer pipetas puxados: 1) aquecer a parte fina de, pipetas de vidro longas na chama de um bico de Bunsen apenas até que o vidro começa a amolecer, 2) mover imediatamente a pipeta para fora da chama e puxar horizontalmente para desenhar a pipeta um tubo fino, 3) quebrar para gerar uma ponta fina. CUIDADO: Use proteção para os olhos como fragmentos de vidro pode voar. </li><li> Repita os passos de 3,1-3,4 para o maior número de poços como o experimento exige. </li><li> Permitir folículos desenvolver para&gt; 10 hr e marcar a progressão do desenvolvimento sob um escopo de dissecação. NOTA: As experiências são geralmente marcados no dia seguinte para dar tempo suficiente para que os folículos se desenvolvem. S10B é ~ 5 horas, S11 é ~ 30 min, S12 é ~ 2 horas, e S13 é ~ 1 hora de duração a 25 ° C 1 e desenvolvimento à temperatura ambiente vai demorar um pouco mais. Experiências semelhantes à descrita para a folículos S10B pode serrealizada utilizando folículos S11-S13. </li></ol> 4. Isolamento Stage for Imaging ao vivo <ol><li> Isolar folículos de fase tardia (S10B-14) expressando o marcador fluorescente de preferência utilizando o protocolo de isolamento de fase (passo 2) em meios IVEM, movendo-se rapidamente para longe folículos de detritos. </li><li> Mova folículos de interesse para novas mídias e, em seguida, transferir, com uma pipeta de vidro para uma placa de Petri inferior lamela. Tome o cuidado de adicionar mídia de modo que bolhas na área de fundo lamela, mas não está sobrando. </li><li> Para filmes de lapso de tempo mais longos, às vezes é necessário para manter a umidade dentro da placa de Petri, adicionando um enrolado Kimwipe, umedecido com água, até a borda interior da placa de Petri. Coloque a tampa na parte superior. </li><li> Imagem de um microscópio invertido. Resolução detalhada exigirá microscopia confocal. É necessário equilibrar a frequência de imagem, a força da iluminação, eo comprimento da imagem, o que terá de ser trabalhado de forma independente para cada lferramenta Abeling e processo de desenvolvimento. </li></ol> 5. Isolamento Estágio de Preparação mRNA <ol><li> Isolar folículos dos estágios individuais usando o protocolo de isolamento de fase (passo 2), quer com meios de comunicação de Grace ou IVEM. </li><li> Usando uma pipeta de vidro, mova os estágios individuais de interesse em novos poços com mídia, é possível coletar vários estágios de uma só vez. </li><li> Mantenha horários de coleta em 1 hora. Mover os folículos, utilizando uma pipeta de vidro, para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar o tubo brevemente, em mini-microcentrífuga para sedimentar todas as folículos. Usando uma pipeta de vidro puxado (veja o passo 3.4) remova cuidadosamente todos os meios de comunicação. NOTA: Se estiver usando um tamanho microcentrifuge completo, girar os folículos em baixa velocidade. </li><li> Adicione 100 ml de Trizol e triturar com a mão para ~ 20 segundos usando um pilão de plástico. Gire para baixo em full-speed em uma microcentrífuga e mover Trizol para um novo tubo de 1,5 ml de microcentrífuga com cuidado para não perturbar qualquer d peletizadaebris. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Repita os passos de 5,1-5,5 até folículos suficientes foram obtidos para o experimento. Rotineiramente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, S14 e ~ 100 folículos rendimento ~ 10 ug de ARN. </li><li> Descongelar as amostras em gelo. Combinar as amostras, conforme apropriado, em um tubo de microcentrífuga e levar o volume até 800 Trizol ul. Prossiga com o isolamento do RNA, conforme indicado pelo fabricante. IMPORTANTE: Lembre-se de DNase tratar o RNA isolado com RNase DNase livre. </li></ol> 6. Isolamento Stage para Western Blotting <ol><li> Pré-aqueça um bloco de aquecimento a 100 ° C. </li><li> Isolar folículos dos estágios individuais usando o protocolo de isolamento de fase (passo 2), quer com meios de comunicação de Grace ou IVEM. NOTA: É necessário determinar empiricamente quantos de um folículo estágio particular são necessários para observar cada proteína específica. Para proteínas altamente expressas 1-3 S10B folículos / assim é o suficiente para ver um sinal forte em um western blot. No entanto, é importante para fazer umamostra representativa, tendo os folículos de várias fêmeas. Assim, 15-20 folículos de um determinado estágio são normalmente coletados. </li><li> Mover folículos, utilizando uma pipeta de vidro, para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Gire brevemente em um mini-microcentrifuge para agregar os folículos (veja o passo 5.4). Com cuidado, retire toda a mídia usando uma pipeta de vidro puxado (veja o passo 3.4) e adicionar 50 mL de PBS 1x e 50 mL de tampão de Laemmli 2x. </li><li> Moer a mão para ~ 20 segundos com um pilão de plástico. NOTA: pilões de plástico pode ser reutilizado para a moagem de amostras ocidentais por lavagem e o tratamento em autoclave elas. </li><li> Ferver as amostras durante 10 min, no bloco de calor. </li><li> Descontraia brevemente no gelo, girando em velocidade total por 15 segundos em uma microcentrífuga. Ou coloque imediatamente em um gel SDS-PAGE ou armazenar a -20 ° C. NOTA: Se as amostras são armazenadas, lembre-se referver as amostras antes de carregar no gel. </li><li> Realizar análise de western blot seguindo protocolos padrão. </li></ol>

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Não há nada a divulgar.

O folículo Drosophila é composto de apenas um pequeno número de tipos de células, tornando-o ideal para ambos morfológica e análises moleculares. Além disso, devido à estrutura do ovário, é relativamente fácil de obter um grande número de fases específicas do desenvolvimento folicular com um escopo de dissecação comum e uma formação mínima. À medida que cada estágio representa uma janela temporal, curto, isolamento fase pode fornecer informações moleculares significativas nos processos de ...

Cada ovário Drosophila é composto de ~ 16 ovaríolos, ou cadeias de sequencialmente amadurecimento câmaras de ovos ou folículos. Cada folículo é composta por um único oócito, células derivadas de enfermagem ou de suporte 15 da linha germinal, e ~ 650 células somáticas denominadas células foliculares (Figura 1A). Drosophila oogénese é dividido em 14 etapas morfologicamente definidas de desenvolvimento 1. Cada fase de desenvolvimento folicular é observado muitas vezes dentro de um único mosca, tornando relativamente fácil de isolar um número substancial dos folículos específica da fase. Os meio-de-final etapas da ovogênese (Stages 10B-14) são particularmente adequados para o isolamento de fase (Figura 1). Na Fase 10B (S10B), o folículo é totalmente alongada (isto é, o seu comprimento é igual à de uma Fase 14 (S14) folículo, ver Figura 1 e Figura 2H) e metade do comprimento do folículo é composto de células enfermeiraenquanto que a outra metade é o ovócito (Figura 1C). Nesta fase, as células passam por enfermeira dramática remodelação da actina, o reforço da actina cortical e gerar feixes paralelos de dois filamentos de actina. Ao mesmo tempo, uma população de células foliculares, chamadas de células centrípetas, migram entre as células e a enfermeira de oócitos, e dois grupos dorsais de células foliculares de tornar especificado para sofrer a migração para formar os apêndices dorsais, aparelhos respiratórios tubulares para o embrião 3 . As células de enfermagem, em seguida, contrato (S11), apertando seu conteúdo citoplasmático para o oócito em um processo chamado de célula enfermeira dumping, que fornece o oócito com os fatores necessários para a conclusão da embriogênese (Figura 1D). As células, em seguida, submetidos a enfermeira morte celular (S12-S13) 4, e as células do folículo e secretar padrão da casca de ovo 5 (Figuras 1E-G). Assim, o fim do oogenesis é rico com um desenvolvimento importanted processos morfogenéticos. Folículos isolados fase meio-de-final (S10B-S14) pode ser usado para uma variedade de fins, incluindo as análises moleculares. Por exemplo, o ARNm a partir de folículos encenadas pode ser isolado por RT-PCR, de microarray, ou análise de RNA-seq. Isto permite que se olhe para a expressão de genes dentro de uma janela de desenvolvimento curto, com apenas alguns tipos de células presentes, e determinar a expressão de genes é alterada por perturbações ou farmacológicas ou genéticas. Isolamento fase também pode ser usado para examinar as proteínas por transferência Western. Tal análise é importante porque ela permite quantificar o nível de expressão da proteína de tipo selvagem em relação mutantes em fases específicas. Apesar de se poder utilizar análises de imunofluorescência para conseguir resultados semelhantes, a quantificação de fluorescência é menos robusta, devido aos requisitos estritos que todos os pixels dentro da gama linear de detecção 6. Além disso, a análise de Western blot pode fornecer outras informações, tals, se a proteína for modificada posttranslationally ou é expressa a partir de uma isoforma específica de splicing. Isolado fases também pode ser utilizado para purificação de proteína, incluindo o fraccionamento subcelular ou coimmunoprecipitation. Isolamento folículo específico-Stage também pode ser usado para ensaios in vitro de desenvolvimento 7 e live-imaging 8. Isolados folículos S10B-S13 continuará a desenvolver a S14 em meios de cultura simples (veja abaixo). É importante notar que os folículos S10A não vai progredir através célula enfermeira despejo usando as condições de cultura discutidas no texto. Temos usado S10B ensaios in vitro de desenvolvimento para definir o papel das prostaglandinas, tanto farmacologicamente e geneticamente, ao regular a remodelação actina utilizando células enfermeira dumping e desenvolvimento como ler-outs 7,9. Do mesmo modo, as fases posteriores do desenvolvimento, também pode ser isolado para determinar os efeitos de tratamentos farmacológicos ou homem genéticaipulations sobre processos específicos, como a migração centrípeta celular, migração apêndice dorsal / formação 10, e morte celular enfermeira. Tais ensaios podem ser utilizados para realizar telas de interacção dominantes ou ensaios, por exemplo, enquanto a heterozigosidade para mutações em pxt ou fascina sozinho não tem nenhum efeito sobre o desenvolvimento in vitro S10B, os folículos de heterozigotos duplas célula enfermeira exposição de dumping defeitos e um bloco em desenvolvimento 9. Além disso, porque S10B-13 pode desenvolver-se em cultura, todos os processos que ocorrem durante este tempo pode ser observada por formação de imagens em directo. Essa imagem pode ser realizado simplesmente usando luz transmitida (se estiver interessado apenas em alterações macroscópicas na morfologia) ou com a microscopia confocal usando moscas transgênicos expressando sondas fluorescentes ou folículos corados com corantes de imagem ao vivo. Imagens ao vivo está sendo usado para fazer avançar substancialmente a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento. De fato, imagin viverg de folículos fase tardia ampliou o conhecimento da migração apêndice dorsal, um exemplo de tubulogenesis 10. Esperamos que a imagem ao vivo de processos fase tardia adicionais, incluindo dinâmica de actina durante celular enfermeira dumping, vai fornecer novos insights sobre esses eventos de desenvolvimento. É importante notar que, enquanto S10A e estágios iniciais de desenvolvimento do folículo não vai continuar a evoluir para uma S14 na cultura, live-imagem dos eventos que ocorrem durante os estágios de desenvolvimento é possível, utilizando condições de cultura alternativos 11-14 (ver discussão mais informação). Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar folículos fase tardia para qualquer desenvolvimento in vitro e live-imagem, ou análises moleculares (mRNA e isolamento de proteínas).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

Drosophila oogenesis ou desenvolvimento folicular tem sido amplamente utilizada para fazer avançar a compreensão dos processos biológicos de desenvolvimento e celulares complexos. Este artigo descreve métodos de como isolar folículos estágio médio a tardio (Stage 10B-14) e utilizá-los para fornecer novos insights sobre os eventos moleculares e morfológicas que ocorrem durante as janelas apertados de tempo de desenvolvimento. Os folículos isolados podem ser utilizados para uma variedade de técnicas experimentais, incluindo ensaios in vitro de desenvolvimento, imagens em tempo real, a análise da expressão de mRNA e análise de Western blot de proteínas. Os folículos em estágio 10B (S10B) ou mais tarde vai completar o desenvolvimento da cultura, o que permite combinar perturbações genéticas ou farmacológicas com o desenvolvimento in vitro para definir os efeitos de tais manipulações sobre os processos que ocorrem durante períodos específicos do desenvolvimento. Além disso, porque estes folículos desenvolver-se em cultura, eles são idealmente apropriados para estudos de imagiologia em directo, Que muitas vezes revelar novos mecanismos que medeiam eventos morfológicos. Os folículos isolados também podem ser usadas para análises moleculares. Por exemplo, as alterações na expressão de genes que resultam de perturbações genéticas pode ser definido para janelas de desenvolvimento específicos. Além disso, o nível de proteína, estabilidade e / ou pós-tradução estado modificação durante um estágio específico do desenvolvimento folicular pode ser examinado através de western blot analisa. Assim, o isolamento específico do estágio de folículos Drosophila fornece uma rica fonte de informações em processos amplamente conservadas do desenvolvimento e morfogênese.

Quando o isolamento de fases específicas do desenvolvimento folicular Drosophila é essencial ser capaz de distinguir com precisão os diferentes estágios morfológicos. Isto é um pouco difícil de S10A e S10B, como as células de enfermagem e o oócito cada ocupar metade do comprimento do folículo nestas fases (Figura 1B em comparação com 1C). No entanto, os folículos S10A são mais curtos em comprimento do que os folículos S10B, como os folículos S10B são totalmente...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Isolamento específico do estágio de médio a tarde folículos de Drosophila é útil para uma variedade de fins. Esses folículos se desenvolvem na cultura, o que permite manipulações genéticas e / ou farmacológicos a ser, juntamente com ensaios in vitro de desenvolvimento e de imagem ao vivo. Adicionalmente, os folículos pode ser utilizado para estudos moleculares, tais como isolamento de ARNm e proteína.

O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final<em&gt; Drosophila</em&gt; Folículo Isolamento

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K visualizações.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Isolamento específico do estágio de médio a tarde folículos de Drosophila é útil para uma variedade de fins. Esses folículos se desenvolvem na cultura, o que permite manipulações genéticas e / ou farmacológicos a ser, juntamente com ensaios in vitro de desenvolvimento e de imagem ao vivo. Adicionalmente, os folículos pode ser utilizado para estudos moleculares, tais como isolamento de ARNm e proteína. 

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Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Expressão alvo de GFP no folículo piloso Usando Transdução Vivo Ex Viral

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Biologia

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Labeling fluorescentes de Drosophila Estruturas Coração

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizar o coração batendo no Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...