우리는 프로그래밍 및 원고 제안 박사 크리스 로저스 (Tufts 대학)을 주셔서 감사합니다. 우리는 비디오 제작 지원을 위해 알렉스 아노과 데보라 리 감사합니다. 자금은 NSF 대학원 연구 친목 및 합성 생물학 ONR 무리에 의해 제공.

1. 로봇 모델을 구축 <ol><li> 잘 neuroethological 문학에서 표현되는 연구하는 모델 생물을 선택합니다. 비교적 간단한 신경 시스템이 잘 연구되어 주로 타고난 반사 신경으로 구성되어 있기 때문에 무척추 동물은 일반적으로 좋은 후보를합니다. 우리는 미국의 랍스터, Homarus americanus를 사용하여이 방법을 보여줍니다. </li><li> 모델링을 위해 잘 공부 재귀 동작을 선택합니다. 동물이 반사적으로 발톱 연락처 장애물 회피를 중재하면서 rheotaxis을 (물 흐름 방향) 유도하는 안테나의 굽힘에 응답으로 우리는 촉각 굴곡과 발톱 범프 탐지 가재 님의 답변을 선택하셨습니다. 양측 대칭 센서에서 신경 연결을 decussating에 의존하는 단순한 반사가 잘 연구 1의이 유형에 적합합니다. </li><li> 신경을 실행하기 위해 선택한 행동에 대한 적절한 센서와 로봇 플랫폼을 구축하거나 선택네트워크 시뮬레이션. 전용 로봇이 같은 RoboLobster 12 쪽을 (바퀴벌레) 로봇 가족 13로 구성 될 수 있지만, 우리가 실험 과정을 신속하게 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용합니다. 템플릿, 모듈 형 구성 요소 및 설립 센서를 제공 LEGO 마인드 스톰 NXT 2.0 키트, 로봇의 급속한 물리적 구성 할 수 있습니다. </li><li> 선택하거나 선택 단계 1.2에서 선택한 행동의 양식에 맞게 센서를 구축 할 수 있습니다. 미리 만들어진 레고 마인드 스톰 키트의 센서를 사용하거나 사제 센서는 14,15을 설계 할 수 있습니다. 우리는 포함 된 LEGO 터치 센서 NXT 커넥터 접합 FlexPoint 벤드 센서로 구성된 사용자 정의 촉각 굽힘 센서를 선택했습니다. 사용자 정의 저항 커넥터를 빌드하려면, NXT 커넥터 와이어 및 솔더 센서의 리드에 검은 색과 흰색 케이블을 잘라. </li><li> 모델링 P에 대한 가상의 신경 네트워크를 찾거나 개발하기 이전에 출판 된 neuroethological 연구를 사용urposes. 문학 칠성 장어 17 가재 16 일부터 다양한 모델 생물의 행동을 설명하기 위해 다양한 신경망을 제안하고있다. 기능적 신경 단위가 식별과 시냅스 연결을 이론화해야합니다. 실험실 상황이 허용하는 경우 새로운 neuroethological 실험도 개발하고 구현할 수 있습니다. </li></ol> 2. 신경 시스템 프로그래밍 <ol><li> 수학 뉴런과 시냅스 모델에 대한 수식을 실행하는 가상 악기 (VI를) 만들 수 LEGO MINDSTORMS NXT는 LabVIEW 모듈과 함께 LabVIEW 소프트웨어를 사용합니다. 게시 된 모델을 사용할 수 있지만, 우리는 (DTM)지도 기반 모델 18 이산 시간을 권장합니다. 신경 소성 출력 정권의 다양성을 유지하면서이 계산 효율적인 실시간으로 작업 할 수 있습니다. 두 개의 제어 변수, 알파와 시그마, 토니 등 다양한 신경 출력을 생성 시뮬레이션 신경 세포의 역학을 결정C 스파이크, 혼란 발사, 파열 및 고유 침묵. 이 신경 세포 모델 LEGO 마인드 스톰에 대한 단계별 설명, LabVIEW VI는 여기에서 온라인으로 볼 수 있습니다 : <a href="http://myfiles.neu.edu/blustein.d/neurobots" target="_blank">http://myfiles.neu.edu/blustein.d/neurobots</a> </li><li> 장소 네트워크를 반복적으로 업데이트 할 수 있도록 While 루프에 VI를. </li><li> 시냅스 후 뉴런의 시냅스를 통해 시냅스 신경 세포의 스파이크 출력을 연결합니다. </li><li> 반복적 변화를 통해 매개 변수를 갱신 통과하면 다음 계산주기에 등록합니다. DTM 모델 업데이트 빠른 (x)와 계산의 다음 반복에 전달되는 속도가 느린 (Y) 동적 변수. </li><li> 네트워크 특성을 정의하는 시냅스 매개 변수를 설정합니다. 각 시냅스를 들어, 시냅스 강도 (gsyn), 이완 속도 (감마), 그리고 반전 가능성 (XRP)는 시냅스 동작을 결정 DTM 모델 방정식의 계수이다. gsyn의 값은 다 있습니다0.0 (효과 없음)에서 1.0 (100 % 효과)에 이르기까지 스파이크 이벤트의 시냅스 전류 효과의 크기를 결정합니다 플라이어. 감마 값은 0.0 (완전 분해)에서 1.0 (아무 붕괴)에 이르기까지,에 관계없이 스파이크 이벤트의 시냅스 전류의 붕괴의 속도를 결정하는 승수입니다. XRP의 값은, 여기 또는 시냅스 억제의 수준을 결정 -3.0에서 흥분과 억제를 나타내는 음수 값을 나타내는 양의 값을 3.0으로 일반적으로 범위 값입니다. 값은 특정 네트워크 특성을 조정할 수 있습니다. 여기에서 우리는 다음과 같은 설정을 사용 감마 = 0.95, gsyn = 0.60 XRP = 2.2 (흥분성 시냅스) 또는 -1.8 (억제 시냅스). </li><li> 기본 신경 세포의 활동을 수정하는 알파 시그마 제어 매개 변수를 조정합니다. 다양한 제어 매개 변수에 대한 모델의 역학 알파는 일반적으로 다른 18 자세히 설명되지만 </em&gt; &lt;4 낮은 시그마 값이나 높은 시그마 값 급상승 토닉에 대한 본질적으로 침묵 신경 활동을 생산하고 있습니다. &#39;저&#39;와 &#39;높은&#39;시그마 값 사이의 전환은 일반적으로 알파 값에 따라 -1.0에서 1.0 사이에 발생합니다. 신경 세포의 활동을 파열하는 것은 알파에 대한 생산&gt; 4 시그마 값이 0에 가까울 때. 여기에서 우리는 알파 = 4.05 시그마 = -3.10을 사용합니다. </li><li> 네트워크에 입력 센서 정보에 대한 단계별 설명, LabVIEW VI를 사용합니다. 제공된 센서의 경우, VI는이 마인드 스톰의 LabVIEW 모듈 내에서 이미 사용할 수 있습니다. 사용자 정의 저항 센서, 프로그래밍 프레임 워크로 가벼운 감지기 VI를 사용합니다. 사제 센서를 만드는 방법에 대한 정보는 다른 14 찾을 수 있습니다. </li><li> 신경 활동을 시각화하는 LabVIEW 프로그램의 전면 패널에 그래픽 차트를 삽입합니다. </li><li> 일시적으로 수동 센서를 조작하기 위해 전면 패널 컨트롤 박스와 센서 입력을 대체신경 네트워크로가는 정보를 제공합니다. </li><li> 신경 네트워크를 수동으로 실행하여 다양한 감각 입력을 제시 전면 패널 컨트롤을 조정합니다. 네트워크가 질적으로 알려진 조건에 대한 예측 작동하는지 확인합니다. </li><li> 신경 세포와 시냅스 매개 변수를 변경하여 필요에 따라 네트워크를 조정합니다. 튜닝의 첫 번째 시도는 네트워크는 다양한 시냅스의 시냅스 강도 (gsyn)을 변경하여 수행해야합니다. 다른 매개 변수도 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 질적 정확도를 가진 네트워크 기능을하면, VI는 센서 입력과 전면 패널 컨트롤 박스를 교체하십시오. </li></ol> 3. 신경계 시뮬레이션 테스트 <ol><li> 유사한 조건 하에서 동물과 로봇을 관찰 할 수있는 통제 된 환경을 설정합니다. 우리는 바위 장애물 (그림 1)를 포함하는 직사각형 탱크를 사용합니다. 탱크는 같은 공간에있는 레고​​ 로봇을 수용하기 위해 비울 수 있습니다. </li><li> 마운트 AVIDEO 카메라 오버 헤드가 동물 / 로봇 동작을 기록합니다. 피사체와 배경 사이의 대비가 자동 추적을 허용하도록 고 있는지 확인하십시오. 우리는 시험 탱크 흰색 바닥을 그렸다. </li><li> 통제 된 환경 및 영상 기록 동작의 동물을 놓습니다. 로봇과 일치하는 가재의 감각 기능을 제한해야합니다. 여기에서 우리는 알루미늄 호일 마스크 눈을 덮고 담수 19와 화학 수용체를 deafferenting하여 가재의 감각 기능을 제한합니다. </li><li> LEGO 로봇 (필요한 경우 물을 제거) 한 벌과 같은 통제 된 환경에서 로봇을 실행하는 환경을 조정합니다. </li><li> 자동 시료에 마커를 추적하기 위해 MATLAB 스크립트를 사용합니다. 우리는 MouseLabTracker 20을 사용합니다. </li><li> 동물과 로봇의 움직임 벡터 플롯을 생성 뛰기. </li><li> 신경계와 전자의 방법을 다양한 측면을 관찰하는 단계를 반복 3.3-3.6를 수정신경계는 로봇의 동작에 영향을 미칩니다. 여기에서 우리는 새우에 비해 발톱 범프 센서 뉴런과 모터 시스템 모니터 로봇의 성능 사이의 시냅스 강도를 조정합니다. 또한, 테스트 분야에서 감각 상태를 수정하고 효과는 로봇과 동물에서 관찰 할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에 설명 된 분야는 다른 물 유량에 노출 될 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

biorobotic 신경계 시뮬레이션 실험을 시작할 때 따라야 할 몇 가지 중요한 지침이 있습니다. 오른쪽 모델 생물을 선택하는 것은 매우 중요합니다 : 획득하고 유지하기 쉬운 유기체를 선택합니다. 그들은 일반적으로 실험에 대한 기관의 승인을 필요로하지 않는 그들의 축산 요구는 종종 척추 동물에 비해 덜 요구하기 때문에 무척추 이상적입니다. 과학적인 관점에서, 21를 테스트 가설을 그?...

지난 100 년 동안 신경 생리 학적 연구는 대단히 신경계의 구조와 기능에 대한 지식 확대했다. 그러나 현재까지 신경계 연구의 대부분은 고립 된 준비하거나 억제 주제의 사용에 의존하고있다. 자유롭게 동물 2-5 행동의 신경 활동을 기록하는 많은 성공적인 노력이되었지만, biorobotic 접근 방식은 시스템 레벨의 신경 가설는 6 테스트하기 위해 신경 시스템을 조작 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 로봇에 운영 시뮬레이션 신경 시스템을 실험적으로 조작하고 물리적 세계에 대한 소프트웨어 모델링의 연장을 허용 할 수 있습니다. 이 방법은 물론 학계 7,8에서 구현되었지만 가설 테스트를위한 생체 모방 로봇을 구축하는 과정은 비용과 시간이 소요될 수 있습니다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 로봇 K를 사용하여 biorobotic 방법을 실행하는 방법을 제시그 (LEGO 마인드 스톰 NXT 2.0). 이 방법의 목적은 로봇 9 또는 바이오 하이브리드 10 구현 신경망 시뮬레이션에서 시스템 수준의 신경 가설을 테스트하기 위해 신속하고 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 가설의 실험 과정을 가속화하여 연구 생산성을 향상시킵니다. 간단한 레고 마인드 스톰 플랫폼은 우리가 모델 생물로 미국 가재 (Homarus americanus)를 사용을 보여주는 생체 모방 센서와 신경 네트워크를위한 테스트 베드를 제공합니다. 방법은 또한 학생들이 자신의 로봇을 11 설계 및 신경 시스템을 조작 할 수있는 교실에서 교육 도구 손에 강력한를 제공합니다.

designing and implementing nervous system simulations on lego robots

우리는 시스템 수준의 신경 가설을 테스트하기 위해 상업적으로 이용 가능한 LEGO 마인드 스톰 NXT 로봇 플랫폼을 사용하는 방법을 제시한다. 메서드의 첫 번째 단계는 적절한 모델 생물의 특정 반사적 행동의 신경 시스템 시뮬레이션을 개발하는 것입니다, 여기에 우리가 미국의 랍스터를 사용합니다. (교차점) 신경망 연결을 decussating에 의해 중재 Exteroceptive 반사 신경 Braitenberg에 의해 설명 및 NXT 플랫폼을 사용하여 조사를 위해 특히 적합으로 방향 또는 멀리 자극에서 동물의 택시를 설명 할 수 있습니다. 1 신경계 시뮬레이션 LEGO에서 LabVIEW 소프트웨어를 사용하여 프로그래밍됩니다 마인드 스톰 플랫폼입니다. 신경계가 제대로 조정되면, 행동 실험은 로봇과 동일한 환경 조건에서 동물에 실행됩니다. 표본 경험 한 감각 환경을 제어하여, 행동 출력의 차이를 관찰 할 수 있습니다. 이러한 차이는 특정 deficienc을 가리킬 수 있습니다그리고 신경계 모델 이거는 연구중인 특정 행동에 대한 모델의 반복을 알리는 역할을한다. 이 방법은 전자 신경계의 실험 조작 할 수 있으며 특히 간단한 타고난 반사 행동의 신경 생리 학적 기초에 대한 신경 과학의 가설을 탐구하는 방법으로 역할을합니다. 레고 마인드 스톰 NXT 키트는 예비 생체 모방 로봇 제어 방식을 테스트하기에 저렴하고 효율적인 플랫폼을 제공합니다. 접근 방식은 또한뿐만위한 토대 역할을 손에 탐구 기반 바이오 로보 공학 교육 과정 고등학교 교실에 적합합니다.

의 신경 시스템에 가재의 발톱에서 입력은 새로운 환경에서 장애물 협상을 중재. 그림 1은 LEGO 로봇 (그림 1A) 및 테스트 분야에서 랍스터 (그림 1B)의 동작을 분석하는 데 사용되는 비디오의 스크린 샷을 보여줍니다. 시험 분야는 물이 로봇 시험을위한 탱크에서 비운 것을 제외하고는 동물과 로봇 테스트 사이에 수정되지 않은되었다. 영?...

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Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

레고 마인드 스톰 로봇 플랫폼의 신경망 모델링 방법이 제시되어 있습니다. 방법은 무척 신경 과학 연구 실험실 모두에서 연구와 교실 시뮬레이션 도구를 제공합니다. 이 기술은 생체 모방 로봇 제어 원리의 조사를 할 수 있습니다.

LEGO 로봇에 신경 시스템 시뮬레이션을 설계 및 구현

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K 조회수.  Northeastern University. 레고 마인드 스톰 로봇 플랫폼의 신경망 모델링 방법이 제시되어 있습니다. 방법은 무척 신경 과학 연구 실험실 모두에서 연구와 교실 시뮬레이션 도구를 제공합니다. 이 기술은 생체 모방 로봇 제어 원리의 조사를 할 수 있습니다.

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

연구

신경과학

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

신경 회로 녹화 본래대로 바퀴벌레 신경계에서

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

후각 검색을위한 자율 로봇에 곤충 Electroantennogram 센서를 사용하여

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...