この作品はHHMI 56006760から（GM45735、JDV、DMAWに国立衛生研究所（NIH）（2 TL1 RR 24158から6）、およびエリソン医療財団（AG-SS-2465）およびNIHからの賞によってサポートされていましたLPへGM45735S1とGM096445）。 GM45735S1は、2009年のアメリカの回復と再投資法の下でNIHから発行されました。これらの研究に用いられる顕微鏡はNIH / NCIの助成金（5 P30 CA13696）を通して部分的にサポートされていた。

1。バイオセンサーと酵母細胞の形質転換<ol><li>酢酸リチウム法27を用いたプラスミドベアリング水戸roGFPまたはmitGO-ATeam2で希望の酵母株を変換します。 </li><li>プラスミド媒介バイオセンサーとの変換を確認するために、プラスミドの損失を防ぐために、選択し、適切な選択的な合成完全培地（水戸roGFP用SC-浦、またはmitGo-ATeam2用SC-レイ）で形質転換体を維持します。蛍光プローブは、ここで説明したものとは異なるプラスミドにサブクローニングされている場合は、適切な選択培地を使用する。彼らは蛍光バイオセンサーを表現していることを確認し、正常なミトコンドリアの形態を示すように、蛍光顕微鏡で形質転換体を可視化する。 </li></ol> 2。イメージングのための細胞および準備の成長細胞機能および薬物治療に対する応答は、細胞密度および代謝活性に大きく依存している。最良の結果が得られた場合細胞（ - 1×10 7細胞/ ml半ば対数期、〜0.5）活発に分裂している。一貫性のある密度の中間対数期文化を生成するための最も信頼性の高い方法は、定常期前培養から接種することです。 <ol><li>定常期前培養の準備：プレートから形質転換細胞の単一コロニーを選択し、選択的な液体培地（50ミリリットルコニカルボトムチューブ5 ml）を接種。 600nmの（OD 600）での文化の光学密度がプラトー（24〜48時間）に達するまで、225 rpmで振とうしながら30℃で成長する。 </li><li>観察用半ば対数期の文化を準備：50 mlコニカルボトムチューブに選択培地を5mlに接種し前培養の適切なボリュームを使用しています。 YPD培地は自家蛍光であり、これらの研究のために使用すべきではありません。合成が完了すると、グルコース基づき、ドロップアウト（SC-浦）メディアを使用してください。 （ - 1×10 7細胞/ ml〜0.5）は、半ば対数期に到達するまで、4-16時間、225 rpmで振盪、30℃で細胞を成長させる。細胞密度を決定することができるOD 600を測定することにより、正確な読み取り値OD 600を決定するために分光光度計を較正する。当社ベックマンDU530（INベックマン·コールター、インディアナポリス、）では、中期対数期は0.1〜0.3のOD 600に対応しています。 </li></ol>水戸roGFP1代謝変化に反応して細胞小器官で感知する変動。たとえば、酵母が発酵性炭素源（ 例えば 、グルコース、SCメディアのように）と非発酵性炭素源（ 例えば 、グリセロール、SGlycメディアのように）で、さらには同じものの別のバッチで育つときミトコンドリアの酸化還元状態が変化し、このアッセイにおいてメディア。したがって、すべての実験のためのメディアの同じバッチを使用しています。 <ol start="3"><li>まだ処理が実行されていない場合、細胞は、濃度の準備ができて（ステップ2.4​​を参照）及び結像ある。細胞が治療を受けている場合は、適切な治療で細胞をインキュベートし、次のステップに進みます。 </li><li> 15秒間6,000×gで遠心分離により培養液1mlを集中し、メディア20μlの中の細胞ペレットの再懸濁。これらの条件は、視野内の識別可能なセルの数を最大化します。 </li><li>スライドに再懸濁した細胞2μlのを適用します。カバースリップ（第1.5、好ましくは、高パフォーマンスの170±5μmの厚さ）でカバー、クリアマニキュアまたはvalap（試薬を参照）でカバースリップの端をシールします。 valapで密封する、ブンゼンバーナーの炎の上に保持することによって金属へらで少量を溶かし、その後、カバースリップの端に沿って少量を広げた。 </li><li>撮影中に30℃で細胞を維持します。イメージングのために使用される100倍油浸レンズで客観ヒーターは、このアプリケーションに適しています。これらの条件、ミトコンドリアの形態、レドックス状態とATPレベルの下で10〜15分間の撮影中に変更されないままです。 </li></ol> 3。イメージングセットアップ<ol><li>広視野蛍光顕微鏡でイメージング水戸roGFP1のセットアップ ここでの手順はAxioObseに合わせて調整されコリブリLED励起源を備えrver.Z1顕微鏡、広視野オルカERカメラやAxioVisionの取得ソフトウェア。水戸roGFP1酸化のチャンネルと光変換の両方で退色は、水銀アーク灯照明（下記参照）に比べてLED照明を使用して大幅に減少します。 信号と解像度を最大にするために、客観的に可能な限り最高の開口数、十分な空間分解能を提供する最小の倍率を使用しています。また、水戸roGFPイメージングのため、目標は365 nmでよく送信することを確認します。 100x/1.3NA EC PlanNeofluar対物レンズ（ツァイス）は、このアプリケーションに適しています。 酸化および還元水戸roGFP1種をキャプチャするために取得ソフトウェアを設定します。我々は、次の条件を使用しています。 <ol><li>そのような付属excitatioと38 HEフィルターセット（ツァイス）として、365 nmの（100％電源LED）の励起とGFP適しエミッションフィルタを使用するために酸化水戸roGFPのチャネルを設定するnはフィルタがキューブから削除されます。励起フィルターの除去はこのようにして達成可能な時間分解能を増加させる、フィルタを切り替える必要なしに365 nmおよび470 nmでの励起の両方を可能にする。 </li><li>上述したように、470 nmの（100％電源LED）で励起を使用するように減少水戸roGFP用のチャネルを設定し、同じ発光フィルターキューブは、酸化水戸roGFPに使用。空間分解能を最適化するために、1x1のビニングにカメラを設定してください。 </li><li>各z位置におけるチャネルの両方を収集し、0.5μmの間隔で11スライスから成るAZスタックを取得するために、ソフトウェアを設定します。買収のこのモードでは、順番に各Zスタックを取得するよりも遅いですが、それは酸化および還元チャネルの獲得の間にミトコンドリアの動きから生じるアーチファクトを防ぐことができます。 </li><li>画像いくつかのセルが強くなく、飽和信号を生成し、適正な露光時間を決定する。すべての実験に酸化され、ミト-roGFP1低減するための露光時間の比率を維持することが重要であるS。水戸roGFP1酸化および還元のための露光時間は、それぞれ300および100ミリ秒、ある場合たとえば、その後水戸roGFP1酸化のための露光時間はためには、すべての実験のために水戸roGFPを減少させることを3倍にする必要があります。 </li></ol></li><li>スペクトル共焦点顕微鏡でイメージングmitGO-ATeam2のセットアップ mitGO-ATeam2、GFP（エミッション最大510 nm）をからの蛍光を用いたATPレベルを定量化するためにOFP（発光極大560 nm）をからその区別しなければならない。これらの蛍光プローブが発する蛍光を解決蛍光フィルターセットがあります。しかし、我々は、共焦点顕微鏡をスキャンし、多くのレーザーで利用できるスペクトル検出器は、このアプリケーションに最適に動作することを見つける。スペクトル検出器は、波長に応じて多くのコンポーネント（通常は32以上）に蛍光発光を分離。いくつかの隣接する波長帯域は、一つの画像チャネルに結合することができる。組み合わされる波長は、経験的にそうGからの信号を最大にするように選択されるFPとOFP FRET測定を混乱なる信号の交差は避けながら。利用可能な最高の開口数レンズを使用してください。我々は100x/1.49または60x/1.49のApo-TIRFレンズを使用しています。私たちは、NISの要素ソフトウェアを実行しているニコンA1R共焦点顕微鏡を使用しています。 ATP結合型とATP-結合していないmitGO-ATeam2種をキャプチャするために取得ソフトウェアを設定します。我々は、次の条件を使用しています。 <ol><li>我々のシステム上で0.42程度のAZ解像度に対応して1.0エアリー単位（AU）にピンホールを設定します。 </li><li>画像内の空間情報を最大化するナイキストサンプリング限界に近づくためにスキャンのズームを設定します。我々のシステムではピクセルサイズは0.12μmである。 </li><li>ミトコンドリアは、撮像中に移動することができるので、512×256ピクセルにフィールドをトリミングすることにより、撮像速度を高めるために役立つことができる。我々のシステムの画像1フレームに必要な合計時間は2倍のスキャンの平均を含む、1.0秒です。所望の空間分解能に応じて、フィールドがさらにincreasにトリミングすることができます電子時間分解能を。 </li><li> 488 nmで励起すると、500からの発光を収集 - GFPのために520 nmであり、かつ550〜 - OFPのために580 nmである。実際の最適値は、撮像システムの特性によって変化し得る。 </li><li>我々のシステムに対する最適なレーザパワーが6.0と6.4％の間である。最適なレーザパワーは、各顕微鏡シ​​ステムごとに異なりますが、それでも解釈画像を生成しながら、理想的にはできるだけ低くなる。任意の光学系では、時間の経過とともに通常は発生レーザパワーの変化を監視するために、内部または外部のパワーメータを使用してください。 </li><li>できるだけ多くの細胞などのために、信号を画素値の検出範囲を最大にするしかし飽和を避けるために、検出器利得と照明光の強度を調整する。 1％以上の飽和画素を含む任意の細胞を分析しないでください。イメージには、すべて同じ目的、レーザーパワー、スキャンズームを使用してサンプル、ピクセルサイズ、ゲイン、オフセット。 </li></ol></li></ol> 4。画像収集<ol><li>フォーカルPLAを見つけ<html>蛍光プローブを漂白最小限にするために透過光を使用して目的の細胞のね。 </li><li>興味のある1つまたは複数のセルを配置した後、0.5μmのステップサイズを用いた典型的なセル（約7ミクロン）の全体の深さを通してZシリーズを収集します。 </li><li>画像他のスライド上の目的の細胞が、イメージより長い15分間単一のスライドしない。スライド上で15分後、細胞は生存率を失う。 </li></ol> 5。分析ミトコンドリアATPレベルは510 nmでそれに560 nmでmitGO-ATeam2発光の比率を測定することによって決定される27オルガネラの酸化還元状態はミト-roGFPの（R / O）、酸化比率に減少として測定される; すなわち 365 nmで励起510 nmでの発光で割った470 nmで励起510 nmでの発光。比を計算する前に、我々は、バックグラウンドを差し引き、蛍光ミトコンドリアに属する画素のしきい値を決定する。 10トン&quot;&gt;公共ドメイン（ 例えば ImageJの30）または市販の（ 例えば Volocity、パーキンエルマー）ソフトウェアが水戸roGFP1またはmitGO-ATeam2の分析に使用することができます。画像取得のために、分析のために使用するソフトウェアによっては、画像第解析ソフトウェアでそれらを開く前に、例えばTIFFなど、別の形式に変換する必要があるかもしれない。画像が変換される場合は、画素値を変換中に変更されていないことを検証することが不可欠である。ミト-roGFP1データの解析を用いて両方のプログラムは以下のとおりです。各メニュー内で選択するには、プログラムのメニューとオプションは太字イタリック体で強調表示されています。 5.1 ImageJの分析<ol><li>画像を開くと32ビットにタイプを変更： 画像→タイプ→32ビット。 </li><li>まだ細胞が存在しない領域における関心領域（ROI）を描く。このROIの平均強度を計算します→測定を分析します。 </li><li> プロセス→数学→減算 ：スタックから計算された平均バックグラウンドを減算。 </li><li>減算zスタックを使用して、ミトコンドリアの中央スライスとしきい値を見つける： 画像は→→しきい値を調整し、しきい値ウィンドウで[Apply]をクリックします。スタック内のすべてのスライスに適用されます。 NaNに背景ピクセルを設定し確認してください。 </li><li>比率を作成し、Zスタック： プロセス→画像電卓水戸roGFP1解析用酸化Zスタックによって減少スタックを分割します。 mitGO-ATeam2解析用の510 nmの（ATPの結合していない）画像によって560 nmの（ATP結合型）画像を分割します。 </li><li>関心のある領域の周りにROIを描画します。 →ツール→ROIマネージャーを分析し選択し、ROIを記録するために[追加 ]をクリックします 。複数の領域にマネージャーに格納することができる。 ROIマネージャで、すべてのROIを選択して、[M]を選択します鉱石→すべてのスタックのスライスを測定するマルチ測定。分析のためのスプレッドシートにデータをエクスポートします。 </li></ol> 5.2 Volocity分析<ol><li> Volocityライブラリに画像をインポートして、2チャンネルの画像シーケンスを作成します。 </li><li>まだ細胞が存在しない領域における関心領域（ROI）を描く。選択してください：[ツール]→[比率。 </li><li> ROIから取得 ：バックグラウンドを計算するためにVolocityを使用します。 </li><li>ミトコンドリアの構造を含むようにしきい値を調整します。 </li><li>比チャネルに虹のLUTを適用するオプションをチェックします。強度変調チャネルプレゼンテーション-るためのノイズの少ない画像を生成することがありますが、それは平均的な比率の定量のために使用すべきではありません。 </li><li> 測定タブを選択し、比率のチャンネルを選択して、関心のある領域の周りにROIを描画します。ゼロ値を除いた比率チャネルを測定します。複数の領域を選択して測定することができる同時に。分析のためのスプレッドシートにデータをエクスポートします。 </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

ここでは、酵母細胞を生体内でミトコンドリアの酸化還元状態とATPのレベルを評価するためのバイオセンサーとして水戸roGFP1とmitGO-ATeam2を使用する方法について説明します。私たちは、定量的なミトコンドリアの形態や分布や細胞の成長率に明らかな影響を与えることなく、ミトコンドリアを標的にプラスミド媒介水戸roGFP1またはmitGO-ATeam結果の発現を見つける。3水戸roGFP1は高度か?...

ミトコンドリアは、アミノ酸、脂肪酸、ヘム鉄硫黄クラスターおよびピリミジンのATP産生合成に必須の細胞小器官である。ミトコンドリアはまた、カルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている、とアポトーシスの制御インチパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、およびハンチントン病を含む老化や加齢に伴う疾患にミトコンドリア1増やす証拠リンクしています。2個人がで彼らの全体の生活をしながら神経変性疾患に関連付けられているミトコンドリアタンパク質の変異は、病気の症状だけでその後の人生で起こる。これは、その変化が出現する疾患は病理許す年齢とともにミトコンドリアで発生することを示します。確かに、ミトコンドリアの適性が全体細胞の健康と寿命酵母および哺乳類細胞と相関している。ここ3,4、我々はmitocの2つの重要な機能を評価するために、遺伝的にコード化され、レシオメトリック蛍光バイオセンサーを使用する方法について説明します酵母細胞を生体内でhondria：レドックス状態とATPレベル。 有酸素エネルギー動員におけるミトコンドリア機能が十分に確立されている。ミトコンドリアの酸化還元状態は、NAD + / NADH、FAD / FADH 2、NADP + / NADPH、グルタチオン/グルタチオンジスルフィド（GSH / GSSG）と活性酸素種（ROS）を含む、オルガネラの種を還元し、酸化生成物である。ミトコンドリアまたは低酸素脱共役するミトコンドリア呼吸活性に影響を及ぼすとオルガネラにNADHにNAD +の比率を変更します。ミトコンドリア内膜における電子伝達鎖の複合体との間の非効率的な電子移動から、並びにミトコンドリア外膜5、破損脂質、タンパク質、および核酸におけるモノアミンオキシダーゼを介してアミンの脱アミノ化から製造し有するROS、 6,7,8老化や加齢に伴う神経変性疾患にリンクされて。 ROSはまたメートルのシグナル伝達に関与するitochondria、GSHの酸化による。例えば、NADHデヒドロゲナーゼは、ROS産生に寄与するだけでなく、グルタチオンプール9,10との相互作用を介して調節される。 α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとアコニターゼ、TCAサイクルのコンポーネントは、環境の11,12を酸化で還元活性を示す。 実際、アコニターゼ活性のレドックス依存性調節は、細菌から哺乳類13,14に保存されている。したがって、酸化還元状態とミトコンドリアのATP濃度を監視することは、疾患の病理にその機能と役割を理解する上で重要です。 生化学的方法は、酸化還元状態又は全細胞または単離されたミトコンドリアのATPレベルを評価するために使用されている。全細胞やミトコンドリア孤立の酸化還元状態を評価するため、広く用いられている方法は、酸化還元対GSH / GSSG 15のレベルを測定することに基づいています。ルシフェリン - ルシフェラーゼ系は、一般に、ミトコンドリア測定するために使用されるミトコンドリア膜透過し、全細胞又は単離されたいずれかATPレベル。16,17,18,19,20このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ量に比例するATPに結合し、ルシフェリンの酸化の化学発光を触媒する。21の出射光の強度反応混合物中のATP。22のこれらの方法は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する患者は、異常に低いATPレベルを有するという発見を含むミトコンドリア機能に関する基本的な情報を明らかにした。23しかし 、それらは画像の生活に使用されることができない、無傷の細胞。また、全細胞分析に基づく方法は、セルのすべてのコンパートメント内レドックス状態またはATPレベルの平均を提供する。ミトコンドリアの酸化還元状態やATPレベルは細胞下分画中に変更される可能性があるため孤立した小器官での測定は、潜在的に問題がある。最後に、我々の研究室等からの最近の研究では、ことを示している個々の細胞内のミトコンドリアが交互に母と娘細胞の寿命に影響を与える機能、不均質であるので、3つの細胞内解像度を有する生細胞におけるミトコンドリアATPレベルおよび酸化還元状態を測定する必要がある。 ここで説明するミトコンドリア機能のためのバイオセンサーは、両方のGFPに基づいています。レドックス感受性GFP（roGFP）24,25は、表面露出システインが分子に付加されたGFP変異体である。 roGFPは、野生型GFPのように、2つの励起ピーク（〜400 nmおよび480 nmで〜）および〜510nmで少なくとも一つの発光ピークを有する。 〜400 nmでの励起の増加roGFP結果中のシステイン残基の酸化。それらのシステインの減少は〜480 nmで励起を好む。これにより、480 nmおよび400 nmでの励起roGFP 510nmでの発光の比率は、フルオロフォアの環境の酸化還元状態を反映低減および酸化roGFPの相対量を明らかにする。 二つVERSroGFPのイオンが広く使用されています：roGFP1とroGFP2。どちらも同じシステインの挿入が含まれています。 roGFP1は、野生型GFPに基づいており、roGFP2はwtGFP 24に比べて400 nmで480 nmでのより効率的な励起の少ない効率的な励起を持っS65T GFP、に基づいています。 roGFP1はroGFP2とそのダイナミックレンジが減少の範囲にさらに拡張するよりも敏感な小さいpHである。したがって、roGFP1は以上の還元などのミトコンドリアなどの区分や細胞質ゾル、そのようなエンドソームなどの変数のpHとコンパートメントを監視するためのより便利かもしれません。 roGFP2が明るく信号と、いくつかの研究で、roGFP1 24,26よりも大きなダイナミック·レンジを提供しています。 シロイヌナズナにおける研究では、酸化還元状態の変化に対応するために必要な時間は、両方のセンサ（T½酸化のために、65と95秒とt½それぞれroGFP1とroGFP2ための削減、272および206秒、など）についても同様であることを示している。26 MitGO-ATeam2は、信頼性、低侵襲である出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でミトコンドリアのATPを測定するセンサ。 GO-ATeamは、ドナーとアクセプター蛍光タンパク質（GFPおよびオレンジ（OFP）蛍光タンパク質をそれぞれ）FRET F プレーヤーの間に挟まれたF 1-ATPシンターゼのεサブユニットから構成されるフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブである。27アクセプターの近くにドナーをFRETドナーからアクセプターへのエネルギー伝達を可能にさせるタンパク質の立体構造変化におけるεサブユニット結果にATPの結合。 GO-ATeam、GO-ATeam1とGO-ATeam2の二つの変種があります。 GO-ATeam2は、ミトコンドリア内で細胞質ゾルに比べて一般的に低い[ATP]を測定するための、それがより適切な意思、GO-ATeam1よりMgATPに対して高い親和性を持っています27 ミトコンドリアの酸化還元状態を調べるために、我々はATP9リーダー配列に融合roGFP1からなる融合タンパク質（水戸roGFP1）を構築しndは強いグリセルアルデヒド-3 - リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD）プロモーター（p416GPD、Addgene）の制御下でプラスミドセントロメア系（低コピー数）酵母発現から発現。我々はモデル菌サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の老化の文脈でミトコンドリアの酸化還元状態を調べるためにroGFP1を使用していました。我々はroGFP1、老化中および栄養可用性に応じて発生するが、酵母細胞には明らかな有害な影響を及ぼさないミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出できることがわかります。また、個々の生きている酵母細胞内のミトコンドリアの酸化還元状態の変動、細胞内の空間分解能でバイオセンサーの重要性を強調している知見を参照してください。 MitGO-ATeam2はGO-ATeam2のアミノ末端に挿入シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIIIAのミトコンドリアシグナル配列を持つGO-ATeam2の変種です。27私たちは、親切にHの研究室が提供するmitGO-ATeam2プローブ（修正野地研究所Oプラスミド低コピーである酵母発現ベクターpAG415GPD-CCDB（Addgene、ケンブリッジ、MA、USA）にXba1とHindIII部位を経由して、それをサブクローニングすることにより酵母で使用するためのfの科学産業研究、大阪大学、日本）、強力な構成GPDプロモーターを含む。私たちは、出芽酵母でmitGO-ATeam2を表明し、それがミトコンドリアのATPレベルの生理的変化を測定するための効果的なプローブとして機能し、それがミトコンドリアに排他的に局在し、DNA結合色素DAPI、、との対比により、見つける。 roGFPとGO-ATeamは、遺伝的にコードされている両方。結果として、それらが導入され、安定的に維持無傷の細胞において、酸化還元状態または個々の、生細胞内ATPレベルに関する情報を提供することができる。さらに、両方のバイオセンサーは、酸化還元状態や生理的条件下で発生するATPレベルの変化を監視します28両プローブもレシオメトリックである。その結果、これらのプローブを使用した測定は、茶の影響を受けませんバイオセンサー濃度またはサンプル照明や厚さNGES。最後に、両方のバイオセンサーは、細胞内の空間分解能を提供します。実際、roGFPはミトコンドリア、小胞体に標的化された、エンドソームと24ペルオキシソーム、およびpHの大部分は独立したこれらの細胞小器官のそれぞれの酸化還元状態の変化を検出することができる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

ミトコンドリアはエネルギー代謝や細胞の寿命とプログラム細胞死を制御するカルシウムの恒常性から、多くの細胞プロセスで役割を持っている。これらのプロセスには影響を与え、ミトコンドリアでの酸化還元状態とATP産生の影響を受けている。ここでは、酵母細胞を生きた細胞内での解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを検出できる2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用を記載している。ミトコンドリアの酸化還元状態は、ミトコンドリアマトリックスを標的とレドックス感受性緑色蛍光タンパク質（roGFP）を用いて測定される。水戸roGFPは、順番に、タンパク質の励起スペクトルを変えるリバーシブルと環境依存の酸化還元を受ける位置が147とGFPの204でシステインを含んでいます。 MitGO-ATeam F O F 1-ATPシンターゼのεサブユニットとの間に挟まれたフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブはドナー及びアクセプター蛍光のFRETされているrescentタンパク質。もたらすタンパク質における立体構造変化εサブユニット結果にATPの結合は近接ドナーとアクセプターとのFRETドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする。

水戸roGFPとミトコンドリアの酸化還元状態を測定ここでは、ミト-roGFP1は、酵母細胞増殖またはミトコンドリアの形態に影響を与えることなく、生きた酵母細胞を低減するために完全に酸化からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出するためにダイナミックレンジを有することを示す。まず、ミトコンドリアを標的とGFPとroGFP1を発現する細胞は、通常料金（ 図1A?...

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Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

我々は、生きた酵母細胞における細胞内解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを監視するために、GFPをもとにしている2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用が記載されている。

リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.9K ビュー.  Columbia University. 我々は、生きた酵母細胞における細胞内解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを監視するために、GFPをもとにしている2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用が記載されている。

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

生物工学

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

多重経皮電気化学センシングのための中空マイクロニードルベースの​​センサ

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...