Biz reaktifler için Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: GFP hattı), Bloomington Stok Merkezi&#39;ni ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası&#39;na teşekkür etmek istiyorum. Biz daha yazının yararlı tartışmalar ve eleştiriler için Tootle Lab tüm üyelerini teşekkür ederim. Dan fon Ulusal Bilim Vakfı MCB-1158527, ve Anatomi ve Hücre Biyolojisi Bölümü&#39;nden start-up fonları, Iowa Üniversitesi bu çalışmaları destekledi. Farmakolojik Bilimler T32GM067795 Sağlık predoctoral Eğitim Grant National Institutes AJS desteklenmektedir. Veri depolama desteği Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve Grant UL1RR024979 yoluyla Translational Bilimler, Ulusal Sağlık Enstitüleri, ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından desteklenen CTSA yoluyla finanse edilmektedir ICTS tarafından sağlandı.

1.. Drosophila önce İzolasyon Sahne için hazırlanıyor <ol><li> Damıtılmış su 90 ml ile aktif kuru maya, 50 g ıslak maya birleştirerek hamur yapın. Birleştirmek için bir spatula ile karıştırın. Karışım kıvama değerlendirilmesinden önce ~ 30 dakika bekletin. Tutarlılık, sadece yeterince kalın bir sinek flakon tarafına uymak için değil, yüzü aşağı koşmak olmalıdır. İstenilen kıvama ulaşmak için bu ilave 10 ml su veya kuru maya küçük bir miktar kadar eklemek için gerekli olabilir. 4 ° C de kapalı bir kap içinde depolayın Mayanın ~ 1-2 hafta içinde de kullanılabilir. </li><li> &lt;Istenen genotip 24 saat yetişkin sinekler (erkek ve kadın her ikisi de) toplamak ve sinek gıda artı şişenin tarafında bulaşmış ıslak maya hamuru ile bir şişeye koydu. Sinekler muhafaza edildiği sıcaklık deney bağlı olarak değişecektir. Rutin deneyler için, sinekler, oda sıcaklığında muhafaza edilir. Oysa bir gen olduğu deneylerUAS/GAL4 sistemi 15 kullanılarak aşırı eksprese edilmiş, uygun olarak, 25 ° C ya da daha yüksek sinekler muhafaza gerektirebilir. </li><li> 2 gün boyunca günlük maya hamur taze bir smear ile sinekler sağlayın. NOT: Eğer folikül gelişimi sıkı dişi sineğin beslenme durumuna göre düzenlenir gibi, diseksiyon önce en az 36 saat boyunca zengin besin maya hamur ile sinek sağlamak esastır. </li></ol> 2. Yalıtımlı Orta-geç Drosophila folikülleri Sahnelenen <ol><li> Medya, oda sıcaklığında (~ 30 dk) gelmesini bekleyin. Aşamalı köklerinin in vitro geliştirme deneyleri için kullanılacak olacak, taze IVEM ortam hazırlar (Grace böcek ortamı,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 1 x penisilin / streptomisin). Sahnelenen folikülleri mRNA veya protein izolasyonu Grace&#39;in böcek veya IVEM medya kullanabilirsiniz için kullanılan olacak iseniz. ÖNEMLİ: Medya sıcaklığı önemlidir. Ortam soğuk ise, o değiştirecektiraktin ve mikrotübül cytoskeletons ve blok geliştirme hem. </li><li> CO 2 gazı enjekte edilerek mayalı flakon sinekler uyutmak ve CO 2 altında bir sinek ped üzerine 3-5 dişi sinekler yerleştirin. ÖNEMLİ: sinek pad üzerinde bir 10 dakika süre içinde disseke edilebilir daha fazla kadın bırakmayın CO 2 uzatıldı maruz kalma gibi neden olabilir sterilite ve ölüm. </li><li> Medya ile 9-nokta plakanın bir kuyu doldurun ve (siyah pleksiglas bir parça iyi çalışır) Karanlık bir yüzeyin üstüne yerleştirin. Kuyunun altındaki kesme kapsamı Odak. </li><li> Kullanımı # 5 Dumont forseps (bu iyi dominant el kullanılarak yapılır) tek elle bir tek kadın almak. Bu kanatlar, bacaklar, karın ya da geçiş toraks tarafından kadın almak için genellikle kolay değildir. De dolu medyada kadın Batmak. Gerektiği gibi mikroskop odağı ayarlayın. </li><li> Dominant olmayan elde tutulan forseps ikinci bir çifti kullanarak, karın ön ucundaki kadın kapmakarka uç dominant elin (Şekil 2A) doğru konumlandırılmış böylece. Medyada batık sinek tutmak için emin olun. </li><li> Dominant elin ile, 2. en arka pigmente segmentte manikür kapmak ve uzak karın (Şekil 2B-C) geri kalanından rip forseps kullanabilir. </li><li> Yumurtalıklar (Şekil 2D-E) ortaya kadar dominant el forseps kullanarak, yavaşça karın ön ucunu sıkın. Gerekirse, iki yumurtalık arasında forseps yerleştirin ve karkas çekip çıkarın. </li><li> Taze medya (Şekil 2F) ile yeni bir kuyuya yumurtalıklar taşımak veya bir Kimwipe&#39;dan veya kağıt havlu karkas kaldırın. Bu köklerinin in vitro gelişimi için izole edilmektedir bu özellikle önemlidir. </li><li> Yumurtalıkların 3-5 çiftleri izole edilmiştir kadar tekrarlayın. NOT: Her over ~ 16 ovarioles veya sırayla olgunlaşan folikül zincirlerinden oluşur. Her ovariolekas kılıf içinde bulunur. </li><li> Pin vises ve onlarla verilen iğneler kullanarak, yavaşça ovarioles (Şekil 2G) arasındaki iğneler çalıştırarak yumurtalık ayrı çekin. Bu bazen de bireysel folikülleri yayınlayacak. </li><li> Bireysel ovarioles ve folikül gelişiminin kolayca ayırt morfolojik aşamaları artık görünür (Şekil 2G, ayrı alay yumurtalık) olmalıdır. Şekiller 1 ve farklı aşamalarında ayırt etmek için kullanılabilir morfolojik farklılıklar için 2H bakınız. Bozulmamış ovarioles içinde ve hala bir kas kılıf içinde bulunan folikül ayırmak için, hemen ilgi folikül aşağıdaki önceki folikül anterior ve folikül posterior ovariole genelinde kesmek için bir iğne kullanın. Bu kas kılıfı kıracak ve uzak ilgi folikül artık zarar vermeden uzak komşu köklerinin kesilebilir. </li&gt; <li> Tek tek aşamalar ayrılır gibi, taze ortam ile yeni bir oyuğuna, bir cam pipet ile, ilgi konusu köklerinin hareket eder. In vitro gelişimi için köklerinin izole edilmesi, bu özellikle önemlidir. NOT: Bu iyi boyunca ilgi foliküllerini dağıtarak hava kabarcıklarını engellemek için ortamı girmeden önce pipet ampul sıkmak için önemlidir. Folikül cam pipet yapışmasını ise ek olarak, pipet yukarı ve aşağı birkaç kez BSA çözeltisi pipetle ve kesme ortamı ile durulanarak% 3 sığır serum albümin (BSA) ile kaplanmış olabilir. </li><li> Yeterli folikül izole edildikten sonra, daha sonraki deneyler devam edin. </li></ol> S10B Foliküllerinden 3. In vitro Geliştirme <ol><li> IVEM medyada aşama izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak S10B köklerinin izole. Folikülleri hızla uzak enkaz taşınmış olduğundan emin olun. Bu foliküllerin olgunlaşmaya devam edeceği gibi, bu impo olduğuS10Bs 30-60 dakika boyunca toplanmış ve daha sonra tercih edilen olgunlaştırma ortamına yerleştirilir ki rtant. NOT: S10B S10A folikülleri IVEM kültür ortamında olgun olmayacak gibi dikkatli, (1B karşılaştırıldığında Şekil 1C) S10A köklerinin ayırt edilmesi gerekir. S10A ve S10B köklerinin her ikisinde de, uzunluğunun yarısı hemşire hücrelerden oluşan ve diğer yarısı, oosit, ancak S10B içinde folikül uzunluğu S14 köklerinin eşittir. </li><li> Bir cam pipet kullanılarak, bir 24-yuvalı doku kültür plakasının bir kuyuya ~ 30 S10B folikül hareket eder. NOT: aktarılıyor köklerinin tüm S10B ve S11 için olgunlaştığını değil doğrulamak için emin olun. </li><li> Yani IVEM medya artı farmakolojik reaktifler, kuyu başına olgunlaşma medya 1 ul hazırlayın. </li><li> Çekti cam pipet * kullanarak, mümkün olduğunca kuyuda (adım 3.2) kadar medyayı çıkartın ve hızlı bir şekilde seçim olgunlaşma medya ekleyebilirsiniz. NOT: Bu çekti cam pip kullanmak esastırsahnelenen folikül olarak ette kolayca Pipetman cam pipetler veya pipet uçları ile ya kadar alınabilir. * Çekti pipetler yapmak için: 1) cam yumuşamaya başlar sadece kadar bir Bunsen brülör alev uzun, cam pipetler ince kısmını ısıtmak; 2) hemen alevin dışında pipet taşımak ve içine pipet çekmek için yatay olarak çekin daha ince bir tüp; 3) ince bir nokta oluşturmak için bölünürler. DİKKAT: cam parçaları kapalı uçabilirsiniz gibi göz koruması kullanın. </li><li> Deneme gerektirir tekrarlayın gibi birçok kuyu için 3,1-3,4 adımları. </li><li> Folikül&gt; 10 saat boyunca geliştirmek ve diseksiyon kapsamında gelişimsel ilerlemesini puan verin. NOT: Deneyler genellikle köklerinin geliştirmek için yeterli zaman tanımak için ertesi gün puanlanır. S10B ~ 5 saat olan, S11 ~ 30 dk, S12 ~ 2 saat ve S13 biraz daha uzun sürer, oda sıcaklığında 25 ° C 1 ve geliştirme, süresi ~ 1 hr. S10B köklerinin için tarif edilene benzer deneyler olabilir,S11-S13 folikül kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </li></ol> 4. Canlı Görüntüleme Sahne izolasyonu <ol><li> Çabucak enkaz folikülleri hareketli, IVEM medyada aşama izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak seçim floresan işaretleyici ifade geç evre foliküllerini (S10B-14) izole. </li><li> Yeni medya içine ilgi folikülleri taşıyın ve daha sonra bir lamel alt Petri plaka cam pipetle aktarın. Bu lamel alt bölgede kabarcıklar ama üzerinden dökülmemesi kalmaması medya eklemek için özen gösterin. </li><li> Daha uzun bir zaman atlamalı filmler için, bu Petri plakanın iç kenarı, su ile nemlendirilmiş bir rulo Kimwipe ekleyerek Petri plakası içinde nem sağlamak için bazen gereklidir. Üst kapağı yerleştirin. </li><li> Ters bir mikroskop görüntüsü. Ayrıntılı çözünürlüklü konfokal mikroskopi gerektirir. Bu görüntüleme, aydınlatma gücü, ve görüntüleme uzunluğu frekansını dengelemek için gerekli olduğunu, bu bağımsız olarak her l için çalıştım gerekecektirabeling aracı ve gelişim süreci. </li></ol> 5. Preparasyon mRNA izolasyonu için Aşama <ol><li> Grace ya IVEM medya ile ya aşamalı izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak bireysel sahne köklerinin izole. </li><li> Bir cam pipet kullanılarak, ortam ile yeni bir kuyu içine ilgilenilen tek tek aşamaları hareket, bir kerede bir çok aşamaları toplamak mümkündür. </li><li> 1 saat altında toplama saatleri tutun. 1.5 ml mikrofüj tüplerine, bir cam pipet ile, folikül hareket ettirin. </li><li> Köklerinin her pelet için bir mini-mikrosantrifüjde kısaca tüp spin. Çekti cam pipet (adım 3.4) kullanılarak dikkatlice tüm medya çıkarın. NOT: Bir tam boy mıkro kullanıyorsanız, düşük hızda köklerinin aşağı doğru döndürün. </li><li> TRIZOL 100 ul ekleyin ve bir plastik tokmak kullanılarak ~ 20 saniye boyunca elle eziyet. Mikrosantrifuj&#39;de tam hızda aşağı Spin ve herhangi topaklandı d rahatsız etmemek için dikkatli olmak, yeni bir 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp Trizol hareketebris. -80 ° C&#39;de saklayın </li><li> Follikül yeterli deney için elde edilinceye kadar tekrarlayın 5,1-5,5 adımları. Rutin, ~ 75 S10B, ~ 75 S12 ve S14 ~ 100 köklerinin RNA ~ 10 mikrogram verim. </li><li> Buz örnekleri çözülme. Bir mikrofuj tüpüne uygun olarak, örnek birleştirmek ve 800 ul kadar Trizol ses getirmek. Üretici tarafından yönlendirildiği gibi RNA izolasyonu ile devam edin. ÖNEMLİ: RNazsız DNase ile izole RNA tedavisi DNase&#39;ının unutmayın. </li></ol> 6. Western Blot için Sahne izolasyonu <ol><li> 100 ° C bir ısıtma bloğu ısıtın </li><li> Grace ya IVEM medya ile ya aşamalı izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak bireysel sahne köklerinin izole. NOT: Bu ampirik her özel protein gözlemlemek için gerekli olan nasıl belirli bir aşama folikül birçok belirlemek gereklidir. Derece olarak ifade edilen proteinleri de 1-3 S10B foliküllerinin / batı lekelerinin güçlü bir sinyal görmek için yeterlidir. Bununla birlikte, bunu yapmak için önemli olan birtemsili bir örnek, birden çok kadın folikülleri alıyor. Bu nedenle, belirli bir aşamasında 15-20 köklerinin genellikle toplanır. </li><li> Bir 1.5 ml mikrofüj tüpe bir cam pipet kullanarak, folikül hareket ettirin. (Adım 5.4) köklerinin pelet için bir mini-mikrosantrifüjde kısaca Spin. Dikkatle (adım 3.4) çekti cam pipet kullanarak ortamların tümünü çıkarın ve 1x PBS 50 ul ve 2x Laemmli tampon 50 ul ekleyin. </li><li> Plastik bir havan tokmağı ile 20 sn ~ için elle eziyet. NOT: Plastik havan yıkanarak batı örnekleri öğütme ve onları otoklav için tekrar edilebilir. </li><li> Isıtma bloğu içinde 10 dakika için örnekleri kaynatın. </li><li> Mikrosantrifuj&#39;de 15 saniye boyunca tam hızda buz ve spin kısaca Chill. Hemen -20 ° C &#39;de, bir SDS-PAGE jeli üzerine ya da mağaza yük ya NOT: örnekleri kaydedilirse, jel üzerine yüklemeden önce örnekleri reboil unutmayın. </li><li> , Standart protokolleri takiben western blot analizi yapın. </li></ol>

<ol>
	<li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament+cables+in+Drosophila+nurse+cells+are+composed+of+modules+that+slide+passively+past+one+another+during+dumping.">Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping.</a> J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).</li><li>Horne-Badovinac, S., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transit:+epithelial+morphogenesis+in+the+Drosophila+egg+chamber.">Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber.</a> Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).</li><li>McCall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggs+over+easy:+cell+death+in+the+Drosophila+ovary.">Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary.</a> Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).</li><li>Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+shell+game:+patterning+genes+and+morphological+change.">The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change.</a> Trends Genet. 21, 346-355 (2005).</li><li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+II.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49, 411-424 (2006).</li><li>Tootle, T. L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pxt:+a+cyclooxygenase-like+facilitator+of+follicle+maturation.">Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation.</a> Development. 135, 839-847 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Fascin+is+a+novel+downstream+target+of+prostaglandin+signaling+during+actin+remodeling.">Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Bianco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+modes+of+guidance+signalling+during+collective+migration+of+border+cells.">Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells.</a> Nature. 448, 362-365 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flytrap,+a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster.">Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+eggshell+production:+identification+of+new+genes+and+coordination+by+Pxt.">Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt.</a> PLoS. One. 6, e19943 (2011).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Drosophila folikül morfolojik ve moleküler analizlerin her ikisi için de idealdir, hücre tipleri çok az sayıda oluşmaktadır. Üstelik, yumurtalık yapısına, ortak bir kesme alanı ve en az eğitim ile folikül gelişiminin belirli aşamalarında çok sayıda elde etmek nispeten kolaydır. Her aşamada bir kısa zamansal pencereyi temsil gibi, sahne izolasyon bu evrede meydana gelişim süreçlerine önemli moleküler anlayışlar sağlayabilir. Örneğin, S10B, S12, S14 ve 18 sırasında me...

Her bir Drosophila yumurtalık 16 ovarioles, ya da sıralı olarak olgunlaşma yumurta odalar veya folikül zincirlerinin ~ oluşmaktadır. Her folikül tek oosit, 15 germ hattı türetilmiş hemşire veya destek hücreleri ve folikül hücreleri (Şekil 1A) olarak adlandırılan ~ 650 somatik hücrelerden oluşmuştur. Drosophila oogenez 1 geliştirme 14 morfolojik olarak tanımlanmış aşamaları ayrılmıştır. Folikül gelişiminin her aşaması nispeten kolay sahne özgü folikül önemli sayıda izole etmek için yapım, bir tek sinek içinde birçok kez görülmektedir. Oogenezisin (10B-14 Aşamaları) orta-geç aşamaları (Şekil 1) evre izolasyonu için özellikle uygundur. Aşama 10B (S10B) olarak, folikül tamamen (yani, uzunluğu, bir evre 14 (S14) folikül eşit olan, Şekil 1 ve Şekil 2H bakınız) uzatılmış ve folikül yarısı uzunluğu hemşire hücrelerden oluşmaktadırdiğer yarısı oosit (Şekil 1C) iken. Bu aşamada hücreler, hemşire kortikal aktin güçlendirilmesi ve aktin ipliklerin 2 paralel demetleri üreten, dramatik aktin yeniden geçer. Aynı zamanda, folikül hücreler popülasyonu, hemşire hücreleri, ve oosit arasında geçiş, merkezcil hücreleri olarak adlandırılan ve folikül hücrelerin iki dorsal grup dorsal uzantıları, embriyo 3 için boru şekilli solunum cihazları meydana göç geçmesi için belirtilen olmak . Hemşire bu embriyojenezinin (Şekil 1D) tamamlamak için gerekli faktörleri ile oosit sağlar hemşire hücre damping denilen bir süreç içinde oosit içine sitoplazmik içeriğini sıkma sonra sözleşme (S11), hücreler. Hemşire Hücreler daha sonra hücre ölümünü (S12-S13) 4 geçmesi ve folikül hücreler, yumurtaların 5 (Şekiller 1 E-G) salgılar ve desen. Böylece, oogenezisin sonu önemli gelişimsel An ile zengind morfogenetik süreçler. İzole orta-geç evre folikül (S10B-S14) ve moleküler analizlere dahil olmak üzere çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, aşamalı foliküllerden mRNA RT-PCR, mikrodizi için izole edilebilir, ya da RNA-seq analiz eder. Bu bir hediye, sadece birkaç hücre tipleri ile, kısa bir gelişimsel pencere içinde gen ifadelerine bakılması ve gen ekspresyon farmakolojik veya genetik ya pertürbasyonlarm nasıl değiştiğini belirlemek için izin verir. Aşama izolasyonu da western blotting ile protein bakmak için kullanılabilir. Bu belirli aşamalarında mutantlann karşı yabani tip protein ekspresyonu seviyesini ölçmek için izin verir, çünkü bu tür bir analiz önemlidir. Bir kullanımı olsa da immünofloresan flüoresans ölçümü nedeniyle piksellerin her algılama 6 lineer aralığında sıkı gereksinimleri daha az sağlam olan, benzer sonuçlar elde etmek için analiz eder. Buna ek olarak, western blot analizi, diğer bilgileri sağlayan bu tür birs protein çevrim sonrası modifiye edilir ya da belirli bir ek yeri izoform eksprese ise. Izole edilmiş hücre altı paya ayırma aşamaları da dahil olmak üzere, daha fazla veya coimmunoprecipitation protein saflaştırma için kullanılabilir. Aşama özgü folikül izolasyonu da in vitro tahliller gelişme 7 ve canlı-8 görüntüleme için kullanılabilir. İzole S10B-S13 folikül (aşağıya bakınız) basit bir kültür ortamı içinde S14 geliştirmek devam edecektir. Bu S10A folikülleri bu yazıda tartışılan kültür koşulları kullanılarak damping hemşire hücre yoluyla ilerleme olmayacağını dikkat etmek önemlidir. Biz okumak-çıkışları 7,9 olarak hemşire damping hücre ve gelişme ile aktin yeniden düzenleyen, hem de farmakolojik ve genetik, prostaglandinlerin rolünü tanımlamak için S10B in vitro geliştirme deneyleri kullandık. Benzer şekilde, daha sonraki gelişim aşamaları, aynı zamanda farmakolojik tedaviler veya genetik erkek etkilerini belirlemek için izole edilebilirBöyle merkezcil hücre göçü, dorsal apendiks göç / oluşumu 10, ve hemşire hücre ölümü gibi belirli süreçlere ipulations. Bu gibi deneyler, dominant etkileşim ekranlar veya tahlilleri yapmak için kullanılabilir, örneğin, PXT veya fascin tek mutasyonlar heterozigozite S10B in vitro gelişimi üzerine bir etkisi varken, çift heterozigot sergi hemşire hücre kusurları ve geliştirme 9&#39;daki bir blok boşaltmaması folikül. S10B-13 kültür geliştirebilir çünkü Ayrıca, bu süre esnasında meydana gelen işlemlerin tüm canlı görüntüleme ile gözlenebilir. Bu tür bir görüntüleme, sadece flüoresan probları ya da canlı görüntüleme boyalarla boyanmış köklerini ifade eden transjenik sinekleri kullanılarak (bir morfoloji toplam değişiklikleri sadece ilgi ise) iletilen ışık kullanılarak veya konfokal mikroskobu ile gerçekleştirilebilir. Canlı görüntüleme ölçüde gelişim süreçleri anlayışımızı ilerletmek için kullanılıyor. Nitekim, imagin canlıGeç evre köklerinin g dorsal uzantı göç bilgi, tubulogenesis 10 bir örnek genişletti. Biz damping hemşire hücre sırasında aktin dinamikleri dahil olmak üzere ek geç evre süreçleri, canlı görüntüleme, bu gelişimsel olayların yeni bakış açıları sağlayacak bekliyoruz. Bu S10A ve folikül gelişiminin erken aşamalarında kültüründe S14 haline devam ederken, gelişim bu dönemlerinde meydana gelen olaylar canlı görüntüleme (daha fazla bilgi için Tartışma bakın alternatif kültür koşullarında 11-14 ile mümkün olduğuna dikkat etmek önemlidir bilgisi). İşte biz ya in vitro gelişimi için geç dönem köklerinin izole etmek için ayrıntılı protokoller sağlamak ve canlı görüntüleme, veya moleküler analizleri (mRNA ve protein izolasyonu).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

Drosophila oogenez veya folikül gelişimi yaygın olarak karmaşık bir gelişimsel ve hücre biyolojik süreçlerin anlayışı ilerletmek için kullanılır olmuştur. Bu yöntemler kağıt orta-geç evre foliküllerini (Sahne 10B-14) izole ve gelişimsel zaman sıkı pencere sırasında meydana gelen moleküler ve morfolojik olaylara yeni bakış açıları sağlamak için bunları kullanmak için nasıl açıklar. İzole folikül gelişimi in vitro tahlilleri, canlı görüntüleme, mRNA ifade analizi ve proteinlerin western blot analizi de dahil olmak üzere deneysel teknikler, çeşitli için kullanılabilir. Sahne 10B (S10B) ya da daha sonra folikülleri kültür gelişimini tamamlayacak, bu bir gelişme belirli dönemlerinde ortaya çıkan süreçler üzerinde bu tür manipülasyonlar etkilerini tanımlamak için in vitro gelişimi ile genetik veya farmakolojik tedirginlikler birleştirmek sağlar. Bu folikülleri kültür gelişir çünkü Ayrıca, onlar ideal canlı görüntüleme çalışmaları için uygundur, Genellikle morfolojik olaylara aracılık yeni mekanizmalar ortaya hangi. İzole köklerinin aynı zamanda moleküler analiz için kullanılabilir. Örneğin, genetik düzensizliklerin neden gen ekspresyonunda değişiklikler belirli bir gelişimsel pencereler için tanımlanabilir. Ayrıca, folikül gelişiminin belirli bir aşamasında protein düzeyi, kararlılık, ve / veya sonrası tadilat devlet western blot ile analiz incelenebilir. Böylece, Drosophila köklerinin sahne özel izolasyon gelişimi ve morfojenezinin yaygın korunmuş süreçlerine zengin bir bilgi kaynağı sağlar.

Drosophila folikül gelişiminin belirli aşamaları izole zaman doğru bir şekilde farklı morfolojik aşamaları ayırt edebilmek için gereklidir. Hemşire hücreleri ve oosit her (Şekil 1B 1C karşılaştırıldığında) bu aşamada folikül yarısı uzunluğunu almak gibi bu, S10A ve S10B için biraz zordur. S10B köklerinin tam olarak uzatılmış ve bir S14 folikül (1 g ile karşılaştırıldığında Şekil 1C) uzunluğunda ve böylece eşit gibi A...

Watch this Scientific Journal Video about The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation at JoVE.com

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Orta-geç Drosophila köklerinin Aşama özgü izolasyon çeşitli amaçlar için yararlıdır. Bu tür foliküllerin gelişmesi in vitro tahliller ve canlı görüntüleme ile bağlanmak üzere genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlara olanak sağlar kültür gelişir. Buna ek olarak, bu tür folikül mRNA ve protein izole gibi moleküler genetik araştırmaları için kullanılabilir.

Of Utility Sahne özgü Orta-geç<em&gt; Drosophila</em&gt; Folikül İzolasyon

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K Görüntüleme.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Orta-geç Drosophila köklerinin Aşama özgü izolasyon çeşitli amaçlar için yararlıdır. Bu tür foliküllerin gelişmesi in vitro tahliller ve canlı görüntüleme ile bağlanmak üzere genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlara olanak sağlar kültür gelişir. Buna ek olarak, bu tür folikül mRNA ve protein izole gibi moleküler genetik araştırmaları için kullanılabilir. 