私たちは、HERV-V2プロトコルの初期の開発と最適化への貢献のためにセシルMontgiraud、ジュリエット·ヒメネス、マガリJaillardとベルトランBonnaudに感謝します。我々はまた、倫理的配慮の彼の指導のためHader Haidousに感謝したいと思います。

この作品は、ビオメリューSA、オスピスCivilsリヨンとフランスの公的機関OSEO（新規治療アプローチのための高度な診断、個別化医療に特化し、フランス政府出資プログラム）によってサポートされていました。 PP、VC、囲碁、メキシコ、およびFMはビオメリューSAの従業員です。 PP、NMとFMは、この論文の調査結果をカバーする特許出願を提出した。

過去10年間で、HERV発現測定のための試みのほとんどは、RT-PCR技術を使用しているかのHERV属25,26内の一般的な傾向を評価するためのpol遺伝子の相対的な保全に基づいて、特定の遺伝子座20〜24かに焦点を当てる。さらに、HERVファミリー27,28の発現を検出および定量することを意図した低密度マイクロアレイと結合され、高度に縮重プライマーを用いてPCR増幅。家族内の個々の遺伝子座の発現をトレースするためには、その後のクローニングおよび配列決定と組み合わせて保存された領域のPCR増幅に基づくアプローチはへのHML-2 29,30またはHERV-E4.1 31家族の転写活性のある別個の要素を有効に識別すること。また、活性HML-2特異的ヒト孤立性のLTRを同定した反復間のプロモーターを同定することを目指した技術をモニターゲノムリピート発現は、クローニングおよび配列決定段階によって終了<sup&gt; 32,33。我々は、順次ファミリー34,35内のパラロガス要素間の交差反応を最小限にするために、繰り返しエレメントプローブの設計のための適切な方法論を導入し、HERVトランスクリプトームの解析に専用の高密度マイクロアレイの二世代を開発した。 269​​0明確なプロウイルスおよびHERV-W、HERV-H、HERV-E 4.1、HERV-FRD、HERV-K HML-2とHERV-K HML-5ファミリの2883ソロのLTRをターゲットHERV-V2チップは、発表推定される前立腺癌バイオマーカーの同定によって、本論文に示された組織35の広い範囲で1,718 HERV遺伝子座（図7AおよびB）の発現。また、所定の遺伝子座に複数のプローブセットを使用すると、その転写調節については有益である。まず、U5正1と連携して、U3負のシグナルは、プロモーターとしてのLTRを分類し、逆に、U3、正と負の信号U5は、ポリアデニルの役割を反映しているのかもしれない。私たちはこのように私組織35の広い範囲で326プロモーターのLTRをdentifiedと、配列によって提供されるこのU3-U5二値情報に基づいて、我々が提案し、実験的にこのような自律的な転写は、メチル化依存エピジェネティックなプロセス34によって制御されたことをいくつかの選択された場合のため確認した（ 図8）。胎盤や腫瘍精巣34にERVWE1/Syncytin1発現プロファイルによって示されるように第二に、 例えば、LTR、gag及びenvの独立したプローブセットまたは特定のスプライス部位をターゲットとプローブから発行されたからの信号の検出は、プロウイルスのスプライシング戦略について有益である。これは、HERV特異的プローブ選択のプロセスは、従来のように効率的な遺伝子36（ 図8）のような、組織に関連するスプライシング戦略の識別をサポートするのに十分堅牢であることを示している。 この方法は、個別にHERV座式を識別するための最初の試みであるアフィメトリクス技術に基づくカスタム高密度マイクロアレイを用いて。マイクロアレイフォーマットの明確な利点は、（i）からなるHERVトランスクリプトームを解読するには、いくつかのHERVファミリーの協調探索し、各遺伝子座について様々な領域（II）の同時かつ独立した分析、 例えば 。ソロとプロウイルスのLTRのためのU3とU5ドメイン、 ギャグやENV地域や任意の先験的 HERV要素の機能性にすることなく、プロウイルスの構造と関連することが可能にスプライスジャンクション。見通しは、マイクロアレイ関連biocomputingツールで注釈の改善に依存している。これは1がそのような明らかなアクティブのHERVはlncRNA転写を駆動するか、多かれ少なかれ、近位をコードする遺伝子の発現を調節するかどうかなどの生物学的仮説にチップ信号を変換できるようにする必要があります。実際、このような仮定は、vの成分を含む、前立腺癌関連のncRNA転写物を同定最近の研究によって支持されているHERV-K内在性レトロウイルスファミリーまたはウイルスのLTRプロモーター領域37だけでなく、2つの遺伝子融合事象すなわちHERV-K22q11-ETV1およびHERV-K17-ETV 38,39の部分からIRALのORF。一緒になって、LTR機能やスプライシング戦略の識別と合わせ、この全トランスクリプトームのアプローチは、トリガ慢性40,41におけるHERV式のコンポーネントや感染症42,43対マーカーを解読するのに役立つことがあります。

（またのHERV呼ばれる）ヒト内在性レトロウイルスは、私たちのゲノム全体に広がっている。彼らは、コピー＆ペーストの伝播過程が続き、マルチコピーの家族につながる生殖系列内で先祖代々、独立した感染症に由来する。今日では、彼らはこれ以上の感染はないが、彼らはヒトゲノムの8％を占める。比較のポイントとして、エクソンは、ヒトゲノムの2％に及ぶ。 2012年に公開さENCODEプロジェクトからのデータは、異なるRNA型は遺伝子間領域内の三分の一を含め、ゲノムの約62％をカバーすることを示した。また、転写調節モチーフの量は、タンパク質をコードするエクソンに対応するものよりも少なくとも4.5倍高いと思われる。それは、感染するレトロウイルスでのそれらの通常の機能であるとしてのHERV長い末端反復配列（LTR）は、潜在的な転写調節エレメントの広い範囲を表している。歴史的には、離れて胎盤や精巣に発現し、いくつかの遺伝子座から、それは一般的に、HERVによるepに沈黙していると考えられていたigenetic規制。したがって、我々は最適に良好それらがlncRNAの転写を駆動または遺伝子発現を符号化変調した場合、それらがアクティブであるかどうかを理解するために、個々のHERV遺伝子座発現を特徴付けることを目指して、アフィメトリクス形式で、高密度マイクロアレイを設計した。 HERV-V2のGeneChip吹き替えこのツールは、23583 HERVのプローブセットを統合し、5573ソロのLTRで構成される個別のHERV要素だけでなく、完全および部分プロウイルス（ 図2）を判別することができる。 診断、評価、およびプラン： 前立腺癌の診断は、前立腺特異抗原（PSA）、臨床検査室におけるバイオマーカー、直腸指診の病理学者によって観察され、前立腺、最終的に前立腺生検の形態学的変化を評価するための投与量に基づいている。例えば、前立腺癌のPSAのような従来の癌バイオマーカーのうち十分な特異性及び感度の欠如は、幅広くのafが認識されている臨床的意義の数十年TER 1。最初は、PSAは前立腺11の腺癌の診断と治療のために提案した。これは、癌のスクリーニングのために提案12および疾患の進行をモニターする後者であった。 「PSAの使用方法」：しかし、定期的に尋ねられる疑問が残っている。 （I）2.5〜NGの血清中の濃度に対応したグレーゾーン/ mlの明確な違いは、がんとがん以外の2の間で行われることはできません。（II）2大規模コホート研究では、ヨーロッパで数十万人の人々を登録し、米国は疾患特異的死亡率13,14の面でのスクリーニングの有用性についての明確な結論を出すことができなかった、このような粘着剤のクリアランス、PSA上昇速度と倍加時間などの術後のPSA動態パラメータ（III）の分析、理論的には単純ですが、実用化3,4にはかなりの課題を提起することができます。我々は、今後数年間で、バイオマーカーのアプリを受けたりできるlicationsは経過観察と​​より多くのまたは腫瘍表現型に応じて、攻撃性の低い治療間の臨床選択をサポートします。病理学者によってレンダリング診断に関しては、最初の制限要因は、（多くの癌は、サンプリングにより失われている）は、前立腺生検中の20％偽陰性診断から来ている。第二の懸念は、悪影響を提示することができる負の1、以下の追加の生検処置の必要性を扱っています。 根治的前立腺は現在、前立腺がんの標準治療の一つです。これは、特に攻撃的なパターン（10グリーソン7）、多病巣性腫瘍または触知可能な腫瘍の場合には、45〜65歳より高齢化、健康な患者に提案されている。現在では、ロボット支援手術を使用して当科で行われます。なぜなら、分子マーカーは、今後数年間で最も重要な重要性を持っていることを成長している証拠、我々はすべて我々の患者に前立腺のためのプログラムに参加の可能性を提案することを決定した組織バンキング。より正確には、前立腺癌に対する拡大分子研究プログラムは、前立腺切除標本から高品質の新鮮な腫瘍組織へのアクセスの増大する要求をもたらしている。この研究は、特定のゲノムアプローチは、高いDNA / RNAの質の大きな試料を必要とした。腫瘍と同じ患者から、隣接する「​​非腫瘍性」の組織が必要である。ラジカル前立腺切除を処理し、処理するための推奨事項は、ステージと縁の状態、それによって潜在的なさらなる治療と予後を決定する病理学的特徴を維持するように設計されています。任意の新鮮な組織採取方法は、したがって、診断的に許容されるようにするために後続の病理学的評価を損なうべきではない。前立腺の肉眼解剖は困難であり、大きな注目がマージン組織や被膜浸潤に支払われる必要がある：前立腺バンキングのための任意の解剖は常に同意に応じて訓練されたuropathologistによって行われるべきであるDプロトコル。医学部の倫理委員会と国家の医療ボードは、これらの調査に同意し、すべての患者が前立腺組織バンキングに含まれているためにインフォームドコンセントを得た。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Trizol</td>
			<td style="width:92px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15596-026</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNA poly-A control stock</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900433</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DNAse 1</td>
			<td style="width:92px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M6101</td>
			<td style="width:295px;">1,000 U (1 U/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Terminal transferase</td>
			<td style="width:92px;">Roche</td>
			<td style="width:137px;">3333574001</td>
			<td style="width:295px;">400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DLR-1a</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900542</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900454</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">GeneChip Hybridization, Wash and staining</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900720</td>
			<td style="width:295px;">Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">10x One-Phor-All Buffer PLUS</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">74104</td>
			<td style="width:295px;">RNA cleanup protocol</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">WT-Ovation RNA amplification system</td>
			<td style="width:92px;">Nugen</td>
			<td style="width:137px;">2210-24</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">QIAquik PCR purification kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Material Name</td>
			<td style="width:92px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:295px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">GS30007G</td>
			<td style="width:295px;">Optional: autoloader</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">FS450</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Hybridization 640 Oven</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">640</td>
			<td style="width:295px;">Includes 4 GeneChip Probe array carriers</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:195px;">Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="232">
			<td height="232" style="height:232px;width:195px;">HERV-V2 chip</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Custom array. 
			For microarray availability (for research use only), please contact: 
			Fran&#231;ois Mallet 
			Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&#233;rieux 
			Medical Diagnostic Discovery Department 
			Centre Hospitalier Lyon Sud, B&#226;timent 3F 
			69495, Pierre B&#233;nite cedex France 
			Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 
			Email: francois.mallet@biomerieux.com</td>
		</tr>
		<tr height="717">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HERV-V2 conception 
			Dedicated database and annotations 
			 
			The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. 
			 
			Locus-specific probes design 
			Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. 
			 
			Custom HERV GeneChip microarray 
			The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer

前立腺特異抗原（PSA）は、臨床使用における前立腺癌のための主要な診断バイオマーカーであるが、それは特に、低用量の値1は 、特異性および感度を欠いている。 「PSAの使用方法は、「どちらの診断のための明確な差別化は、がんとがん以外の2の間、または患者のフォローのために行われることを許可しません2.5-10 ng / mLの血清中の濃度に対応するグレーゾーンとして、現在の課題であるアップ術後のPSAの分析などの動力学的パラメーターは、その実用化の3,4のためにかなりの課題を提起することができます。代わりに、非コードRNA（ncRNAのは）、疾患の新規なマーカーとして、前立腺癌5,6における例えば PCA3および腫瘍生物学の特徴付けされていない側面を明らかにする可能性を秘めた、ヒトの癌において重要な分子として浮上している。また、2012年に出版され、ENCODEプロジェクトからのデータは、異なるRNAタイプがGENの約62％をカバーすることを示したOME。それはまた、転写調節モチーフの量は、タンパク質をコードするエクソンに対応するものよりも少なくとも4.5倍高いと思われる。それは、感染性レトロウイルスでの一次関数であるように、従って、ヒト内在性レトロウイルス（のHERV）の長い末端反復配列（LTR）は、推定上の/候補の転写調節配列の広い範囲を構成する。ヒトゲノム全体に広がっているのHERV、生殖系列内で先祖代々、独立した感染症に由来し、コピー＆ペーストの伝播過程が続き、ヒトゲノムの8％を占める家族をマルチコピーに至るには、（エクソンが私たちのゲノムの2％に及ぶことに注意してください）。いくつかのHERV遺伝子座は、依然として癌7-10を含むいくつかの病状と関連しているタンパク質を発現する。彼らはのncRNA転写またはMを運転する場合、我々は、より良い彼らがアクティブにできるかどうかを理解するためには、最適な個々のHERV座式を特徴づけることを目指し、アフィメトリクス形式で、高密度マイクロアレイを設計した遺伝子発現のコーディングodulate。このツールは、前立腺癌のフィールド（ 図1）に適用されている。

トランスクリプトーム研究の値は、主に出発生物材料の品質にある。 RNA抽出を最適な条件で行われる場合、RNA完全性番号（RIN）は、典型的には7以上（ 図4A）である。アフィメトリクスHERV-V2チップ上にcDNAを2μgのハイブリダイズする必要性は増幅プロセスの使用を意味する。成功した増幅工程は、釣鐘型の分布（ 図4B）をもたらす。次いで、DNAse1断片は約100ヌクレオチドハイブリダイゼーション（ 図4C）の前にcDNAのサイズ分布を均一化するために行われる。ハイブリダイゼーションおよびスキャン（ 図4D）の後、画像の目視検査は、グリッドはよくスポット（ 図4E）に整列しているかどうかをチェックするために1を可能にし、ハイブリダイゼーションコントロールが一貫している場合には（ 図4F）。このステップは、内気泡やエラーマイクロアレイを排除するためにも役立ちます<html>実験中に発生しました。 チップは（ 図5）品質管理に合格していると正常化した後、リヨンシュッ病院からの5試合対腫瘍と正常な前立腺RNAサンプルの統計分析は、差動式の値と207のHERVプローブセットが同定された一回（p.val &lt;0.05）（ 図6A）。これらの記録をサポートし、前立腺特異的情報を得るために、35の追加のマッチ対試料（結腸、卵巣、精巣、乳房、肺および前立腺）が最終的に同定分析およびSAM-FDR法（FDR = 20％）に添加した44前立腺特異HERVのプローブセット。これらの中でも、最も関連性の10 HERV構造が（ 図6B）に記載されている。さらなる臨床研究は、これらの候補バイオマーカーの感度および特異性の値を評価するために必要とされる。 pload/50713/50713fig1.jpg &quot;幅=&quot; 500px &quot;/&gt; 図1診療所 （1：臨床医による前立腺切除し、病理学者による組織標本） からの全体的な手順のスキーム。ベンチに：候補バイオマーカーの同定につながる（2-6サンプル調製、ターゲット調製、マイクロアレイ処理） （7：HERVマイクロアレイのbiocomputing分析）。正常な組織に由来する核酸がオレンジ色で描かれている。腫瘍の領域から得られた核酸は、（オレンジ色）および腫瘍特異的（黒）核酸の通常のミックスで構成されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" /> 図2概念とHERV-V2チップの内 ​​容：HERVシーケンスヒトゲノムから取得HERV-gDB3と呼ばれるデータベースに格納され、次いで、25マーの候補プローブが得られた標的サブ領域がそれぞれに示されている（最終的にはアレイ上で合成される前に、専用のハイブリダイゼーションモデリング手順（EDA +）を通過する家族）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" /> 図3。病理学者による前立腺取り扱い。（A）新鮮な前立腺全摘除標本を研究室に転送されます。 （BC）の前立腺は（左側の黒い右側に緑）染色する。 （D）は 、後側の腺の大横断面。 （E）は無傷、PIEC余白を残す組織のエスは、前立腺の異なる領域から切除される。組織の（F）コアをエッペンドルフ管に入れる。 （G）縫合糸は、前立腺を閉じるために、グランド歪みおよび切除縁の最小限の中断を防止するために使用される。その後、根治的前立腺摘除術標本を組織学的分析のための通常の手順に従って、ホルマリンで固定できるようになります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" /> 図4。核酸調製とハイブリダイゼーション効率の品質管理 。 （A）RNAの完全性、（B）cDNAの増幅標的およびハイブリダイゼーション段階に用いられる（C）断片化された標的。目3品質管理は、RNAナノチップと真核生物ナノセリエIIアッセイを使用してバイオアナライザを用いて得られたESE。 （D）は 、グリッド整列コントロールを示す左上隅のスキャン、（E）の拡大やスポッティングハイブリダイゼーションコントロールを示す中央部の（F）拡大後のHERV-V2マイクロアレイハイブリダイゼーション領域の全体的なイメージ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" /> 図5。信号の処理 。 （A）アフィメトリクスポリAはスパイクでの増幅を制御します。ポリAはBからDapは、スレオニン、PheおよびLysの転写産物を制御枯草菌遺伝子は、RNAサンプルにスパイクし、全体的な成功を評価するために役立つている<html>ターゲット調製工程。強度はバイアスが高および低発現遺伝子の間に、WT-オベーション増幅中に存在しなかったことを確認するためにこれらのスパイクでのコントロール間の値を減少させることで検出する必要があります。 （B）は Affymetrix社のスパイクインハイブリッド形成を制御します。 Eから分離され、これらのターゲット大腸菌とP1バクテリオファージは、標識操作の前にスパイクされています。 bioBの、BIOC、bioD遺伝子およびCreをから増加する値は、ハイブリダイゼーションの全体的な成功を示している。 RMA正規化後のチップの信号（C）の強度分布を示す。主にいくつかの特定のHERV座に制限され、全体的な表現を示す、2 6（バックグラウンド）よりも低い値を持つプローブセットの展示信号のほとんどは。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 ftp_upload/50713/50713fig6.jpg &quot;幅=&quot; 500px &quot;/&gt; 図6。データ解析 。正常および腫瘍の試料（A）階層的クラスタリング解析。正常および腫瘍サンプルのうち、下（青）レギュレーション - 区分化クラスタリングは、最大（赤色）にプローブセットをグループ化し、ユークリッド距離関数アルゴリズムを用いて正規化された発現値に適用した。 （B）前立腺癌の候補バイオマーカーとして同定された上位10 HERV構造の選択。各HERV要素については、関連HERVファミリは、ゲノム座標（NCBI 36/hg18）とHERV構造の簡単な説明が与えられている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" /> 図7。 </strong&gt; HERVレパートリーは、（A）は、ヒトゲノムの配列決定は、25000タンパク質をコードする遺伝子（エクソン、2％）20万の長い末端反復配列（LTR）レトロトランスポゾン（HERV、8％）を含む、転移因子の膨大な量を明らかにした。 （B）HERV-V2チップの内 ​​容からの外挿および関連発現データ（腫瘍の組織型正常対8から発信さ79サンプル）HERVレパートリーの三分の一が転写的に活性であることを示唆している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" /> 図8。チップからの信号の機能的な解釈 。 （A）プロモーターの識別とエピジェネティック制御：U3負の信号（赤のプローブ、5&#39;LTR）R-U5正の信号対 （青プローブ、5&#39;LTR）は、異なるCpGメチル化（黒丸）腫瘍組織に対する腫瘍周囲の正常中のU3の内容によってサポートU3主導の転写を、示唆している。 （B）スプライシング戦略：mRNAをコードする推定の3.1キロバイトエンベロープは腫瘍でのみ発現は、プローブを重ねSD1/SA2スプライス部位を使用して識別されます。 *その他の非胎盤組織との比較によって推定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

ヒトゲノムの8％を占めるヒト内在性レトロウイルス（HERV）は、希少なコーディング能力が、10万末端反復配列（LTR）を保持する。カスタムアフィメトリクスマイクロアレイは、個々のHERV遺伝子座発現を同定するために設計されており、今後の臨床研究のための概念の証明として、前立腺癌組織で使用された。

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K ビュー.  Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux. ヒトゲノムの8％を占めるヒト内在性レトロウイルス（HERV）は、希少なコーディング能力が、10万末端反復配列（LTR）を保持する。カスタムアフィメトリクスマイクロアレイは、個々のHERV遺伝子座発現を同定するために設計されており、今後の臨床研究のための概念の証明として、前立腺癌組織で使用された。 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

医学

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

個々の腎細胞がんの中のタンパク質発現変動を探るために逆相タンパク質アレイ（RPPA）の使用

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

新規高分解能<em生体内で&gt;</em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する&gt;イメージング技術

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

miRNAを用いた乳がん組織におけるmiRNA発現の臨床病理学的解析<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

ヒト炎症反応の個々の変動を評価するための最小紅斑用量(MED)試験の精密実施

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...