丸型精子細胞注射は、一部の非閉塞性無精子症患者の生殖の問題を解決できますが、その効率は非常に低いです。本研究では、マウスをモデルとして、ROSIのマウス胚発生効率を向上させる方法を探索しました。不完全な統計によると、世界で出産されたヒトROSI受胎胎児は200人未満です。
ROSI技術の可能性を理解する転機となったのは、2015年に田中らがROSI技術によって14人の胎児が成功したことを報告したことであり、その臨床応用と実現可能性に対する自信を新たにしました。現在、ROSIの研究は、エピジェネティックな修飾の異常や卵子の活性化の異常に着目していますが、精子の丸いデータを正確に特定することも課題となっています。マウスのROSI胚の発生効率は、私たちの研究室でもすでに非常に高く、他の研究室と同程度です。
しかし、人間のような非げっ歯類の発達効率はまだ非常に新しいです。今後は、非げっ歯類の開発効率の向上に注力していきます。まず、6〜8週齢の雌マウスに、午後5:00に妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピンと48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピンのそれぞれ7.5国際単位を腹腔内に注射します。
注射後に雄マウスとの接触が発生しないようにしてください。マウスを安楽死させた後、腹腔を開きます。はさみを使用して、両方の卵巣の近くで卵管を切断し、摂氏37度に予熱したM2バッファーに入れます。
正立顕微鏡の10倍対物レンズの下で、卵管の透明で拡大した部分を見つけます。その後、1ミリリットルの注射器を用いて卵管を固定し、肥大した部分を切断し、卵子冠状卵丘複合体を採取します。顆粒膜細胞を除去するには、0.1%ヒアルロニダーゼを含む予熱したM2操作溶液に卵母細胞複合体を入れ、経口ピペットで静かに息を吹きます。
卵子をKSOMaa液滴に順次移して3回すすぎ、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに入れます。まず、安楽死させた8〜10週齢のオスのC57BL / 6マウスを入手します。腹腔を開き、ハサミで精巣近くの精巣上体を優しく切除します。
精巣上体を含む皿をM2培地に正立顕微鏡の10倍対物レンズの下に置きます。そして、1ミリリットルの注射器を使用して、精子をそっと切除して精子を流出させます。懸濁液中の流れる精子を、0.5ミリリットルのM2緩衝液を含むチューブの底に吸い上げます。
円形の精子細胞を単離するには、解剖した睾丸をM2バッファーに移します。1ミリリットルの注射器を使用して、顕微鏡下で白い膜を静かに切断し、次に回旋した精細管を絞って切除します。懸濁液を抽出した後、400メッシュのふるいでろ過し、ろ過した細胞を遠心分離します。
上清を捨て、細胞を200マイクロリットルのHoechst 33342と摂氏37度で10分間インキュベートします。染色した細胞が入ったサイトメトリーチューブをフローサイトメーターに入れます。電圧を調整した後、前方散乱と側方散乱に基づいて細胞集団を選択します。
次に、前方散乱とトリガーパルス幅に従って細胞接着を除去します。波長355ナノメートルのレーザーで2つの検出チャンネルを使用して、丸い精子細胞を選別し、摂氏4度で保存します。顕微鏡下では、マウスの丸い精子細胞は直径約10マイクロメートルで、中央に突起状の核小体構造を示しました。
まず、マウスから卵母細胞と丸い精子細胞を入手します。次に、適切な直径の保持針と注射針を準備します。卵子をサイトカラシンBの有無にかかわらず10マイクロリットルのM2液滴に入れ、配偶子を柔らかくして保存します。
次に、丸い精子細胞のM2液滴を置き、顕微鏡の手術台に手術皿を取り付けます。注射の位置を調整し、針を固定します。ポリビニルピロリドン(PVP)を使用して、注射針を湿らせて洗浄します。
次に、丸い精子細胞を注射針に抽出します。保持針で卵子を回転させて、卵母細胞の極体を12時の位置に向けます。次に、注入針を卵子の3時の位置に注意深く置きます。
PiezoXpertデバイスを使用して、卵母細胞の透明帯に穴を開けます。その後、注入針を卵子の中にゆっくりと水平に進め、卵子の膜を破裂させます。丸い精子細胞を卵母細胞の細胞質に徐々に注入します。
注射針を引き出し、開口部の近くに少量の卵母細胞の膜を吸引して密封します。細胞質内精子注入の場合は、精子をPVP滑走路に置きます。尾から精子を吸引し、その首を注射針の口に置きます。
ピエゾを適用して、精子の頭を尾から分離します。次に、前に示したように、直径9〜10マイクロメートルの注射針で精子を卵子に注入します。卵子の活性化を補助するには、卵子を20マイクロリットルのカルシウム液滴と塩化ストロンチウム六水和物を含むマグネシウムフリーCZB培地に入れます。.
その後、KSOMaa培地に移して培養します。同時に、発生学的研究のために丸い精子細胞や精子を注入することなく、単為生殖活性化のためのグループを確立します。活性化後、KSOMaa培地に移して培養します。
円形精子細胞を注入した胚は、細胞質内精子を注入した胚と比較して発生効率が低下しました。
