我々はプログラミングや原稿提案を博士クリス·ロジャース（タフツ大学）に感謝。私たちは、映像制作をサポートするためにアレックスジュリアーノとデボラ·リーに感謝します。 NSF大学院研究フェローシップと合成生物学でONRムリが提供する資金調達。

1。ロボットモデルの構築<ol><li>よくneuroethological文学で表現され研究にモデル生物を選択してください。彼らの比較的単純な神経系がよく研究されている、主に先天性の反射神経で構成されているため、無脊椎動物では、一般的に良い候補者を作る。我々はアメリカのロブスター、 ロブスター属americanusを使用して、このアプローチのデモンストレーションを行います。 </li><li>モデリングの目的のためによく研究反射的な行動を選択します。動物が反射的に爪接点は障害物回避を仲介しながら走流性を（水流の向き）引き出すためにアンテナの曲がりに応答するように我々は触角曲がりへと爪バンプ検出にロブスターの回答を選択しました。左右対称センサから神経接続をdecussatingに頼る簡易反射神経はよく研究1は、このタイプに適しています。 </li><li>神経を実行するために選択された行動のための適切なセンサをロボットのプラットフォームを構築したり、選択したネットワークシミュレーション。専用ロボットなどRoboLobster 12やスプロール（ゴキブリ）ロボット家族13として構成することができるが、ここでは実験的なプロセスを促進するために市販のキットを使用しています。テンプレート、モジュール式のコンポーネントと確立センサーを提供LEGOマインドストームNXT 2.0キットは、ロボットの急激な物理的な構築を可能にします。 </li><li>ステップ1.2で選択した行動の様式に一致するようにセンサーを選択するか、構築します。既成のレゴマインドストームキットのセンサーを使用することができたり、自作のセンサは14,15を設計することができる。私たちは、含まれているLEGOのタッチセンサーとNXTコネクタにスプライシングFlexPoint曲げセンサーから成るカスタム触角曲げセンサーを選択している。カスタム抵抗コネクタを構築するには、センサーのリードにNXTコネクタワイヤやハンダ、黒と白のケーブルを切った。 </li><li>モデリングpに対する仮説的なニューラルネットワークを見つけたり、開発する以前に発行されたneuroethological研究を使用urposes。文献はロブスター16〜ヤツメウナギ17から、種々のモデル生物の動作を説明するために、様々なニューラルネットワークが提案されている。機能的な神経ユニットが同定され、それらのシナプスの接続が理論化されるべきである。実験室の状況が許せば小説neuroethological実験も開発し、実装することができます。 </li></ol> 2。神経系のプログラミング<ol><li>数学のニューロンとシナプスモデルの方程式を実行するバーチャル·インストゥルメント（VIS）を作成するためにLEGO MINDSTORMS NXT用のLabVIEWモジュールと一緒にLabVIEWソフトウェアを使用してください。任意の発行されたモデルを使用することができますが、我々は離散時間マップベース（DTM）モデル18をお勧めします。神経発火出力レジームの様々を維持しながら、これは計算効率のリアルタイム動作を可能にする。二つの制御パラメータ、 アルファとシグマは 、トニを含む多様な神経の出力を生成するためにシミュレートされたニューロンのダイナミクスを決定Cスパイク、混沌とした焼成、破裂および固有沈黙。このニューロンモデルのためのレゴマインドストームは、LabVIEWのVI、ここでオンラインで見つけることができます： <a href="http://myfiles.neu.edu/blustein.d/neurobots" target="_blank">http://myfiles.neu.edu/blustein.d/neurobots</a> </li><li>ネットワークが反復更新されますように、WhileループにVIを配置します。 </li><li>シナプス後ニューロンにシナプスを通じてシナプス前ニューロンスパイク出力を接続します。 </li><li>次の計算サイクルにシフトレジスタを通してパラメーターを更新繰り返し渡す。 DTMモデルアップデート速い（x）と計算の次の反復に渡され、低速（y）を力学変数。 </li><li>ネットワークの特性を定義するためにシナプスパラメータを設定します。それぞれのシナプスは、シナプス強度（gsyn）、緩和率（ ガンマ ）と、逆転電位（XRP）はシナプス動作を決定DTMモデル方程式の係数である。 gsynの値は、マルチです0.0（効果なし）から1.0（100％効果）に至るまで、スパイクイベントからシナプス電流の効果の大きさを決定プライヤー。 ガンマの値は0.0（完全崩壊）から1.0（無減衰）に至るまで、関係なくスパイクイベントのシナプス電流の減衰率を決定乗数です。 XRPの値は、興奮と抑制を表す負の値を表す正の値を-3.0〜3.0、通常の範囲の値、シナプスの興奮や抑制のレベルを決定します。値は、特定のネットワークの特性に合わせて調整することができます。 γ= 0.95、gsyn = 0.60とXRP = 2.2（興奮性シナプス）または-1.8（抑制性シナプス）：ここでは、次の設定を使用します。 </li><li>ベースラインニューロン活動を変更するためにアルファとシグマの制御パラメータを調整します。多様な制御パラメータのモデルのダイナミクスは、 アルファは 、一般的に他の場所で18に詳細に記載されているが</em&gt; &lt;4、低シグマ値または高シグマ値のスパイク強壮のために本質的にサイレント神経活動を生成します。 &quot;低&quot;および&quot;高&quot; シグマ値の間の遷移は、一般に、 アルファ値に応じて、-1.0〜1.0の間で発生する。ニューロン活動を破裂はアルファシグマ値がゼロに近いです&gt; 4のために制作されています。ここでは、α= 4.05とσ= -3.10を使用しています。 </li><li>あなたのネットワークに入力センサ情報をLabVIEWのVIをを使用してください。設けられたセンサの場合、VIは、マインドストームのLabVIEWモジュール内ですでに利用されています。カスタム抵抗センサについては、プログラミング·フレームワークとして、光センサーのVIを使用しています。自作センサーの作成 ​​に関する情報は、他の場所で14見つけることができます。 </li><li>神経活動を可視化するLabVIEWプログラムのフロントパネルにグラフィカルなチャートを挿入します。 </li><li>一時的に手動でセンサーを操作するために、前面パネルのコントロールボックスとセンサー入力を置き換えるニューラルネットワークに行く情報。 </li><li>神経回路網を実行し、手動で多様な感覚入力を提示するには、フロントパネル·コントロールを調整します。既知の条件のために予測され、ネットワークが質的に機能していることを確認します。 </li><li>ニューロンとシナプスのパラメータを変更することにより、必要に応じてネットワークを調整します。ネットワークのチューニングで最初の試みは、さまざまなシナプスのシナプス強度（gsyn）を変更することによって行われるべきである。他のパラメータも同様に調整する必要があります。 </li><li>定性的な精度でネットワーク機能したら、VIのセンサー入力、フロントパネルのコントロールボックスを交換してください。 </li></ol> 3。神経系シミュレーションテスト<ol><li>同様の条件下で、動物やロボットを観察する中で制御された環境を設定します。我々は岩の障害物（ 図1）を含む長方形のタンクを使用しています。タンクは、同じ空間内LEGOロボットを収容するために空にすることができる。 </li><li>マウントAVIDEOのカメラのオーバーヘッドは、動物/ロボットの動作を記録します。被写体と背景のコントラストが自動追尾を可能にするために高くなっていることを確認します。我々はテストタンク白色の底を描いた。 </li><li>制御された環境とビデオ記録行動の動物を配置します。ロボットのものと一致するようにロブスターの感覚能力を制限してください。ここでは、アルミ箔のマスクで目を覆うと淡水19と化学受容器をdeafferentingでロブスターの感覚機能を制限します。 </li><li> LEGOロボットを（必要に応じて水を除去）に合わせて、同じ管理された環境でロボットを実行するための環境を調整します。 </li><li>自動的に標本上のマーカーを追跡するためにMATLABスクリプトを使用してください。我々はMouseLabTracker 20を使用しています。 </li><li>動物やロボットの動きのベクトルプロットを作成し、比較する。 </li><li>電子のどのように異なる側面を観察するために神経系と繰り返し3.3から3.6に変更神経系は、ロボットの動作に影響を与えます。ここでは、ロブスターのそれに比べて爪バンプセンサーニューロン及びモータシステムとモニタロボットの性能とのシナプスの強さを調整します。また、テストの分野で感覚の条件が変更され、効果はロボットと動物で観察することができます。例えば、ここで説明する分野は、異なる水の流量を施すことができる。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

biorobotic神経系シミュレーション実験を開始するときに、従うべきいくつかの重要なガイドラインがあります。右のモデル生物を選択することが重要です：取得し、維持することは容易である生物を選ぶ。彼らは通常の実験のための制度の承認を必要とせず、それらの畜産ニーズはしばしば脊椎動物のものよりも少ない過酷であるため、無脊椎動物が理想的です。科学的な観点から見ると、?...

過去100年以上の神経生理学的研究は飛躍的に神経系の構造と機能の知識を広げています。しかし、これまでの神経系の研究の大部分は、単離された調製物又は拘束被験者の使用に依存している。自由に動物2-5行動から神経活動を記録するために多くの成功した努力がなされているものの、bioroboticアプローチは、システムレベルの神経科学仮説6をテストするために神経系の操作を可能にするための貴重なツールを提供します。ロボット上で動作シミュレー神経系は、実験的に操作され、物理的な世界にソフトウェアモデリングの拡張を可能にすることができます。このアプローチは、よく学問の世界7,8に実装されているが、仮説検証のためのバイオミメティックロボットを構築するプロセスは高価で時間がかかります。我々は、市販のロボットkを用いbioroboticアプローチを実行するための方法を提示するそれ（レゴマインドストームNXT 2.0）。この方法の目的は、ロボット9またはバイオハイブリッド型10具現ニューラルネットワークシミュレーションにシステムレベル神経仮説をテストするための迅速かつ効率的な方法を提供することである。仮説から実験へのプロセスを加速すると、研究の生産性を向上させます。シンプルLEGOマインドストームプラットフォームは、我々はモデル生物としてアメリカンロブスター（ ロブスター属americanus）を使用して実証バイオミメティックセンサーとニューラルネットワークのためのテストベッドを提供しています。学生は自分のロボット11神経系を設計し、操作することができたような方法はまた、教室で強力なハンズオン教育ツールを提供しています。

designing and implementing nervous system simulations on lego robots

私たちは、システムレベルの神経科学の仮説をテストするために、市販のレゴマインドストームNXTロボットプラットフォームを使用するための手法を提案する。メソッドの最初のステップは、適切なモデル生物の特定の反射的行動の神経系シミュレーションを開発することで、ここではアメリカのロブスターを使用しています。 （交差点）神経接続をdecussatingによって仲介外受容反射がBraitenbergによって記述とNXTプラットフォームを使用して調査のために特に適しているように近づいたり離れて刺激から動物のタクシーを説明することができます。1神経系シミュレーションをLEGOでLabVIEWソフトウェアを使用してプログラムされているマインドストームプラットフォーム。神経系が適切に調整されると、行動実験はロボットに、同一の環境条件下で動物に実行されます。試料が経験する感覚環境を制御することにより、行動の出力の違いを観察することができる。これらの違いは、特定のdeficiencを指すことがあります神経系モデルにおけるIESと検討中の特定の行動のためのモデルの反復をお知らせするのに役立つ。この方法は、電子神経系の実験的操作を可能にし、シンプルな生得的な反射的行動の神経生理学的基盤に関する特に神経科学仮説を探索する方法として機能します。レゴマインドストームNXTキットは予備バイオミメティックロボット制御方式をテストする上で手頃な価格で効率的なプラットフォームを提供します。アプローチもよくハンズオン問い合わせベースバイオロボティクスのカリキュラムのための基盤として機能する、高校の教室に適しています。

その神経系にロブスターの爪からの入力は、新規環境で障害交渉を仲介する。 図1は、LEGOロボット（ 図1A）とテストの分野でロブスター（ 図1B）の動作を分析するために使用されるビデオのスクリーンショットを示しています。テストアリーナは水がロボット試験用タンクから空にしたことを除いて、動物やロボットテスト間で変更されていないされま?...

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Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

LEGOマインドストームロボット·プラットフォーム上のニューラルネットワークモデル化へのアプローチが提示される。方法は、研究室や教室の両方で無脊椎動物神経科学研究のためのシミュレーションツールを提供します。この手法は、バイオミメティックロボット制御原理の調査を可能にします。

LEGOロボットの神経系シミュレーションの設計と実装

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K ビュー.  Northeastern University. LEGOマインドストームロボット·プラットフォーム上のニューラルネットワークモデル化へのアプローチが提示される。方法は、研究室や教室の両方で無脊椎動物神経科学研究のためのシミュレーションツールを提供します。この手法は、バイオミメティックロボット制御原理の調査を可能にします。

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

神経科学

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

無傷のゴキブリ神経系の神経回路の録音

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

嗅覚検索用自律型ロボットに昆虫Electroantennogramセンサを用いた

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

腸神経系のその場のCa 2+イメージングに

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...