BBSRCからの資金調達が親切に認識されている（認可番号B-H011293 / 1）。

概要セクション1は、SEMを用いた蛍光分析法とそのサイズを使用してpHにナノセンサー応答のpH応答性ナノセンサーおよび特性の製造を記載し​​ている。 第2節では、エレクトロポリマー足場とSEMを用いて、それらの形態や大きさの特性の製造を記載し​​ている。第2節では、また、pH応答性ナノセンサーを含めてエレクトロ足場である自己申告足場の製造が記載されている。得られた自己申告の足場は、電界紡糸繊維の任意の形態学的変化が生じたかどうかを評価するために、SEMによって特徴付けられる。組み込まれたナノセンサーから得られる自己申告足場からの蛍光を共焦点顕微鏡によって評価される。 第3節では、エレクトロ足場と自己申告足場上に細胞の培養について説明します。足場は最初preparatで滅菌された足場を滅菌し、細胞の培養は、自己報告足場の蛍光能力に影響を与えるかどうかを決定するために評価され、細胞培養のための次のイオン。プロトコルは、エレクトロ足場上に培養される細胞へのナノセンサーの送達を記載する。リソトラッカー色素は、ナノセンサーは、細胞の酸性区画内に取り込まれていないことを確認するために使用される。 1。 pH応答性ゾル - ゲルナノセンサーの調製および分析 pH応答性ゾル - ゲルナノセンサーの1.1準備注：この製剤は、ドラフト内で実施されるべきである。 <ol><li>フラスコおよび6 - カルボキシテトラメチルローダミンを丸底（および-6） - カルボキシフルオレセイン、ジメチルホルムアミド中のスクシンイミジルエステル（FAM-SE）（1.5 mg）を（DMF）（1ml）中5 - を溶解することによりpHをナノセンサー内で使用するためのフルオロフォアを調製、別のラウンドでのスクシンイミジルエステルのDMF（TAMRA-SE）（1.5 mg）の（1ミリリットル）をフラスコの底。各フラスコに3 -アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）（1.5）を添加し、暗所で24時間、乾燥窒素雰囲気下（21℃）の下でかき混ぜるすなわちホイルでサンプルを包む。 </li><li>丸底フラスコ中のエタノールの混合物（6ml）および水酸化アンモニウム（30重量％、4 ml）中に上記色素（250μlの）の両方を添加し、1時間（21℃）攪拌する。 </li><li>ゆっくりと、さらに2時間撹拌し続け、混合物にテトラエチルオルトシリケート（TEOS）（0.5ミリリットル）を追加します。混合物が濁って変わります。ナノセンサーは、回転蒸発により回収することができる。ナノセンサーは、将来の使用のために4 度Cでガラスバイアル中に保存することができる。 注意：その乾燥形態でのナノセンサーの更なる処理はドラフト内で、またはバランスがWeighsafeの例では、囲まれている必要があり、それらを計量した場合に実行する必要があります。 </li></ol> pHは1.2ナノセンサーの対応<ol><li>ミクシィでpHを5.5から8.0に至るまでソレンセンのリン酸緩衝溶液を調製リン酸二水素ナトリウム（0.2M）とリン酸水素二ナトリウム（0.2M）の原液のNG特定の比率。 pHメーターを用いて最終pHを確認してください。水酸化ナトリウム（NaOH）（4 M）または塩酸（HCl）（2M）を用いてpHへの微調整を行います。 </li><li>まず液が白濁するまで（約5分）超音波装置で容器を水没して3分間ボルテックスにナノセンサー·ソリューションを含む容器を保持することによってpH緩衝液（5 mg / ml）をのpHナノセンサーを一時停止します。完全に溶液中でのナノセンサーを一時停止するには、次の手順を繰り返します。 </li><li>光学キュベットに最初に溶液を置き、5について488nmの励起波長を使用して - （および-6） - カルボキシフルオレセイン（FAM）および6 - カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）が568ナノメートル。 FAMとTAMRA蛍光分光計を使用するための558から580 nmのための500〜530nmでの発光波長を収集する。 </li><li> pHは、異なるpHで観察できるように、光学キュベット中の溶液を変更およびcを続行発光スペクトルをollecting。 </li><li>較正曲線を生成するために、各pH値で生成さ発光最大値の比を計算する。 </li></ol>ナノセンサーの1.3 SEM <ol><li>カーボンコーティングされた電子顕微鏡スタブ上にナノセンサーのサンプルを配置し、アルゴン雰囲気下で5分間、金でコートをスパッタ。 </li><li>走査型電子顕微鏡（SEM）により観察する。 （ 図1）帯電電子を最小限にするために、作動距離、電圧、倍率を調整する撮像中に。 </li></ol> 2。 PLGA足場の調製および分析 2.1エレクトロスピニングPLGA足場<ol><li>ドラフト内でポリピリメートとジクロロメタン（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）（DCM）（20％（w / w）である）（PF）（1％（重量/重量））を溶解する。 18 G鈍フィル針とシリンジポンプにしっかりとフィットして10ミリリットルの注射器に溶液を入れます。 </li><li> 20センチメートル徒歩20から針の先端を距離センチ×15cmのアルミニウム集電板。 </li><li>シリンジの先端とアルミニウム集電板にアースに高電圧電源の電極を取り付ける。 注意：お手入れは、高電圧が使用されているように、すなわち常にエレクトロスピニングの器具を扱う前に電気の供給をオフにする注意が必要です。 </li><li> 2時間12 kVの時に3.5メートル/時の一定流量を使用してソリューションを提供します。これらの条件を用いて、電界紡糸は約60μmの足場の深さが得られます。 </li><li>溶剤残留物を蒸発させるために24時間ドラフト内で足場を残す。 </li></ol> 2.2エレクトロスピニングpH応答性のPLGA足場<ol><li>セクション2.1で、ポリマー溶液（5 mg / ml）でナノセンサーに改変を加えるして説明したように、足場はpH応答性ナノセンサーを組み込んで調製する​​。超音波の助けを借りてPLGA溶液中のナノセンサーを一時停止する（約5分）前に<html> 10mLのシリンジ内に配置する。 </li></ol> 2.3 PLGA足場のSEMおよびpH応答性スキャフォールド<ol><li>カーボンコーティングされた電子顕微鏡スタブにPLGA足場やpH応答性足場のサンプルを配置し、ナノセンサーのSEM（ 図1）に記載のように進みます。 </li></ol> pH応答性足場の2.4校正<ol><li> 35ミリメートル培養プレートにpH応答性スキャフォールドのサンプルを置き、適切な緩衝溶液に浸す。 </li><li>共焦点顕微鏡でナノセンサーの中にTAMRAを励起し、FAMおよび568 nmのクリプトンレーザーを励起する488 nmのアルゴンレーザーを使用しています。 FAMおよびTAMRAのための558から580ナノメートルのための500から530 nmのpH応答性足場用の蛍光発光を観察します。 （ 図2）。励起波長のコレクションを回避するために、順次走査を使用しています。 </li></ol> 3。 PLGA足場およびpH応答性のPLGA足場上に細胞培養ntent &quot;&gt;注意：以下は、細胞培養のキャビネットで行ってください。 細胞培養のためのPLGA足場の3.1準備<ol><li> 2cm 2の断片に、PLGAまたはpH応答性のPLGA足場を切った。 </li><li> 15分間8cmの距離で紫外線（UV）光で各側を照射して足場を滅菌する。 </li><li> 12穴培養プレートに足場を移し、その上にスチールリングを配置。 （5％v / v）の内側にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、スチールリングの外で、一晩インキュベートペニシリン/ストレプトマイシンの溶液を入れる（37℃、5％CO 2）。 2センチメートル外径1cmの内径1cmの深さ：スチールリングは、ノッティンガム大学で生産し、以下の寸法を有したことに注意してください。 </li><li>殺菌溶液を除去し、PBSで洗浄する。 </li><li> （500μL）と外側（500μL）スチールリングの、インキュベーター内の場所（37℃、5％CO 2の内部に細胞培養培地を追加</サブ&gt;）細胞懸濁液を準備しながら。 </li><li>細胞懸濁液を調製し、トリパンブルー排除アッセイを用いて細胞数を実行します。 </li><li> 1×10 6細胞/ mlの細胞数を達成するために、細胞懸濁液を作成する。 </li><li>スチールリングの内側と外側からメディアを取り出します。 </li><li>スチールリング（1メートル）の外側に予め温め細胞培養培地に交換してください。 </li><li>細胞を配布するために静かに前後に岩板 - スチールリングの内側に細胞懸濁液を300μlを加える。 </li><li>インキュベーター内に細胞培養プレートを置きます（37℃、5％CO 2） - 2〜3日ごとにメディアをリフレッシュ-細胞の接着は、しかし限り、実験が必要と培養を継続し、24時間以内に起きている必要があります。 </li></ol> PLGA足場上に培養細胞に3.2ナノセンサー配信<ol><li>セクション3.1で説明したように、PLGA足場の上に種細胞。この研究では、ブランクのPLGA足場（しないcontai寧ナノセンサー）撮影する場合により蛍光発光の重なりに使用された。 </li><li>細胞は前にナノセンサーの配信に足場を通して成長し、移行することができるように72時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）への細胞播種足場を置きます。 </li><li>送達をナノセンサーの前に、1時間（37℃、5％CO 2）インキュベートし、PBSで細胞を洗浄し、標準培養培地から抗生物質および無血清培地に培地を変更する。注：3T3細胞のための標準的な培養培地は、ウシ胎仔血清（10％（v / v）で）、L-グルタミン溶液（2mM）を、ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地、（1％（v / v）で） 。 </li><li>潜伏期間中に溶液Aを作成するために簡単にのOptimem（50μL）でナノセンサー（5 mg）を超音波処理することによってナノセンサー - リポソーム複合体を準備</li><li>オプティメム（45μl）のにリポフェクタミン2000（5μl）を添加することによって溶液Bを作成し、5分間室温でインキュベートする。 </li><li>ソリューションを追加溶液Bに、ナノセンサー - リポソーム複合体である溶液Cを形成するために20分間室温でインキュベートする。 </li><li>細胞に溶液C（100μl）を添加し、3時間（37℃、5％CO 2）インキュベートする。 </li><li>インキュベーター、吸引メディアから細胞播種足場を外し、共焦点顕微鏡による生細胞の可視化を可能にするために、PBS（1ミリリットル）を加える前にPBSで2回洗浄します。注：異なるpHでのキャリブレーションが実行されたため、細胞培養培地中に存在するフェノールレッド指示薬はまた、自家蛍光の原因としないようにPBSは、このプロトコルで使用した。しかしながら、フェノールレッドを含まない培地は、細胞培養物の長期的分析のために使用することができる。 </li><li>異なるpHのバッファーに細胞播種された足場を浸し、細胞に関連ナノセンサーの応答を監視します。 </li><li>共焦点顕微鏡を用いて蛍光を観察することによって、FAMとTAMRAの蛍光強度の比を決定することによってのpHiを監視（ ふぃぎゅ再3）。 </li></ol>哺乳動物細胞内で3.3ナノセンサーの場所<ol><li> （TAMRAの蛍光発光は、リソトラッカーレッドと同じスペクトル領域であるためである）のセクション3.2で説明したように唯一のFAM色素を含んだナノセンサーで細胞を培養する。セクション1.1ではなく、準備とTAMRAの追加を省略して説明したように、これらのナノセンサーを準備します。 </li><li>ナノセンサー納期次の50nmのリソトラッカーレッド原液を希釈。 </li><li> PLGA足場上に培養した細胞に希釈した溶液（2μL）の一定量を追加します。 </li><li> 1時間リソトラッカーレッドで細胞をインキュベートする（37℃、5％CO 2）。 </li><li>インキュベーション期間の後メディアを取り出し、共焦点顕微鏡を用いて観察するための準備でPBS（pH7.4）中（2ml）中にメディアを変更する前に、PBS（pH7.4）で細胞を2回洗浄する。注：フェノールレッドを含まない培地の代わりにPBSを使用することができる。 </li><li>核染色をDraを追加PBSへのQ5は最終的な濃度は、5程度であると3分（37℃、5％CO 2）のための細胞を用いて培養する。それはDRAQ5とのインキュベーション期間の後、メディアを変更する必要がない。 </li><li> 650、、唯一のナノセンサーDRAQ5発色団を励起し、500から530ナノメートル、580から600 nmの蛍光を観察するためにリソトラッカーレッドと633 nmのヘリウム/ネオンレーザーを励起する568 nmのクリプトンレーザーをFAMを励起する488 nmのアルゴンレーザーを使用して、それぞれ-750ナノメートル（ 図3）。励起波長のコレクションを回避するために、順次走査を使用しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold.">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li><li>Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precoating+of+elastomeric+tissue-engineering+scaffolds+increased+cellularity,+enhanced+extracellular+matrix+protein+production,+and+differentially+regulated+the+phenotypes+of+circulating+endothelial+progenitor+cells.">Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).</li><li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).</li><li>Li, D., Xia, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+nanofibers:+Reinventing+the+wheel?.">Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?.</a> Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).</li><li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro+spinning:+Applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).</li><li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications:+A+review.">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).</li><li>Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+3D+in+vitro+cell+aggregation+using+an+optical+imaging+system.">In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).</li><li>Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Response+to+Interstitial+Flow:+A+State-of-the-Art+Review.">Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).</li><li>Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+tools+for+tissue+engineering.">Enabling tools for tissue engineering.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).</li><li>You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+degradation+behaviour+of+non-porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)/poly(L-lactic+acid)+fibres+and+porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)+fibres.">In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres.</a> Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).</li><li>Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+degradation+behaviors+of+electrospun+PGA,+PLGA+and+P(LLA-CL)+nanofibers+cultured+with/without+cell+culture.">Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture.</a> Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).</li><li>Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+glucose+monitoring+and+control+in+a+rotating+wall+perfused+bioreactor.">Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).</li><li>Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+PLGA+fibre+sheets+incorporating+fluorescent+nanosensors:+self-reporting+scaffolds+for+application+in+tissue+engineering.">Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering.</a> Analytical Methods. 5 (1), (2013).</li><li>Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+membranes+for+highly+sensitive+optical+sensors.">Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors.</a> Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).</li><li>Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+fluorescent+monitoring+of+the+degradation+of+polymeric+scaffolds+for+tissue+engineering.">On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering.</a> Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).</li><li>Blackwood, K. A., McKean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).</li><li>Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fiber+diameter+and+orientation+on+fibroblast+morphology+and+proliferation+on+electrospun+poly(D,L-lactic-co-glycolic+acid)+meshes.">Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes.</a> Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).</li><li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+structure:+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering.">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).</li><li>Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+scaffold+degradation+rate+on+three-dimensional+cell+growth+and+angiogenesis.">The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis.</a> Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

組織工学は、特定の組織または器官の機能を修復、交換、維持または増強するためにインビトロでの組織モデルのようなin vivoおよび組織置換療法における両方として使用することができる生物学的代替物を作り出すことを目指し。合成代替物は、組織の修復を置き換えるか援助するために長年使用されてきたが、これらは多くの場合、最終的には拒絶またはさらなる修正手術に...

組織工学における主要な戦略は、それが交換する形態としている組織に似ており、また、細胞増殖および機能1,2をサポートすることができる足場を製造するための生体適合性材料を使用することである。足場は、細胞の接着や増殖はまだ3D携帯コンストラクトの隙間を通じて細胞移動を可能にすることによって、機械的なサポートを提供します。足場はまた、細胞の栄養素の大量輸送を可能にし、代謝廃棄物3の除去を阻害してはならない。 エレクトロスピニングは、細胞増殖4-6を支持することができるポリマー足場の製造のための有望な方法として出現した。彼らはしばしば多孔性であり、細胞の3D構築物7の隙間を通して細胞間相互作用、ならびに細胞移動を可能にするようにして製造不織布電界紡糸繊維は、細胞増殖に適している。これは、tの間に細胞生存率を監視することが重要である彼培養期間、その細胞の生存率を確保するためには、3D構築物の全体にわたって維持される。検体濃度の勾配は、3D構築物内に存在することができるように、例えば、酸素やpHなどの培養条件は、慎重な制御を必要とする。バイオリアクターまたは灌流系は、間質流のインビボ条件で模倣し、その結果、栄養素伝達および代謝廃棄物の除去8を増加させるために用いることができる。このようなシステムは一定の微小環境条件を確保しているかどうかの問題は、リアルタイムでの細胞の微小環境を評価することによって対処することができる。 リアルタイムで監視することができる主要な微小環境メトリクスとしては、温度、細胞培地の化学組成、溶存酸素及び二酸化炭素の濃度、pH、湿度。これらのメトリックのうち、温度が最も容易にその場プローブに用いてモニターすることができる。一般的に残っているリストされているメトリックを監視するための方法volveサンプリングのためのアリコートの除去、したがって、細胞培養を妨害し、汚染のリスクを増加させる。連続的なリアルタイムの方法が求められている。現在の監視方法は、通常は物理的なpHモニターや酸素プローブなどの細胞構造を探査楽器に依存している。しかし、これらの侵入方法は、細胞の構造を損傷し、継続的な実験を邪魔することができます。 3D構築物内の検体濃度の非侵襲的モニタリングは、例えば、栄養枯渇9のような種々の環境側面のリアルタイムモニタリングを可能にすることができる。これは構造内の深部への栄養供給の評価を可能にし、代謝廃棄物を効果的に10,11削除されたかどうかを決定するであろう。侵襲性の問題に対処しようとするシステムは、一般に、pHをモニターするために培養容器の両方を通って外部センサへの培養培地を渡す灌流チャンバーの使用を含む酸素およびグルコース12。ザ·直接再サンプリングのためのアリコートの除去を必要としない、そのようなものとして、その場の監視に提供するであろう培養容器に組み込むことができるセンサを開発することに関心が高まっている。 その場 、我々は自己申告足場13を生成するエレクトロ足場に、検体応答性のナノセンサーが組み込まれている微小環境条件を非侵襲的にモニタリングするためのこのような欠点に対処すること。感知装置は、エレクトロスピニングによって、または従来足場形成14,15にポリマー中に組み込まれる検体応答性染料を使用することによって作成された実際の高分子足場のいずれかであった場合に蛍光活性をモニタリングすることによってセンシングデバイスとして作用する足場は、予め調製されている。しかしながら、これらの感知装置は、他の検体からの干渉による誤光出力を与える可能性を有する。レシオメトリック感知装置SUの使用記載されたプロトコールで調製したものとchがこれらの可能な副作用を排除し、問題の分析物に特異的な応答を提供する可能性を保持している。 ここに提示エレクトロスパン足場は、合成共重合体による食品医薬品局（FDA）の承認を有する選択されたポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）、その生分解性および生体適合性の特性のために、トラックから調製された種々の細胞型16-18の増殖および機能をサポートするレコード。準備されたレシオメトリック分析物応答性のナノセンサーは、pHに応答する。ナノセンサーはつの色素の生体適合性ゾル - ゲルマトリックス中に二つの蛍光色素を組み込んで、FAMは、pHに応答し、それがpHに応答しないように、他の、TAMRAは内部標準として作用する。それらは有意に重複しないようにさらにFAMとTAMRAの蛍光の両方を別々に分析することができる。蛍光EMIの比を決定する特定の波長での両方の色素のssionは、他の環境条件とは独立したpH応答を与える。自己申告足場が開発3Dモデルを中断することなく、 その場でリアルタイムでのpHの反復評価を可能にすることができる。我々は、これらの足場は、細胞付着および増殖を支持することが可能であり、問​​題の分析物に応答性を維持することを実証した。操作された構築物中の副生成物の酸性の動態は代役のままであり、そのようなpH応答性足場を使用して大幅にそのような研究19を容易にすることができる。さらに、組織工学用途のための自己報告の足場の使用は、非侵襲的かつリアルタイムで、in vitroでの 3Dモデルの組織構築物の増殖を完全に理解するための機会を提供し、監視し、最適化する。 pH応答性ナノセンサーはまた、エレクトロのPLGA scaffol上に培養した線維芽細胞の細胞内環境に配信されたDS。色素からの蛍光発光の比は、pHiはをモニターするために使用し、pHナノセンサーを組み込んだ自己申告足場と比較した。 3D環境で培養した細胞へのナノセンサーの配信が深い非破壊で構文内の分析物濃度の監視を可能にすることができます。したがってナノセンサ非破壊3Dを通して細胞の挙動を評価するための実行可能なイメージングツールは、長期的な分析を可能にする構成であってもよい。 3D構造内の個々の細胞の検体濃度をスクリーニング、彼らは十分な栄養と酸素濃度が供給されていることを確認できた。監視プロセスパラメータは、酸素と栄養分の有効質量の輸送のために標準化された技術の開発を支援することができる。細胞内環境およびポリマー足場中へのナノセンサーの取り込みに対するナノセンサーの送達は、3D定数内で細胞生存率の評価、ならびに足場性能を可能にするために組み合わせることができる組織の成​​長プロセスの間にructs。これはこれらの構築物の増加の知識につながり、生物学的に関連組織代替物の製造を進行することがある。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

適切な足場上に3Dで細胞を培養すると、より良好なin vivoでの微小環境を模倣し、細胞-細胞相互作用を増大させると考えられている。結果の3D携帯構築物は、多くの場合、2次元で研究の同様の実験よりも分子事象および細胞間相互作用を研究するより関連することができます。足場を通して高細胞生存性との効果的な3D培養物を作成するために、酸素、注意深く分析物濃度の勾配のように制御することが必要なpHなどの培養条件は、3D構築物の全体にわたって存在することができる。ここでは、ポリ哺乳動物細胞の培養のためのそれらのその後の製剤と共に（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場内に生体適合性のpH応答性ゾルゲルナノセンサおよびそれらの取り込みを調製する方法を記載している。 pH応答性スキャフォールドは、3D携帯構文内微小環境pHを測定するためのツールと​​して使用することができます。さらに、詳細なpH応答性nanoseの配信成長エレクトロPLGA足場によってサポートされていた哺乳動物細胞の細胞内環境にnsors。 pH応答性ナノセンサーの細胞質の位置は、進行中の実験の間、細胞内pH（PHI）を監視するために利用することができる。

調製されたpH応答性ナノセンサーのサイズ分布は、撮像されたナノセンサーの集団を測定し、240から470ナノメートル（ 図1A）の範囲のナノメートル寸法を有することが見出されたSEMを用いて特徴付けた。狭いと合理的に小さな直径の達成は、ナノ粒子を調製するためにストーバー法を用いてと一致する。これは、酸性条件を用いて調製粒子サイズの幅広い分散を生成するのに対し...

Watch this Scientific Journal Video about Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture at JoVE.com

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K ビュー.  University of Nottingham. 生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるの?...

ビデオ: Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

動脈組織工学におけるエラストマーのPGSの足場

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

生物工学

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

ヒアルロン酸を用いた神経膠芽腫患者由来細胞の 3次元培養ヒドロゲル

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...