このアッセイは、患者のIgEとアレルゲンの架橋によって誘導される好塩基球の脱顆粒をシミュレートする重要な研究ツールを表しています。したがってアッセイは、1型、アレルギー反応を模倣するために使用することができる。アッセイは、堅牢で再現性があり、カスタマイズ可能です。
また、少量の組換えまたは精製されたアレルゲン、あるいは複雑なアレルゲン抽出物でも行うことができるため、非常に敏感です。この方法は、アレルゲンに対する患者のIgEの反応性を分析する際に、アレルギーを診断するために使用されます。また、この方法は、クロス反応性を分析し、AIT治療の有効性を監視するのに適しています。
細胞培養フラスコからAg8細胞を採取することから始め、遠心チューブに細胞を移す。ペレットは、室温で250倍gで5分間遠心分離によって細胞を下げる。上清を吸引し、細胞ペレットを最終濃度の約10〜6番目の細胞に再懸濁し、1ミリリットル当たりヒト化した、RBL細胞培地。
アッセイで1〜20の最終的な血清希釈のためにAg8細胞懸濁液でヒト血清を1〜10に希釈し、摂氏37度と5〜7%の二酸化炭素で1時間インキュベートする。ヒト化RBL細胞が50〜90%の合流度に達すると、接着されたヒト化RBL細胞に触れることなく、T-75細胞培養フラスコから培地を慎重に吸引する。フラスコの反対側に10ミリリットルのDPBSを加え、細胞に直接入れずに細胞を2回洗います。
吸引DPBSは、細胞剥離のためにトリプシン-EDTAを1回事前に温めた5ミリリットルを加え、摂氏37度で5分間インキュベートする。フラスコを軽くタップしてセルを取り外します。細胞懸濁液を15ミリの遠心チューブに移し、ヒト化RBL細胞培地またはDPBSでチューブを充填してトリプシン-EDTAを希釈します。
室温で5分間250回gで細胞を遠心分離する。上清を吸引し、細胞数をカウントするために5ミリリットルのヒト化RBL細胞培地中のペレットを再懸濁する。細胞を計数した後、ヒト化したRBL細胞培地中の細胞を希釈し、1ミリリットル当たり6番目の細胞に2倍の10倍の最終濃度を得る。
50マイクロリットルのヒト化RBL細胞懸濁液を、ウェルごとに、滅菌96ウェルプレートのウェルあたり10〜5番目の細胞に相当する。遠心分離機は、あらかじめインキュベートされたAg8血清懸濁液を、50マイクロリットルの遠心化されたAg8血清懸濁液をヒト化したRBL細胞を含む各ウェルに、Ag8細胞ペレットを邪魔することなく移す。底部シグナル高原や背景の適応のための抗原制御なしに抗原を持たない感作非刺激細胞を使用し、バックグラウンドおよび最大のリシス制御ウェルを感作しない。
蓋でプレートを覆い、摂氏37度と5〜7%の二酸化炭素で一晩インキュベートします。細胞培地を含むセラを吸引し、吸収性紙のプレートを反転してタップし、ヒト化したRBL細胞を洗浄するためのプレートを空にする。1ウェルあたり200マイクロリットルのタイロードの緩衝液を加えて細胞を3回洗浄し、最初の2回の洗浄で1回約30秒間インキュベートする。
Tyrodeのバッファーを3回目に添加した後、バッファーを吸引し、溶液をウェルに残して、抗原希釈を追加する準備ができるまで。抗原溶液100マイクロリットルを、予感化されたヒト化されたRBL細胞を含む各ウェルに移し、抗原を用いて最大溶解および非感作バックグラウンド細胞を刺激しない。最大のリシス制御井戸、非感作バックグラウンドコントロールウェル、および感作非抗原井戸に100マイクロリットルのタイロードのバッファーを追加します。
セルを摂氏37度で1時間、二酸化炭素を5~7%インキュベートします。最大リシスコントロールウェルを10%トリトンX-100の10マイクロリットルで処理し、β-ヘキソサミニダーゼの100%放出のために細胞を完全に融解するために適切に混合する。50マイクロリットルの基質溶液を新しい非結合型96ウェルプレートに加えます。
プレートを含むヒト化RBL細胞のウェルから50マイクロリットルの上澄み物を基質溶液を含む新しいプレートに移し、37°Cで1時間プレートをインキュベートし、フッ素基質の変換を可能にします。井戸ごとに100マイクロリットルの停止溶液を加え、原稿の説明に従って蛍光を測定します。β-ヘキソサミニダーゼ活性アッセイで得られたベル状曲線は、アレルゲン過剰による免疫グロブリンEの抗原エピトープの一価の職業を示し、高い抗原濃度でのアレルゲン免疫グロブリンE架橋を阻害する。
半最大メディター放出に必要な抗原濃度を、線形回帰分析を用いて計算した。細胞生存アッセイは、刺激に用いる感作血清または抗原のいずれかに由来する細胞傷害作用を除外するために行った。β-ヘキソサミニダーゼ活性アッセイには5種類の異なるヒト血清が使用され、白樺花粉アレルギー患者に由来する5つの血清のうち4つはBet v 1刺激に反応し、Bet v 1が免疫グロブリンE媒介性アレルギー症状を引き起こす強力なアレルゲンであることを実証した。
相同症アレルゲンに対する免疫グロブリンEの交差反応性を評価した。ベットv 1に対する応答は両方の患者で見つかったが、患者2もCor a 1に応答した。Bet v 1相同種食物アレルゲンは、患者2における1つの交差反応性免疫グロブリンEレベルを示す。
アレルゲンの変異変異体変異体の低刺激性の性質を評価し、それらの野生型と比較した。Bet v 1倍変異体の放出曲線は、野生型アレルゲンと比較してより高い抗原濃度に向かってシフトし、その結果、抗原の濃度が有意に高くなり、半分の最大放出を引き起こし、突然変異体のアレルギーが少なくなり、したがってアレルゲン特異的免疫療法の候補となる。細胞が乾燥するのを避けるために抗原希釈を適用するまで、細胞に洗浄液を残すことを忘れないでください、そうでなければ、これはアッセイの性能が悪くなるでしょう。
このアッセイは、アレルゲン特有の免疫療法に使用される皮膚プリック試験溶液または抽出物などの生物学的活性に基づいて、アレルギー性製品の標準化を含む多くの異なる用途に使用することができる。
