この作品は、健康の研究のフェーズ1臨床医科学者賞（AG）のカナダの協会および癌研究協会（AG）からの営業助成金によって支えられている。著者らは、このプロジェクトの彼のサ​​ポートのためのドクター·ジョン·ディックに感謝しています。

プロトコルの概略図を図1に示す。 1。人間のHCCサンプルの処理書面による患者の同意を得て、制度的な研究倫理委員会の承認を得て初代ヒトのHCC検体を入手します。これらのプロトコルは、人類の福祉のためのすべて、制度、国、国際的なガイドラインを遵守して大学健康ネットワーク研究倫理委員会から承認を得て我々の施設で実施されてきた。 適切なサンプルは、臨床目的のために採取された後に外科的処置の後、できるだけ早く新鮮HCC検体を収集します。理想的には、これは、患者からの組織の除去後30分以内に行われるべきである。 図2に示すように、腫瘍の中央部分が壊死してもよいように、腫瘍の周囲から得られた少なくとも1cm 3の試料は、最適である。従来、このような放射線、化学療法、またはアブレーションなどの任意の切除処置を受けていない腫瘍は、腫瘍細胞が生存している可能性を最大にするために好ましい。バイオハザード品目の標準個人用保護プロトコルに従って、一次ヒト組織を処理します。無菌技術を使用して、クラスIIバイオセーフティキャビネット内の腫瘍組織および細胞調製のすべての実験室の操作を実行します。 <ol><li> 4℃で10〜25ミリリットルの無血清ダルベッコ改変イーグル培地/ハムF12で、新鮮な肝細胞癌サンプルを置き、即時処理し、マウスに異種移植用組織片および/または細胞の調製のために研究室に氷上に移す。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、100ミリメートルのX 20ミリメートルペトリ皿または他の適切な滅菌作業面に腫瘍サンプルを置く。 10番の外科用メスの刃を使用して約2〜3mm程度の断片に腫瘍サンプルを分割する。この時点では、スナップインを凍結またはホルマリン固定Sを検討OME腫瘍他の実験のための断片または必要に応じて分析しています。 </li><li>腫瘍断片の異種移植のために、断片が沈めたままにできるように、十分なマトリゲルを含む1つ以上のマイクロ遠心管にHCC断片の一部を配置する。氷の上でこれらのチューブを保管してください。 </li><li>腫瘍細胞懸濁液の調製のために、残りのHCC組織にできるだけミンチし、細分化した組織の体積に応じて50mlコニカルチューブ中DMEM-F12の5〜10 mlで混合するために、外科用メスの刃を使用する。 </li><li>ミリリットル200単位/最終濃度コラゲナーゼタイプIVおよびディスパーゼIIを追加し、0.8単位/それぞれミリリットル。 25ミリリットルピペットを用いてよく、上下の混合物をピペット。 </li><li>チューブを密封し、腫瘍組織の柔軟性に依存して30〜60分間、5％炭酸ガスインキュベーター中37℃で、ステップ1.6からの混合物をインキュベートする。酵素消化の進捗状況を評価するように、数回ごとに10分までの混合物をピペットで。 </li><li>ディの後輻輳は、100μmの細胞濾過器腫瘍ソリューションを渡し、完了です。穏やかに通過する腫瘍細胞の最大数を可能にするための25mlのピペットチップを用いて細胞ストレーナーの残りの組織をマッシュ。 15ミリリットルコニカルチューブ内の歪んだ細胞懸濁液を収集します。 </li><li> 4℃で5分間1,200 rpmでの腫瘍細胞懸濁液を遠心分離</li><li>優しく上清をデカント。ペレットのサイズに応じて、氷冷1×赤血球（RBC）溶解緩衝2-5ミリリットル追加し、穏やかに上下にピペッティングペレットを再懸濁する。 5分間氷上に保管してください。 </li><li> RBC溶解液を洗い流すために、4℃で5分間、1,000 rpmで15ミリリットル遠心全量をDMEM-F12を追加します。 </li><li>優しく上清を除去し、DMEM-F12でのRBCのない腫瘍細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>手動または自動細胞カウンターでパンブルー排除を用いて生細胞を数える。 </li><li>所望numbeを含む遠心腫瘍細胞のアリコート注射のための細胞のrは、上述したように、30の氷冷マトリゲルμlを、氷上でストアに得られた細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol> オプション：1.11ステップの後、我々は日常的に、バルク腫瘍細胞懸濁液からのヒトCD45 +細胞（白血球）を枯渇させる、及び/又はフローサイトメトリーまたは免疫磁気ビーズを用いて腫瘍細胞のサブセットを精製する。これらの技術のための詳細なプロトコールは、関連する抗体、ビーズ、およびフローサイトメーターの製造業者によって記載されている。 注：上述のプロトコルは、ステップ1.1において、一次ヒトHCC組織に対する異種移植組織に置き換えて、連続移植を行うためにマウスから採取したヒト腫瘍異種移植片を処理するために使用することができる。この状況では、工程1.11の後、我々は日常的に、マウスH2K組織適合抗原に対する抗体を用いて細胞懸濁液からマウス細胞を枯渇させる浸潤。 2。異種移植制度的動物管理委員会によって承認されたプロトコルに準拠したすべての動物の手続きを行っています。本明細書に記載の手順は、すべての関連する規制や制度機関、規制、ガイドラインに沿っやコンプライアンスの大学健康ネットワーク動物実験委員会の承認を受け、特定の動物への使用議定書の下で完了している。 小動物への吸入揮発性麻酔薬を送達するための機器は、動物施設や研究機関の標準的な操作手順に従って利用しなければならない。クラスIIバイオセーフティキャビネット内で無菌操作し、滅菌器具を用いて、すべての外科的処置を行う。非肥満糖尿病重症複合免疫不全を利用（NOD / SCID）または6〜8週齢の雌雄のマウスのNOD / SCID /インターロイキン2受容体γ鎖のヌル（NSG）の株（ジャクソン研究所、メイン州バーハーバー） 9,10。これらのマウスは免疫不全動物に適した無菌状態を提供することが可能な施設で飼育し、維持しなければならない。 1リットル/酸素の分で5％（V / V）吸入イソフルランを供給室で手術のためのマウスを準備します。角膜とつま先反射の消失、動物（S）であるまで麻酔を維持。皮下異種移植のために、動物の背部上の1つまたは複数の小領域（単数または複数）を剃り、70％エタノールで皮膚を清潔にする。肝内異種移植のために、ダウン鼠径部への腋窩から動物（S）の腹胸部と腹部を剃り、70％エタノールで皮膚を清潔にする。 2.1腫瘍断片の皮下移植<ol><li>マウスピースで吸入イソフルラン麻酔（2％（V / V）を1L /分のO 2）を維持し、発生しやすい、麻酔したマウスを置きます。外傷性傷害から動物の目を保護する涙 - ゲルを適用します。 </li><li>ベタジンで背剃毛面積（S）を殺菌する外科スクラブを70％エタノールに続いて、最後にポビドンヨード溶液による。 </li><li>無菌鋭いハサミで5mmの皮膚切開を加えます。 </li><li>皮下空間に静かに閉じ鈍いはさみを挿入し、腫瘍フラグメントを収容するのに十分な大きさのポケットを開発するために静かに広がった。 </li><li>無菌細いピンセットを用いて皮下ポケットにステップ1.3で作成腫瘍断片を挿入します。 </li><li>縫合糸またはクリップを使用して皮膚切開を閉じます。 </li><li>以下に説明するように、マウスに術後ケアを提供。 </li></ol>腫瘍細胞の皮下注射2.2 <ol><li>ステップ2.1.1と2.1.2で説明したように動物を準備します。 </li><li>針29 G 1/2インスリン注射器にステップ1.13で作成マトリゲル中の腫瘍細胞の懸濁液をロードします。 </li><li>皮下空間に針を挿入し、注射器の内容物を排出する。離れて皮下平面に沿って針数mm FRを進めるオム皮膚穿刺部位は、ニードルの引き抜き時の穿刺部位からの腫瘍細胞懸濁液の漏れを防止する。 </li><li>以下に説明するように、マウスに術後ケアを提供。 </li></ol> 2.3腫瘍断片の肝内移植<ol><li> 1ミリリットルの注射器の針で27 G 1/2を使用して、手術中の流体の損失を補償するために、麻酔した動物の首の背中の滅菌生理食塩水の皮下に350μlの管理。鎮痛のため、1ミリリットルの注射器27のG 1/2-in針を使用して、動物の腹部に皮下ブプレノルフィン（0.1 mg / kgの）を含む無菌生理食塩水350μlの管理。 </li><li>メンテナンスを吸入イソフルラン麻酔（2％（V / V）を1L /分のO 2）を提供するためにマウスピースの内側に位置し、鼻と口に予熱したパッドの上にマウス仰臥位に配置します。 </li><li>手足を拡張し、露光を最適化するために、操作面にテープで固定し腹側腹部と胸部。 </li><li>可視化を最適化するために、拡大ランプの下の手順を実行します。 </li><li>そして最後にポビドンヨード液で70％エタノールに続いてベタジン外科スクラブと腹側腹部と胸部に剃毛した皮膚を殺菌。 </li><li>無菌鋭いハサミを使用することで、横方向の両側性肋骨下の皮膚切開を行い、肝臓全体の適正露出を可能にするために、腹腔に入ること筋肉層を分ける。 </li><li>剣状突起上の皮膚にステッチを配置し、肝臓や周囲の構造のよりよい露出を可能にするためにテープでマウスピースに固定します。 </li><li>それを安定させるために肝臓に隣接して、後方2綿棒アプリケーターを使用してください。 </li><li>無菌10号手術用メスの刃を用いて肝臓の表面に、長さ、深さが3ミリメートルの切開を加えます。 </li><li>すぐに止血を達成するために切開部位にサージセル、穏やかな圧力を適用し、60〜90秒後に削除完全な止血が達成された場合にのみ進みます。 </li><li>無菌細いピンセットで、または、18G針で肝臓切開部に腫瘍フラグメントステップ1.3を配置します。 </li><li>腫瘍断片のずれを防止し、継続的な止血を確実にするために、肝切開を介しサージセルの小片を適用する。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じます。 </li><li>以下に説明するように、術後ケアを提供</li></ol>肝臓への直接注射により、腫瘍細胞の2.4肝内移植<ol><li>上記の2.3.7のステップ2.3.1で説明したように、マウスを準備します。 </li><li>針29 G 1/2を用いて、インスリン注射器中に腫瘍細胞懸濁液（1.13ステップで調製）を読み込む。 </li><li>肝臓は綿の先端のアプリケーターを使用して安定化して、肝臓へのインスリン注射針を挿入し、数ミリ被膜下平面に沿って穿刺部位を越えて先端を進める。 </li><li>優しく、注射器とTの内容を排出鶏は、肝臓から針を外します。 </li><li>穿刺部位にわたって行わサージセルと腫瘍細胞懸濁液の漏れを防ぎ、完全な止血を達成するために綿棒で静かに押し込みます。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じて、以下に説明するように、術後ケアを提供。 </li></ol>脾臓に注射を介して腫瘍細胞の2.5肝内異種移植<ol><li>上記の2.3.5へのステップ2.3.1で説明したように、マウスを準備します。 </li><li>無菌鋭いハサミを使用して、1センチメートル腹腔に入ること肋骨下切開を残してください。 </li><li>頭側と脾臓を露出させるために、動物の右側に胃を反映するために綿棒を使用してください。 </li><li>無菌細かい非外傷性の鉗子で、周囲の脂肪組織を処理することにより、切開部に脾臓を提供し、それを安定させるために、脾臓の後ろに綿棒を配置。 </li><li> 5-0絹縫合糸、場所を使用して下極以上の脾臓の周りに緩み予め結んだ結び目。 </li><li>針29 G 1/2を用いて、インスリン注射器中に腫瘍細胞懸濁液（1.13ステップで調製）を読み込む。 </li><li>脾臓下極へのインスリン注射針を挿入し、緩い予め結んだ結び目のレベルを越えて、それを進める。 </li><li>徐々に、注射器の内容物を排出脾臓から針を取り外し、注入された腫瘍細胞懸濁液の漏れを防止するための結び目を締める。 </li><li>腹腔内に脾臓を交換してください。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じて、以下に説明するように、術後ケアを提供。 </li></ol>ヒト腫瘍組織の肝内移植を促進するために2.6肝切除<ol><li> 2.3.7ステップ2.3.1で説明したように、マウスを準備します。 </li><li>無菌鋭いハサミで、肝臓の中葉に装着鎌状靭帯を分ける。 </li><li>綿棒を使用して、動員肝臓と位置左葉の周りに5-0絹縫合糸の緩い予め結んだ結び目の左葉。左葉のbilio - 血管茎に向けて可能な限り近い緩い結び目を進め、結び目を締めます。 </li><li>結び目およびその後の出血の滑りを防止するために小さな切り株を残して、滅菌鋏を用いて結紮する左葉の先端を切り出す。 </li><li>同様の技術を用いて、胆嚢を避け、肝臓の中葉の大部分を結紮し、切除する。 </li><li>使用サージセルおよび完全な止血を達成するための肝実質の切断面に沿って綿棒で穏やかな圧力。 </li><li>腫瘍フラグメントまたは腫瘍細胞の肝内異種移植の場合は、手順に進み、上述のように2.4.5 2.3.11または2.4.2に2.3.8。 </li><li>脾臓注射を介した腫瘍細胞の肝内異種移植のために、exposi、優しく頭側、動物の右側に胃を反映するために綿棒アプリケーターを利用脾臓ngの。上記のように2.5.9ためのステップ2.5.4に進みます。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じて、以下に説明するように、術後ケアを提供。 </li></ol> 2.7術後ケア<ol><li>吸入麻酔マウスピースからマウスを外します。 </li><li>麻酔から回復し、完全に動員されるまで約20分間加熱ランプ下ケージにマウスを置きます。 </li><li>最初の2〜3術後日間ブプレノルフィン投与量ごとに8から12時間を繰り返します。 </li></ol>

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	<li>El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).</li><li>Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma:+insight+from+animal+models.">Hepatocellular carcinoma: insight from animal models.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).</li><li>Tateishi, R., Omata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+in+2011:+Genomics+in+hepatocellular+carcinoma--a+big+step+forward.">Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).</li><li>Hoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+classification+and+novel+targets+in+hepatocellular+carcinoma:+recent+advancements.">Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements.</a> Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).</li><li>Ji, J., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+cancer+stem+cell+biology+in+hepatocellular+carcinoma.">Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma.</a> Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).</li><li>Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+therapies+for+hepatocellular+carcinoma:+a+critical+view+of+the+evidence.">Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+human+tumour+tissue+xenografts+in+immunodeficient+mice:+a+systematic+review.">Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review.</a> Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).</li><li>Sausville, E. A., Burger, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+human+tumor+xenografts+to+anticancer+drug+development.">Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.</a> Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).</li><li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD/LtSz-scid+mice.">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li><li>Ohbo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+hematopoiesis+in+mice+with+a+truncated+mutant+of+the+interleukin-2+receptor+gamma+chain.">Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain.</a> Blood. 87, 956-967 (1996).</li><li>Fiebig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vivo+imaging+of+the+murine+liver:+a+micro-computed+tomography-based+anatomical+study.">Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study.</a> PLoS One. 7, e31179 (2012).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).</li><li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem/progenitor+cell+features.">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-130b+Promotes+CD133(+)+liver+tumor-initiating+cell+growth+and+self-renewal+via+tumor+protein+53-induced+nuclear+protein+1.">miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1.</a> Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).</li><li>Park, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoangiogenesis+and+sinusoidal+"capillarization"+in+dysplastic+nodules+of+the+liver.">Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver.</a> Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).</li><li>Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+liver+drug+uptake+following+hepatic+artery+and+portal+vein+infusion.">Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion.</a> J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).</li><li>Zhang, D. Y., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis-dependent+mechanisms+of+hepatocarcinogenesis.">Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis.</a> Hepatology. 56, 769-775 (1002).</li><li>Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+solid+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice+are+vulnerable+to+lymphomagenesis+associated+with+Epstein-Barr+virus.">Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus.</a> PLoS One. 7, e39294 (2012).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々は、実験的な質問およ​​び多種多様なアッセイに適用することができる免疫不全マウスに皮下および肝臓内のヒトHCC異種移植片を確立するために様々な技術を記載している。皮下異種移植片が広くHCC生物学の様々な側面を研究するために使用されてきたが、肝内異種移植片はほとんど文献に記載されていない。さらに、異種移植片の使用を記載した研究の大部分は、十分に確立された?...

肝細胞癌（HCC）は、世界中の5番目に多いがんと北米における癌死の最も急速に増加原因となっています。 HCCのための最も優勢な危険因子は、最も頻繁に起因する慢性ウイルス性肝炎、アルコール乱用、自己免疫疾患、または遺伝性代謝障害1発生する、肝硬変である。 世界的な集団上HCCによって課される重い疾病負担にもかかわらず、HCCの病態生理は、比較的乏しい例えば、結腸直腸癌、乳癌、または前立腺癌のような他の一般的な癌と比較して理解される。例えば、腫瘍形成を駆動する特定の分子と細胞事象は明らかに2で定義されていない。他のほとんどの固体の上皮癌と同様に、ゲノムのアプローチは、HCC 3に関連する収差の不均一性を明らかにした。多くの研究は、シュール、細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の種々の無秩序な活性を明らかにしたvival、分化、および血管新生4。また、肝細胞癌の病理生物学におけるがん幹細胞の役割は、5を明確にされていない。 HCCの病態生理の限られた理解した上で、肝細胞癌に有効な治療法の装備一式も比較的限定されたままである。再発は共通ですが、肝臓に限局した腫瘍を有する初期段階の患者は、腫瘍の切除や外科的切除を使用した根治療法の候補である。より進行した疾患を持つ患者のために、化学療法や放射線は、限られた有効性のものであり、緩和的意図を6と疾病管理のために主に使用されています。 人間のHCCの生体実験モデルにおいて 、高品質は、このように人間の肝細胞癌の病態生理学にだけでなく、新たな治療アプローチを評価するために多くの必要な基礎研究のための貴重なプラットフォームを提供します。細胞株または高度に規定されたマウスモデルを用い、PRIの異種移植片と比較して彼らはまた、7,8内および異なる患者との間に存在する不均一性を取り込む際に忠実に人間の病気をrecapitulatingすることができるので、免疫不全マウスでのメアリーのヒト腫瘍は、そのような研究のための貴重なツールとして浮上している。この目的のために、我々は、免疫不全マウスにおけるヒトHCC異種移植片を確立するための様々な方法を開発した。 HCC異種移植片を伴う公表された研究の大半は、この目的のために十分に確立されたヒトHCC細胞株の使用を記載しているが、我々はすぐに患者からの外科的切除後に得られた一次HCC標本から異種移植片を生成するために、我々のアッセイの最適化に焦点を当てている。 種々の異種移植技術は、異なる研究用途に必要とされてもよい。例えば、腫瘍断片から生成された皮下異種移植片が急速に発生し、容易に監視され、便利で新規な治療薬の局所投与のためのより適切かもしれない腫瘍反応のモニタリングが行われます。肝内異種移植は、肝細胞癌生物学の肝微小環境の役割に関する研究のためのより適切な場合があります。腫瘍細胞懸濁液から生成された異種移植片は、腫瘍開始細胞サブセットの同定および特徴付けのために、もしくは異種移植の前に、腫瘍細胞のインビトロ操作で必要とする実験のために必要である。我々は、このように開発され、初代ヒトのHCC検体から得られた細胞懸濁液または腫瘍断片から皮下または肝内異種移植片を確立するために、次のプロトコルを検証しています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Mod. Eagle Medium/Ham's F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12)</td>
			<td>WISENT Bioproducts</td>
			<td>319-075-CL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase TypeIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Buffered Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1011-L8001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine surgical scrub</td>
			<td>Purdue Pharma</td>
			<td>NPN 00158313</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LORIS 10% PVP-I Solution</td>
			<td>LERNA Pharma Inc.</td>
			<td>109-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-838</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, Tissue -Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 18G 1 &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 27G &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G&frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>309301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade No.10</td>
			<td>Feather Safety Razor Co.</td>
			<td>08-916-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle</td>
			<td>Syneture</td>
			<td>VS-880</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore surgical tape</td>
			<td>3M Health care</td>
			<td>1577-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicator</td>
			<td>Medpro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgicel, oxidized regenerated cellulose</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1951</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 100 &mu;m nylon</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnification lighting with mobile base</td>
			<td>Benson medical Industries Inc.</td>
			<td>model: RLM-CLT-120V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish sterile 100x20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821474</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson dressing forcep 4-3/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye dressing forcep, serrated, straight, 4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A19-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A12-142</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, curved, 4-1/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-690</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, straight, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-684</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A17-228</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice

生体内でヒトの疾患を再現肝細胞癌（HCC）の実験モデルは、疾患の病態生理の研究のためと新しい治療法の前臨床評価のための貴重なプラットフォームを提供します。我々は、研究の種々の用途に利用され得る免疫不全マウスの皮下または同所性ヒトHCC異種移植片を生成するために、種々の方法を提示する。出発点として外科的切除を受けた患者からの原発腫瘍組織の使用に焦点を当て、我々は異種移植用の細胞懸濁液または腫瘍断片の調製を記載する。マウス脾臓内またはii）肝臓内、いずれかの肝臓への腫瘍細胞または断片の直接注入によって、または間接的に細胞を注入することにより、我々は、これらの組織i）の皮下に異種移植するための特定の技術を記載している。我々はまた、戦略などの異種移植の時にネイティブのマウスの肝臓の部分切除の使用を記載初代ヒト腫瘍細胞の肝臓内移植を容易にすることができるレシピエントマウスにおける活性肝再生の状態を誘導する。これらの技術の期待される結果が示されている。記載されたプロトコルは、一般的に広く使用され、頻繁に文献に引用されている十分に確立されたヒト肝細胞癌細胞株よりも少ないロバスト行う一次ヒト肝細胞癌サンプルと異種移植片を使用して検証されています。細胞株と比較して、我々は、異種移植モデルにおいて原発HCC生着の比較的低い可能性に寄与し、異種移植片の増殖の動態に影響し得る技術的な問題についてコメントする要因を議論する。また、得られた異種移植片を正確に親HCC組織に似ていることを保証するために適用されるべき方法を示唆している。

図3は、皮下ヒト肝細胞癌異種移植腫瘍の対応病理組織学的外観の典型的な外観を示しています。皮下異種移植片の発展と成長を容易にレシピエントマウスの毎日の検査によってモニターすることができる。腫瘍の異種移植と開発との間の時間間隔は、（組織のタイプ（細胞懸濁液対腫瘍断片）、組織の供給源（一次患者サンプル、継代異種移植片、又は細胞株）、および移植さ...

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Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植は、癌の生物学を研究するための貴重なツールです。ヒト肝細胞癌細胞または腫瘍断片の皮下および肝臓内異種移植片を生成するための特定のプロトコルが記載されている。レシピエントマウスにおいて、部分肝切除により誘発される肝臓再生は、肝移植を容易にするための戦略として提示される。

免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

35.7K ビュー.  University Health Network. 免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植は、癌の生物学を研究するための貴重なツールです。ヒト肝細胞癌細胞または腫瘍断片の皮下および肝臓内異種移植片を生成するための特定のプロトコルが記載されている。レシピエントマウスにおいて、部分肝切除により誘発される肝臓再生は、肝移植を容易にするための戦略として提示される。 