IsjaデFeijterとマット·ベイカーとの有益な議論は感謝して承諾されます。

1。センサーの合成<ol><li>次のセクションでは、PAMAMデンドリマーにpH指示薬の結合のための手順を提供する。同一のプロトコルは、代替のアミン含有デンドリマーに最少の改変を適用することができる。5,17,13,14、市販のデンドリマーおよび染料をさらに精製することなく使用することができる。 </li><li>無水DMSO（50μM最終濃度）にデンドリマーを溶かす。無水DMSOフルオレセインNHSおよびテトラメチルローダミン-NHS（TMR）の10mMのストック溶液を準備します。 </li><li>デンドリマー溶液にフルオレセインとTMRの所望の量を追加します。混合物中のモル比は、デンドリマー上にロード染料の量を反映する。通常、マイクロチューブ内のG4 PAMAMデンドリマー溶液1mlは、フルオレセインとTMRの8 EQ（40μL）の8 EQ（40μL）と反応させる。 12時間室温で溶液を撹拌した。 </li><li>脱イオン水で1:10に希釈し、反応を読み込む透析バッグ（MWCO = 10kDaの）中の混合物。リザーバ内に頻繁に水を交換し、脱イオン水に対して24時間透析。 </li><li> 24時間バイアル凍結乾燥の解決策を転送します。紫色の粉末が得られるはずである。重量が得られた固体および10μMの最終濃度でミリQ水に溶かす。 -20℃でのソリューションや店舗を分取</li></ol> 2 インビトロ pH測定<ol><li> in vitroでのキャリブレーションのために石英キュベット中のPBS中デンドリマーの溶液500nMの（2 mMリン）を準備します。滴定中のpHの急激な変化を避けるために、非常に希薄PBS緩衝液（2mMの）の使用を推奨します。 </li><li>フルオレセインの発光スペクトル（488nmで販売）及びTMR（大口550 nm）を測定し、良好な信号対雑音比を達成するために、蛍光光度計の光学設定を最適化する。 </li><li>すべての添加がキュベットを振った後、NaOHを0.1 N及びHCl 0.1 Nの小さなボリュームを追加することにより、pH滴定を行う混合するため、平衡化のために1分待ってからpHの微小電極を用いてpHを測定します。フルオレセインおよびTMRの発光スペクトルは、光の設定を変更せずにステップごとに記録されるべきである。 </li><li>滴定のためのpH対蛍光強度をプロットします。ローダミン信号は、pH（&lt;10％）による影響を受けなければなりません。フルオレセイン信号はS字状曲線でなければならず、主キー= 6.4のシングル結合モデルを装備する必要があります。 </li></ol> 3。細胞培養およびエレクトロポレーション<ol><li> 10％ウシ胎児血清および100 U / mlのペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を養う。加湿した5％CO 2雰囲気中37℃で細胞培養を維持する。 </li><li>デンドリマーエレクトロポレーションのために、細胞がコンフルエントされている場合、メディアを取り出し、DPBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）を用いて細胞を洗浄します。 DPBSを削除し、トリプシン-EDTAを追加します。トリップを中和血清を含む培地ではなく、抗生物質を添加することによって罪。室温で2分間900-1,200 rpmで遠心分離する。メディアを取り外し、DPBSを使用してペレットをすすぐ。 </li><li>細胞をカウントし、4 * 10 6個の細胞を取る。室温で2分間1,200-1,500 rpmで遠心分離する。 </li><li> （microporatorの製造元から提供されている）マイク​​ロポ緩衝液200μl中で細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mlのマイクロチューブに細胞を移す。 </li><li>再懸濁細胞へのデンドリマーの水溶液を加える。サンプルごとに必要なデンドリマーの量は、PAMAMタイプ（カチオンと中性デンドリマーのために2μMのため、通常250 nM）を依存しています。 </li><li>マイクロポチューブに（microporatorの製造元から提供されている）エレクトロポレーション緩衝液を追加します。 100μl容量サイズのエレクトロチップで細胞やデンドリマーの混合物をピペット。ピペットステーションにmicroporatorピペットを挿入します。パルス電圧= 1005 V、パルスWID：マイクロポのためのパルス条件を設定する目= 35ミリ秒、パルス数= 2。 </li><li> 1,200 rpmで5分間の1.5mlマイクロ遠心チューブに細胞を遠心パルス伝達細胞は、培地中の過剰なデンドリマーを除去した後。新鮮な培地でプレート35ミリメートルのガラスボトムディッシュ上にエレクトロポレーションした細胞を10μl（WillCo皿GWSt-3522）W / O抗生物質。 </li></ol> 4。リビングHeLa細胞内のpHセンシング<ol><li>エレクトロポレーション後、共焦点顕微鏡を12時間と画像セル。 </li><li>フルオレセインおよびローダミンのための標準的なフィルタセットを使用することができる。チューナブルフィルタが使用可能な場合は500から緑のチャネルを設定する - 550 nmおよび650 nmの580 nmのから赤チャンネル。ローダミンはどちら543nmのか561レーザーラインで画像化することができますが488での励起は、フルオレセインに最適です。 </li><li>試料に焦点を当て、信号対雑音比を最大にするレーザパワーと検出器の利得を調整する。エレクトロポレーションが成功した場合、細胞は、両方のチャネルで明るく蛍光である必要があります。ザ·ローカライズが使用デンドリマーの大きさおよび電荷に依存します。多くの場合、いくつかのリソソーム局在性（小核周囲小胞）が原因エンドサイトーシスまたは区画に存在している。リソソーム局在化が支配的である場合、 すなわち 、蛍光の大部分がベシクル内部に不良信号局在化される細胞質ゾルにおいて観察され、これは、毒性および測定が廃棄されるべきである意味する。取得複数の画像を必要に応じて、順次、2つのチャネルを取得し、画像品質を向上させるために画像を平均化する。 </li><li>異なるpHでイオノフォアを有する緩衝液を用いて較正クランプセルのためのpHは、上記のようにpHをあたり少なくとも20細胞を獲得する。手順の詳細な説明およびバッファーの成分のためBizzarriや同僚を参照してください。16私たちは、pH = 5.5のpH = 7.5、少なくとも5点を測定することをお勧めします。 6未満のpHは、細胞に対して毒性ではなく、短い時間のために許容され、我々は可能な限り迅速に画像を取得することを示唆している。もし細胞アポトーシスの兆候を示さ、セルを廃棄し、再起動してください。 </li><li>データ分析のためのImageJまたは類似のソフトウェアを使用してください。緑と赤のチャンネルの画像をインポートし、バックグラウンドを減算し、ツールの「画像電卓」の画素比イメージングによってピクセルを作成します。 </li><li>所望のセルを選択する関心領域（ROI）を描画し、細胞内の緑から赤色の比率を測定します。取得したすべての画像を分析し、次にpHに対する比率をプロットします。 5.5から7.5の範囲での傾向は直線的である必要があります。得られた点の線形フィットは、pHに緑色〜赤色の比率を変換するために使用される較正曲線を与える。 </li><li>さらに対照として、いくつかの未処理細胞（NOイオノフォア）を取得し、得られた検量線を用いてpHを計算してみてください。 7.2と7.4の間の値​​を取得する必要があります。 </li></ol> 5。 インビボサンプル調製<ol><li>実験は、出生後のDとのC57BL/6J（雄と雌）を実施したAY 28と70。ウレタンの腹腔内注射（ すなわちエチルカーバメート）（20％生理食塩水中のW / V、20 mg / kgのウレタン）でマウスを麻酔し。動物は、同じ麻酔薬の心臓内注射したウレタンの過剰摂取を用いた実験後に屠殺した。 </li><li>手術中に皮質ストレス反応および脳浮腫を減少させるためにリン酸デキサメタゾンナトリウム（2 mg / kg体重）の筋肉内注射を行う。 </li><li>動物の頭を剃ると頭皮に2.5％リドカインゲルを適用します。 </li><li>両半球の頭蓋骨をカバーする皮膚のフラップをカットするはさみを使用して、 </li><li>生理食塩水を用いて露光骨を洗い、軽くピンセットを用いて骨膜を削除します。これは、接着剤とを接着するための歯科用セメントのためのより良い基盤を提供します。 </li><li>中央イメージング室とカスタムメイドのスチールヘッドポストを適用し、平面上にシアノアクリレートとそれを接着し、約私の皮質領域の上の頭蓋骨に平行なnterestと白の歯科用セメント（Paladur）で所定の位置に固定します。 </li><li>関心のある領域にわたって掘削直径2〜mmで開頭を実行するために、マウスの頭部を固定します。 </li><li>手術、硬膜涙、または出血の際に皮質の加熱を最小限に抑えるようにしてください。 </li><li>無菌ACSF（126のNaCl、3のKCl、1.2mMのKH 2 PO 4、1.3のMgSO 4、26 mMの炭酸水素ナトリウム、2.4のCaCl 2、15 mMグルコース、蒸留H 2 O中1.2のHEPESで灌流皮質を保つ液、pH = 7.4）。 </li></ol> 6。マウス脳におけるpHイメージング<ol><li> O 2富化空気を提供する実験援助動物呼吸の間。酸素は80％まで濃縮される。 O 2分圧および流量は、しばしば、適切な呼吸補助を得るために調整される。フィードバック制御された加熱ブランケットを37℃の体温を一定に保つ。 </li><li> 2 - 写真の目的の下に鋼製のポストを通して動物を修正しました。n個のイメージングセットアップ。 </li><li>大脳皮質にセンサーを注入するためにデンドリマー溶液（1μM）とAgCl電極（先端径4ミリメートル）を含むガラスピペットをロードします。電極は細胞外電場電位を記録することができるようになります。 </li><li>マイクロインジェクションのセットアップを150μm程度の深さで皮質にピペットを挿入します。 0.5 psiの圧力で1〜2分間注入する。 </li><li>イメージング用の光学セットアップを最適化します。レーザー出力は光退色と光損傷を最小化するように調整する必要があります。典型的に用いられるレーザパワーが以前の校正がこの電圧は、最良のS / N比が得られることが示されたのでミリワットおよびPMTゲインは667 Vで一定に保った約20である。 </li><li>イメージングのために820 nmでセンサーを励起し、標準FITC及びTRITCフィルターを通して、フルオレセインおよびローダミンの蛍光を同時に検出。 </li><li>時間分解測定は、2 Hzで、タイムラプスシリーズを獲得。 </li><li>バックグラウンド補正のためにLASEとダークフレームを取得するRシャッターは通常、電子回路によって追加された光電子増倍管と台座に発生する平均熱ノイズを測定するために閉鎖。 </li><li>データ解析のために第4章で報告されたのと同じ手順に従ってください。 </li></ol>

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デフォルト：著者は、開示することは何もありません。

デンドリマーベースのセンサとの正常なpHイメージングのための重要なステップは次のとおりです。I）正しい樹状足場の選択と、それに結合させ指標の数や細胞内や生体内でのセンサ配信プロトコルのII）は、最適化。 合成手順は非常に簡単であり、すべてのアミン持つハイパーブランチポリマーに仮想的に適用することができます。センサは、単一のステ...

特定の生体関連分子を標識するための蛍光分子の使用は完全に我々は生物学的システムを研究方法を変更しました。広視野と共焦点顕微鏡は、生物学的プロセスをリアルタイムで高解像度の可視化のために許可されたと、最近の細胞およびin vivoでのin vitroでの生物学的事象を研究するための最も人気のあるテクニックの一つです。1関連の改善は、蛍光指標の開発で表したその蛍光の特定の分子実体の濃度に依存する、 すなわち染料。 pHとカルシウムの指標は特に起因する生物学において、H +およびCa 2 +イオンの膨大な関連性に細胞生理学の研究に大きな影響を与えた。2,3 細胞内のtargetiにおけるI）難しさ：ただし、本センシング染料のほとんどいくつかの固有の制限は、次のような彼らの低分子行動に関連NGと、ii）水への溶解度が低い、その結果、貧困層、生体適合性、およびiii）細胞漏れ、したがって長期タイムラプスイメージング能力の欠如4はさらに、多くのプローブの信号は色素濃度への依存のために補正することができない（非。レシオメトリックイメージング）、したがって、細胞またはin vivoで絶対的な測定は不可能である。 我々は最近、デンドリマー骨格上の感知色素のコンジュゲーションに基づき、これらの制限を克服するための簡単で効果的な方法論を説明した図5デンドリマーは、生物学的用途のための非常に魅力的な特性を有する単分散ハイパーブランチポリマーであり、特に6は、複数の樹状アーキテクチャが開発され、使用されている薬剤7および遺伝子送達のために。8ごく最近になっていくつかのグループは、センシングデバイス用の足場として、これらの分子の可能性を探求し始めた。9,10,11 私たちは、以前にNHS-活性化エステルに基づく異なるポリアミドアミンの官能化に向けて容易に合成経路（PAMAM）足場を説明したコンジュゲート12のみを精製などの透析により単一工程で得ることができる。興味深いことに、このアプローチは容易に樹枝状またはポリマー足場、種々に適用することができる。13,14 i）のpH指示薬（ すなわち、フルオレセイン）およびii）pH依存性蛍光部分（ すなわち、ローダミン）：レシオメトリックイメージングデンドリマーを達成するために二重標識色素の2セットであった。これは、フルオレセインおよびローダミンとの比はpHにし、これ以上のプローブの濃度にのみ依存しているように我々に正確なpHの撮影を行うことができました。寿命は、その測定値が、レシオメトリック補正を必要としないプローブ濃度に依存しないように、この問題へのもう一つの興味深いアプローチは寿命ベースのプローブを使用する。15で表されます。しかし、LIFetimeの測定は、より複雑な楽器のセットアップを必要とし、それらの時間分解能は、従って、それらの潜在的用途を限定する、高速な生理的プロセスのために準最適である。 細胞内イメージングを行うために、プローブは、サイトゾルに原形質膜を横切って配信する必要がある。デンドリマーは、それらの大きさおよび親水性のために、膜透過されないように、細胞内送達は、エレクトロポレーションを介して達成することができる。この技術により、トランスフェクションのために広く使用される生物学において、標識された巨大分子を効果的に高品質のイメージングを行うために細胞内に送達することができる。巨大分子が直接細胞質に送達されるようにまた、エレクトロポレーションによりデンドリマーエンドサイトーシスに関連した合併症を回避することができる。興味深いことにエレクトロポ異なるデンドリマーの後でもシーケンスを対象とした全ての特定の非存在下では細胞内の個別のローカライズを示しています。5このPASSIVEのみによりデンドリマーの物理化学的特性のために、ターゲットに、オルガネラ特異なpHイメージングを実現するために悪用される可能性があります。 レシオメトリックイメージング、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。共有結合した樹状足場に結合させ、フルオレセインおよびローダミンは、別々に画像化したと画素ごとの比マップが作成されました。イオノフォアを用いて生細胞における細胞内pHを制御するために、いくつかの手順が報告された。イオノフォアは、原形質膜を横切ってイオンを輸送することができる小さな疎水性分子であり、H +イオンに対するイオノフォア、例えば、ナイジェリシンとして、入手可能であり、デンドリマーベースのセンサを較正するために使用することができる16これらの測定値を観察したものに同様にpHに線形応答を明らかにした。 in vitroで 。較正細胞内のpHに基づいて正確に測定することができる。これらの測定は、デンドリマーベースのセンサーは、研究H + homeost貴重なツールになり得ることを示し生きた細胞およびpH調整の誤動作を伴う病理学的プロセスにおいてASIS。 我々は最近、デンドリマーベースのpHセンサーは、麻酔したマウスの脳におけるpHの撮影を行う、 生体内でも適用することができることを実証した。17により生体組織の複雑な環境へのインビボ検出の高い品質が技術的に困難である。ここでは、脳内の正確なpHイメージングを実行するために取り組むべき重要な課題の重点を置いて、生体内のpHイメージングのための実験手順の詳細な説明を表示。二光子顕微鏡法は、2つの主な理由のために使用されている：i）の赤外光の使用は、標準的な共焦点顕微鏡の組織浸透性の欠如を克服することを可能にすること、ii）フルオレセインおよびローダミンの広い二光子吸収は、それらの同時励起を回避することを可能励起用2波長の使用に関連する合併症。マウス脳におけるpH測定であった正常に実行、センサーが容易に脳細胞外空間中のpHの変化を誘導する低酸素状態に応答します。これらの測定は、デンドリマーベースのインディケータが正常動物モデルにおけるin vivoでのpHの生理学的および病理学的変化を強調するために使用できることを実証している。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

蛍光指示薬の開発は、生命科学のための革命を表していた。遺伝的にコードされたと検知能力を持つ合成フルオロフォアは、高い空間分解能と時間分解能との生物学的に関連の種の可視化を可能にした。合成染料は、その高い同調性と測定可能な分析物の広い範囲に特に関心のおかげである。しかし、これらの分子は、低分子の挙動（溶解度が低い、ターゲット設定の難しさ、許可された多くの場合、無レシオイメージング）に関連するいくつかの制限を受ける。本研究では、デンドリマーベースのセンサの開発を紹介し、生細胞及びin vivoで、in vitroで pH測定のための手順を提示する。我々はそれらのいくつかの生物医学機器に広く使用される足場た彼らの多くの望ましい特性（単分散性、波長可変特性、多価性）のために私たちのセンサーのための理想的なプラットフォームとしてデンドリマーを選択します。蛍光のpHの抱合デンドリマー骨格にインジケータが彼らのセンシング性能の向上につながった。特に、デンドリマーの展示は、セルの漏れを低減し、細胞内ターゲティングを改善し、レシオメトリック測定が可能です。これらの新規なセンサは正常マウス脳におけるHeLa細胞を生体内及び生体内の pHを測定するために使用した。

図1は、異なる樹状足場に染料を感知するのコンジュゲーションの概略図を示す。得られた指標は、市販品から1つの合成工程で容易に得ることができる。アミン含有デンドリマーはDMSO中のNHS-活性化色素と反応させ、透析によって精製される。この一般的な手順は、すでに成功して、いくつかのデンドリマーの標識に使用されました。I）PAMAMデンドリマー世代2、4、6、12、</sup...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

蛍光センサーは、生命科学の強力なツールです。ここでは、生細胞およびin vivoでのpHを測定するために、デンドリマー系蛍光センサーを合成し、使用する方法を記載している。樹状足場が改善検知特性につながる共役蛍光色素の特性を高める。

合成、細胞の配送および<em&gt;インビボ</em&gt;デンドリマーベースのpHセンサの応用

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Unit 1

Acid–Base Titration

Acid-base and Solubility Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K ビュー.  Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR. 蛍光センサーは、生命科学の強力なツールです。ここでは、生細胞およびin vivoでのpHを測定するために、デンドリマー系蛍光センサーを合成し、使用する方法を記載している。樹状足場が改善検知特性につながる共役蛍光色素の特性を高める。 

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Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. The synthesis of hypervalent iodonium alkynyl triflates can be facile, but difficulties stem from their isolation and reactivity. In particular, the necessity to use filtration under inert atmosphere at -45 &deg;C for some HIATs requires special care and equipment. Once isolated, the compounds can be stored and used in reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. 
The evidence for cyanocarbene generation is shown by visible extrusion of dinitrogen as well as the characterization of products that occur from O-H insertion, sulfoxide complexation, and cyclopropanation. A side reaction of the cyanocarbene formation is the generation of a vinylidene-carbene and the conditions to control this process are discussed. There is also potential to form a hypervalent iodonium alkenyl triflate and the means of isolation and control of its generation are provided. The O-H insertion reaction involves using a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and methanol as solvent/substrate. The sulfoxide complexation reaction uses a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and dimethyl sulfoxide as solvent. The cyclopropanations can be performed with or without the use of solvent. The azide source must be tetrabutylammonium azide and the substrate shown is styrene.

Herein is described the synthesis, isolation, and reactions of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) with azides to generate cyanocarbenes. The procedures will involve air-sensitive and cryogen techniques, including cold filtration under an inert atmosphere. Handling and safety of the synthesized compounds will also be discussed.

生成Cyanocarbenesの適用のための超原子価ヨードニウムアルキニルトリフラートの合成

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

化学

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

ホウ素ドープダイヤモンド電極品質とアプリケーションの評価<em&gt;その場で</em&gt;水電解による局所のpHの変更

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

コロイド液の結晶を得ることが合成とディスコティックリン酸ジルコニウムの剥離

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

調製と<em&gt;インビトロ</em&gt;磁気共鳴イメージングのためのデンドリマーベースの造影剤のキャラクタリゼーション

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical properties, which allow for the absorption of near-infrared (NIR) light and can subsequently convert it into multiplexed emissions that span over a broad range of regions from the UV to the visible to the NIR. This article presents detailed experimental procedures for high-temperature co-precipitation synthesis of core-shell UCNs that incorporate different lanthanide ions into nanocrystals for efficiently converting deep-tissue penetrable NIR excitation (808 nm) into a strong blue emission at 480 nm. By controlling the surface modification with biocompatible polymer (polyacrylic acid, PAA), the as-prepared UCNs acquires great solubility in buffer solutions. The hydrophilic nanocrystals are further functionalized with specific ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for localization on the cell membrane. Upon NIR light (808 nm) irradiation, the upconverted blue emission can effectively activate the light-gated channel protein on the cell membrane and specifically regulate the cation (e.g., Ca2+) influx in the cytoplasm. This protocol provides a feasible methodology for the synthesis of core-shell lanthanide-doped UCNs and subsequent biocompatible surface modification for further cellular applications.

A protocol is presented for the synthesis of core-shell lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) and their cellular applications for channel protein regulation upon near-infrared (NIR) light illumination.

携帯電話のアプリケーションのコア-シェル希土類ドープ アップコンバージョンナノ結晶の合成

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Au、Pd、およびソリューションに基づく還元を介して Pt エアロゲルの迅速合成法

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

眼内レンズ用ソフト ポリシロキサン尿素エラストマーの合成

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

標的薬物送達のためのドキソルビシンを装填したアプタマー-PEI-G-PEG改変金ナノ粒子の合成

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...