LMWとRHKは生物医学科学と工学（GSBSE）のUMaine大学院によってサポートされています; RHKもメイン農業＆森林試験場によってサポートされていました。追加資金は、一般医科学研究所（NIH P20-GM103423）、メイン州農業＆フォレスト実験ステーション（グラント番号ME08004-10、JAG）、メインADVANCEライジングタイドセンター（NSFグラント＃1008498）大学によって提供されました、とPhRMAの基礎（JAG）から薬理/毒性の研究スターターグラント。私たちは、博士に感謝します。抗原およびセルのデイビッドHolowkaとバーバラベアード。我々は、機器と注文のヘルプのためのひなハシミ、アレハンドロベレス、とアンドリューAbovianに感謝しています。これは、メイン州農業＆森林試験場公開番号3311です。

我々は、開示することは何もありません。

2004年に、Naal ら は、脱顆粒1の高スループット試験のため、肥満細胞バイオセンサーを開発した。それは私達が私達のTCS研究のために適応され、このビデオで詳述していることを堅牢アッセイである。前にNaal ら 1アッセイ、マスト細胞の脱顆粒が日常β-ヘキソサミニダーゼ59-61によって評価が、これらの初期の方法は、一つのサンプルを一度に読み込みされた?...

マスト細胞は喘息、アレルギー、寄生虫防衛および発癌13-16で重要なメディエーターとして機能性の高い造粒免疫エフェクター細胞である。彼らは、脱顆粒するために活性化されるまで、彼らは無事に質顆粒にアレルギー性および炎症性メディエーターを保管ほぼすべての血管組織15に存在します。脱顆粒は、そのようなヒスタミン、トリプターゼ、およびロイコトリエン15と薬理学的に活性なメディエーターの放出をもたらす膜結合顆粒のエキソサイトーシスである。寄生虫に対する防御だけでなく、アレルギー性喘息、および発がん応答15を開始することをマウントする上で重要であるI型過敏性反応の開始でこのプロセスは結果。 肥満細胞および好塩基球は、FcεRIを受容体、免疫グロブリンE（IgE抗体）17のための高親和性受容体を発現する。アレルゲンまたは抗原への曝露は、複数のIgE結合したFcεRIを受容体17の凝集を引き起こし、それがこのsであるチロシンリン酸化事象のカスケード、ホスホリパーゼC、内部貯蔵からのカルシウムの流出、およびセル18へのカルシウムの流入の活性化：脱顆粒プロセスを開始したIgEに結合したFcレセプターの&quot;架橋&quot; O-と呼ばれる。このカルシウム流入は、脱顆粒のために必要であり、さらに、顆粒のエキソサイトーシス15を起こす前に、膜と顆粒の融合を通知します。実験的に、カルシウムイオノフォアを直接本質的にすべてのシグナル伝達は、上流または下流のものとして毒物による経路標的の同定を可能にする、カルシウム流入工程20の前にステップ迂回細胞膜19を横切って往復カルシウムを使用することができカルシウム20に信号を送る 。 脱顆粒は、ヒスタミン6一緒に顆粒から直線的に放出される細胞上清の中にβ-ヘキソサミニダーゼの放出を監視することにより、迅速かつ効果的に測定された、しかし、私ができるシンプルな酵素 - 基質反応およびアッセイ蛍光生成物をするマイクロプレートリーダーを用いて検出するのははるかに簡単。このマイクロプレートアッセイ、プロトコル·セクションに詳述したように、最初にNaal らによって開発された堅牢な方法に基づいている。1で4 -メチル-N-アセチル-β-D-グルコ蛍光基質の切断を定量化β-ヘキソサミニダーゼ。私たちは、トリクロサンはここに強調​​して、薬や毒物の影響をテストするためのアッセイ法を変更しました。この方法は確実に脱顆粒を定量化する、例えば、フローサイトメトリーベースの検出方法21に安価な代替品であり、抗アレルギー薬の多種多様なハイスループットスクリーニングにうまく自分自身を貸すする可能性があるだけでなく、免疫毒性またはアレルギー物質。この最後の点は、21 世紀 、2007年の国立研究協議会報告書&quot;毒性試験の観点から特に重要である：ビジョンとストラトEGY &quot;（ <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a>マウスのような伝統的な実験動物の高価な使用を減らすために、細胞培養を利用した高スループット毒性試験の開発のための提唱）。 Naal らによって開発された1、私達2によって変更された脱顆粒プロトコルは、相同なヒト粘膜肥満細胞または好塩基球3-5に広く受け入れられているモデルであるRBL-2H3細胞株を利用する。 （培養RBL-2H3細胞のための方法は、ハッチンソンらに詳述されている。22）。このアッセイは、おそらく接続されているすべての肥満細胞のタイプに適合させることができる。 トリクロサン（TCS）は、病院、パーソナルケア製品、および消費財23,24において30年以上に使用されている広域スペクトル抗菌薬である。 TCSの抗菌特性の作用機序は、エノイル-アシルを阻害することによって可能性が高い、脂肪酸生合成の阻害であるキャリアタンパク質レダクターゼ25,26。このようなシャワージェル、ハンドローション、歯磨き粉、うがい薬、および0.3％または10 mMの24までの濃度におけるハンドソープのような消費者製品の広い範囲で世界的に見られる。 TCSの普及は人間27-29や河川30で検出可能なレベルをもたらしました。 Allmyr らによって行われた研究27は、TCSとその代謝物は、授乳中の母親からプラズマとミルクの両方に存在していることを実証した。重要なのは、TCSは容易に皮膚31-37に吸収される。 Queckenberg ら 37は、肥満細胞が存在する皮膚にかなりの濃度で、その結果、12時間以内に人間の皮膚に〜70mMのTCSクリームの約10％の吸収を発見した。 TCSは、ヒトのアレルギー性皮膚疾患7-11を管理するために臨床的に示されているが、TCSが、アレルギー性皮膚疾患を緩和する機構は38知られていなかった。蛍光マイクロプレートアッセイを使用してdetailedがこのビデオでは、我々は最近、2μMという低濃度でTCSは、かなりこれらの臨床データ2のための潜在的な説明を提供して、マスト細胞機能と脱顆粒を減衰することを実証した。これらの臨床データの説明を提供することに加えて、パーマーら、我々の知見は、 図 2には、TCSがカルシウム流入の下流シグナル伝達分子標的とすることを示唆している。多くの免疫学的および他の生物学的プロセスにおけるカルシウムシグナル伝達の重要性のために、TCSは、潜在的に必要な生物学的プロセスの様々に悪影響を及ぼす可能性がある。実際には、Udoji ら 39は、TCSが別の重要な先天性免疫機能、ヒトナチュラルキラー細胞溶解活性を抑制することが示された。 アレルギー性皮膚疾患（または、逆に、免疫毒性など）で治療補助としての可能性を超えて、TCSもかく乱40-49内分泌かもしれません。このように、溶液中のこの化学物質を準備する方法についての明確な手順I毒物への興味のあるの。 TCSが小さい疎水性分子であるため、有機ビヒクルは、しばしば、水に溶けやすくするために使用される。 TCSがテストされているほとんどの毒性試験では、製剤は、エタノール、アセトン、または油2,50,51などの有機溶媒を用いて水に溶解関与している。しかし、しばしばこれらの溶剤は、それによって被験物質データ51の解釈を複雑にし、自分自身を生物学的に活性である。実際には、Rufli らによる。52等53は、水生毒性実験のための試験溶液は、毒性成果物を作成するための化学溶媒の電位により、化学的方法を介して物理的方法を用いて調製されることが推奨される。我々は以前TCSが0.24％のエタノール/水（体積/体積）中に溶解し、30分を減衰RBLマスト細胞の脱顆粒2超音波処理することを示した。 0.24％より高い濃度でエタノールが肥満細胞degraを抑制することが示されているnulation 54,55-examplesの毒性試験で有機溶剤の潜在的交絡効果の。 それだけではなく生物又は研究のために使用される細胞に対する溶媒の影響を考慮することが重要であるだけでなく、それは被験物質自体に溶媒の影響を監視することが重要である。たとえば、Skaare ら 51は、油中の解散は、関数の完全な損失を引き起こしながら、（一般的に歯磨きやうがい薬で見つかった）ポリエチレングリコールでTCSを溶解が健康な女性の女性の抗細菌および抗プラーク効果を弱めていることがわかった。したがって、異なる溶媒の能力はTCSを含む、毒物および薬物を調節するために、効果をアッセイ設計において考慮されるべきである。油または風味添加物の使用は様々な製品50,51におけるTCSの効果を妨げる可能性があります。 有機溶剤を使用する必要性を排除する目的で、我々は、有機ゾルの使用を排除することによってTCS 2を溶解させるための手法に改良ベント。現在のプロトコルでは、我々は熱（≤50°C）で水性緩衝液に直接TCS顆粒を溶解した後、紫外可視分光光度法によってこのTCSの株式の濃度を確認してください。 TCSは、40μM（最大水溶性であるため、これらの改良が可能である<a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ）および50℃（加熱されたときに分解に抵抗することが示されている<a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ）56,57。 TCSも強く4,200 L /モル/ cmで12モル吸光係数が280nmの58で吸収することが知られているように、我々はまた、UV-可視分光測定の付加的な利点を有する。 このプロトコルは、低コストかつ迅速な検証を含む、有機溶剤を使用せずにバッファにTCS顆粒を溶解するために、シンプルでありながら効果的な方法を提供濃度、およびマスト細胞の脱顆粒に対する化学的影響を監視するための強力な蛍光マイクロプレートアッセイを説明しています。

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

マスト細胞はアレルギー疾患や寄生虫に対する免疫防御において重要な役割を果たしている。かつて（アレルゲンによって）アクティブに、彼らは、アレルギー性メディエーターのエキソサイトーシスで結果そのプロセスを脱顆粒。薬物および毒物による肥満細胞の脱顆粒の変調は、人の健康に正または悪影響を与える可能性があります。肥満細胞機能は、ラット好塩基球性白血病マスト細胞の使用（RBL-2H3）、ヒト粘膜肥満細胞の広く受け入れられているモデルまでの時間を詳細に切開されている。 6肥満細胞からのヒスタミンと連携して直線的に放出される肥満細胞顆粒成分およびアレルギーメディエーターβ-ヘキソサミニダーゼを、容易かつ確実に適しているマイクロプレートアッセイで測定可能な蛍光強度を得、蛍光原基質との反応により測定することができる高スループット研究1。もともとNaal らによって出版した。1、我々は、スクリーニングOは、この脱顆粒アッセイを適応しているfは薬物や毒物、ここでその使用方法を示しています。 トリクロサンは、多くの消費者製品中に存在し、このエフェクトのメカニズムは不明であるが、人間のアレルギー性皮膚疾患における治療7-11援助であることが見出されている広域スペクトル抗菌剤である。ここでは、マスト細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの効果についてのアッセイを実証する。我々は、最近、トリクロサンを強くマスト細胞機能2に影響を与えることを示した。有機溶媒の使用を回避する目的で、トリクロサン熱と攪拌しながら水性緩衝液中に直接溶解させ、得られた濃度は、12（ε280 = 4,200 L / M / cmで使用）UV-可視分光光度計を用いて確認された。このプロトコルは、より広く、そのアレルギー電位をマスト細胞の脱顆粒に対する効果を決定するために様々な化学物質と一緒に使用される可能性があり、。

90分間50℃に加熱すると、TCSのためのUV-可視吸収スペクトルは図1に示すように、280nmの付近のピークで、260〜300nmの間の強力な、滑らかな曲線を生成する。 UV-可視分光光度計は、従って、280nmで公開されてモル吸光係数が4,200 L /モル/ cmで12であるので、濃度を計算するために利用することができる重要なツールである。我々は、TCSが50°Cに加熱した（データは示さず）後に、全体の脱顆粒...

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A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン2の強力な阻害効果を発揮するために利用。

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K ビュー.  University of Maine, Orono. マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン2の強力な阻害効果を発揮するために利用。 

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Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

隔離された心筋細胞の細胞機能に対する抗体の効果測定

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

免疫・感染学

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10における粒子結合のBet V 1アレルゲンのフローサイトメトリー分析

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

新生児カプサイシン処置によるアトピー性皮膚炎のモデルラットにホルムアルデヒドの暴露の影響

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...