We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

これらの実験に使用したすべてのヒト組織は、シカゴのイリノイ大学の治験審査委員会承認されたプロトコルおよび/または免除を介して取得されました。 1.第新鮮凍結前立腺PEN-スライドへと荷電スライドガラス上に<ol><li>一日前または数時間サンプルを切片化する前に、きれいなツール（ すなわち、ブラシ、ピンセット、coplins、ブレード、PEN-枠スライド（いない場合は、すでにRNaseを含まない）、ETOH安全マーカーや鉛筆）との内部スプレーボトルとラボワイプを使用して、RNaseを除染液を用いたRTクライオスタット。 <ol><li> RNaseを除染液および70％エタノール（depcH 2 0を用いて調製）との最後のすすぎの上に左を削除するには、depcH 2 0で洗い流し、RNaseを除染液は拭き取る前に5分間静置します。 注：これは、RNaseフリーワークスペースを維持することが不可欠です。すべてcoplins、ツール、冷凍封入、ブレードおよび使用スライドはRNaseを含まない仕事のためにのみ使用する必要がありますそして、標準的な非RNaseを含まない環境で使用されることはありません。すべての機器は、各実験の前のRNase汚染除去溶液で処理する必要があります。 </li></ol></li><li> -24℃に冷却し、クライオスタット。 </li><li>スライド100％エタノール、ツール、小さな凍結組織カセットと装着チャックでコプリンに満ちた：前の切片に少なくとも30分を冷却するクライオスタット内部で、次の洗浄のRNaseフリーの器具を配置します。 </li><li>輸送のためにドライアイスを充填した発泡バケットに凍結保存し、場所から凍結した前立腺組織を取得します。少なくとも30分間温度をクライオスタット平衡にクライオスタットに組織を配置します。 注：レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのためのヒト前立腺組織は、新鮮凍結、またはホルマリン固定のいずれかパラフィン包埋（FFPE）することができます。時間の制約とスライドの準備は、組織源との間にわずかに異なります。ここでは、凍結切片のための手順を説明します。 </li><li>一度に一つの組織と協力し、だぼっに凍結された封入剤を噴出カセットのMとすぐには冷えた鉗子を使用して凍結されたマウンティング培地中に凍結された前立腺組織をマウントします。 </li><li>凍結されたマウンティング培地を設定するために5分間クライオスタット内チラーに組織にカセットを置きます。 </li><li>チャック上に凍結された封入剤を少量噴出し、慎重に凍結されたマウンティング培地上に取り付けられた組織下側を押してください。 5分が凍結された封入剤が完全に固化することを可能にするためのクライオスタットに設定してみましょう。 </li><li>ホルダーにチャックを配置し、締めます。 </li><li>ロックされた位置でハンドルをロックし、クライオスタットに新しいブレードを配置します。増幅工程（ すなわち、定量PCR）を含む下流分子のエンドポイントの場合には、汚染を防止する（または次のサンプルに対して、ブレードの面積を使用するように刃を上に移動）するために、各患者のための新しいブレードを使用することをお勧めします。 </li><li>ハンドルのロックを解除し、慎重にしても、50μで組織を露出させるために手またはフットペダルで組織を進めます所望の組織の曝露までメートル部に到達します。 </li><li> 5μmのクライオスタットを調整し、一つまたは二つの部分を切断して（ステップ2を参照）、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色するための荷電スライドガラス上に配置します。 </li><li>すぐに2分間の冷100％エタノールにスライドを配置します。 </li><li>エタノールから充電スライドガラスを削除し、H＆E染色（ステップ2）に進む前に、室温でそれが乾燥してみましょう。 </li><li>フレームサポーターにRT PEN-フレームスライドを置きます。 </li><li> RT PENフレームスライド上に10ミクロンと場所のセクションにクライオスタットを調整します。四つの部分の一つは、組織の大きさに応じて、各スライド上の場所であることができます。 </li><li>すぐに2分間の冷100％エタノールにスライドを突入。 </li><li>エタノールからPEN-フレームスライドを削除し、LCMの準備ができるまで-80℃の冷凍庫にデシケーターボックス内でスライドボックスでスライドを保存します。三日後、最適なRNAの回収の最大蓄積時間です。 </li><li>充電ガラスがスライドのみステップ2に進んでくださいE。 PEN-フレームスライドのステップ3に進みます。 </li></ol> 2.ヘマトキシリン​​およびエオシンY（H＆E）組織学的マークアップのための染色注：この充電スライドガラス上の組織およびNOT LCMのためのPEN-フレームスライドの場合。 <ol><li>以下のように段階的エタノールを通してスライドを浸漬荷電したガラススライド上に切片を水和：3分間二、70％エタノール中で一回、3分間、3分間、スライドを95％エタノールで2回、100％エタノールで2回浸し3分間蒸留H 2 Oで倍。 <ol><li> 99 mlの70％エタノール+ 1 mlの1％HClおよび0.1％重炭酸ナトリウム溶液：H 2 Oを100mlの蒸留中に0.1グラムの炭酸水素ナトリウム酸アルコール溶液を調製します</li></ol></li><li> 5分間ヘマトキシリン​​ギルII（0.4％）でスライドを浸し。 </li><li> 3分間定常走行タップH 2 O中の過剰な汚れを洗い流します。 </li><li>酸アルコールでスライドを10回浸し</li><li> 3分間水道H 2 Oを実行するには、スライドを洗浄します。 </li><li>スライドを浸し青紫に色をオンに30~60秒間0.1％重炭酸ナトリウム溶液です。 </li><li> 3分間水道H 2 Oを実行するには、スライドを洗浄します。 </li><li> 10ディップで、95％エタノールでスライドを洗浄します。 </li><li> 15秒の合計エオシン-Y 2-3回でスライドを浸し。 </li><li>次のように段階的エタノールを通してスライドを脱水：キシレンにスライドを95％エタノールで2回、100％エタノールで2回、そして2回浸し（組織は徹底的に脱水を示した明確な表示されますことを確認してください）​​。 </li><li>非水性永久ハード封入し、カバースリップでスライドをマウントします。 </li><li> 30分間スライドを乾燥させてください。 </li><li>任意の整数のスライドスキャナでスキャンスライドとは、8 &quot;×11&quot;紙の上に大きな、高解像度の画像を印刷します。 </li><li>興味の概要エリアがマーカーで（一般的にボード認定病理学者によって行われます）。このマークアップは、LCMの手続きのためのガイドです。 </li></ol> PEN-フレームスライドの3トルイジンブルー染色注：番目LCMと同じ日に行われています。すべてのソリューションをdepcH 2 O水を使用してください。 RNaseフリーエリア内のすべての手順を実行します。すべてcoplinsはRNaseを除染液で洗浄しなければなりません。 <ol><li> LCMの日は2分間、その後2分間90％エタノールに静かに浸漬スライドすることにより、75％エタノールを-80℃の冷凍庫や水和物からPEN-フレームスライドを削除します。 <ol><li>その後、室温で0.2μmのフィルターとストアを介して滅菌フィルタ分子生物学グレードの水に溶解して0.5％のトルイジンブルーを用意。この溶液を6ヶ月までに再利用することができます。注：それは非常濾過の前に数時間かかることがありますように溶液を調製することをお勧めします。 </li></ol></li><li>静かに5-30秒間0.5％トルイジンブルーにスライドを浸漬することにより、前立腺組織を染色します。 3分30秒75％エタノール、続いて15秒間の洗浄スライドによる組織depcH 2 Oで2回脱色。注：染色及び脱色時間は、良好な染色性を確保するように調整することができます。前立腺は、汚れを超える傾向にあります。 </li><li&gt;は氷の上でRNA分解酵素を含まないドライコンテナにPEN-フレームスライドを転送します。 </li></ol> 4.レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM） <ol><li> LCM、15分間42℃で暖かいスライド上の乾燥したスライドの直前に。それらの準備ができるまで処理され、氷の上に残りの部分を保存するだけでスライドドライ。 </li><li> LCMとコンピュータの順に、顕微鏡パワー、レーザーキー、レーザースイッチしてから、コンピュータの電源をオンにします。レーザーマイクロダイセクションのソフトウェアを起動します。 </li><li>スライドとコレクションチューブをロードするために顕微鏡を制御するためのソフトウェアを使用してください。その後、「続ける」をクリックし、「アンロードサンプルホルダー」をクリックして下に向けて組織を顕微鏡のスライドホルダーにセクションを含むスライドをロードし、顕微鏡での適切なスロットにスライドホルダーを挿入します。 <ol><li> 「コレクションチューブをアンロード」、ラベルをクリックして、チューブホルダーに0.5ミリリットルチューブをロードし、機器内の適切なスロットに挿入します。一度キャップは、収集キャップに溶解緩衝液の35μlを添加し、気泡を回避しようと、固定されています。その後、「OK」をクリックします。 注意：25μlの溶解バッファーを10μlのdepcH2Oで：蒸発は問題がある場合は、次のようにバッファーを希釈します。 </li></ol></li><li>ソフトウェアでは、スライドは、スライドホルダーに置かれている位置を選択します。 LCM標本を収集するために、コレクションキャップを選択します。 </li><li>視覚化し、10Xでコンピュータを介してスライドを集中。その後、「キャリブレーション」「レーザー」を選択することで、レーザーを校正するためのソフトウェアを使用してください。完全にかつ効率的に選択した領域をカットするレーザービームを可能にするために、次に「コントロール」の「レーザー」を選択、レーザーのパワー、絞りと速度を調整します。完全に組織を通るレーザーカットまで調整を繰り返します。 </li><li>ガイドとして8 &quot;×11&quot;病理学者のマークアップを使用して、epitheの所望の領域に外接する「図形を描画」ツールを使用しますビューのliumとは、任意の間質を収集しないようにしてください。 複数の領域を1つのビュー内で選択することができますが、「形をカット」ツールをクリックすることで、第一の切断することなく、別のビューに移動しません。注意して​​ください。 <ol><li>領域が完全にレーザーでカットされない場合は、手動でその上に行くために「移動とカット」ツールを使用します。新しいビューに目標を移動する続け、スライドが完全に切開されるか、または組織の所望の量が収集されるまで、レーザー切断を繰り返す（一般的に100良性腺の150〜500 ngのRNAをもたらします）。 （ 図1Aの例を参照）。 </li></ol></li><li>慎重に収集ホルダーからチューブを外し、キャップを閉じ、キャップに溶解バッファーと組織の意識です。簡単に説明すると、チューブの底に液体や組織を収集するために30秒間遠心します。 RNA単離のための準備ができるまで-80℃で30分間、店舗、42℃でサンプルをインキュベートします。 </li></ol>フィル5.全RNA単離ターベースキットと品質分析<ol><li>氷の上にチューブを解凍し、100μlに溶液の体積をもたらします。 </li><li>フィルタの中心に30μlのofLysisソリューションを適用することにより、RNA単離キットのミクロフィルターを事前に濡らし、それは次の2つの手順（最低5分）whileperforming浸すことができます。 </li><li>溶解液に（キットに付属）LCM添加剤溶液3μLを加え、5秒間ボルテックスで混和します。チューブの底に液体を収集するために30秒間遠心分離。 </li><li>遠心液体を除去するためにトップスピードで〜30秒間予め湿らせたフィルター。 </li><li>軽くボルテックスまたはピペット上下、溶解液の混合物に、100％エタノールの1.25容量（この場合は129μl）を追加します。 **このメソッドは、大小両方のRNA種を回復します。 </li><li>フィルターにRNAに結合する予め湿潤ミクロフィルター、および1分間万×gで遠心分離器にサンプルをロードします。その後、洗浄溶液1、R」の180μlのマイクロフィルターを洗います21; 1分間万×gで遠心します。 注：すべての遠心分離で、この点は13,000×gで、または最高速度で実行する必要がありますから。 </li><li>キットのプロトコールによって指示としてそれぞれ、「洗浄溶液2および3」の180μlの二回フィルターを洗浄してください。 30秒間遠心し、フロースルーを廃棄し、残留液を除去し、フィルターを乾燥させるために1分間スピンフィルター。 </li><li>新しいコレクションチューブにフィルターを転送します。 </li><li> （キットに付属）-95°Cに暖かい溶出溶液。 </li><li>フィルタの中心に予熱し、溶出溶液10μlを適用し、キャップを閉め、室温で5分間保存します。その後、RNAを溶出するために1分間遠心し、RNAの〜20μLを得、この手順を一度繰り返します。 </li><li> 37℃で15分間のDNase I処理を行います。 </li><li> 260 nmの吸光度を分光光度計により、RNAを定量化します。 260 nmおよび280 nmの波長での光学密度の比率は、純度を評価するために使用されRNA（ 表1参照）15。 </li></ol> 6.遺伝子発現解析注：（mRNAおよびlncRNAsのような）長いRNA種の遺伝子発現は、ステップ6.1に示されており、（マイクロRNAのような）短いRNA種は、ステップ6.2に示されています。別のキットは、RT-qPCRのために利用可能であり、必要なRNAの量は、（10 ngのはわずか）キットによって異なります。 RNAの配列決定分析は、6.3に記載されています。 <ol><li>リバース議事録（RT）RTマスターミックス5μlの（RTバッファー、dNTPを、ランダムプライマー、RT酵素、RNase阻害剤）と20 ngの/μlのRNAサンプルの5μLを混合するcDNAへのRNA。 37℃で120分間、その後、25℃で25分間、反応をインキュベートし、85℃で5分間。 </li><li> RNaseを含まない水を用いてRT反応1:10に希釈し、目的の遺伝子のためのプライマーまたはプライマー/プローブセットを用いて10μlの定量PCR反応あたり2.5μlのを使用しています。 注意：部分的に分解されたRNAの解析を容易にするためにそれはfoのプライマーを使用することをお勧めしますR短いアンプリコン（100bp未満）16。（表2B） <ol><li>マイクロRNA発現解析のために2-10 NG / RTマスターミックスの5μlのμlのRNAサンプルの5μLを混合することによって、RT反応を実行します。 注意：それぞれの市販のPCRベースのマイクロRNA検出技術は、独自か​​つ特異的RTプライマーの使用を必要とします。 </li></ol></li><li>あるいは、またはRT-PCRに加えて、RNAの異なる種を定量化するために、次世代シーケンシング（RNA-seqのか小RNA-seqの）を使用します。製造業者および検出機器によって示されるように、典型的には、この手順（表3）のために500ngのRNAを使用し、方法を実施します。 </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

人間の標本から遺伝子発現プロファイリングは、利用可能な組織の品質や数量のでなく、与えられた組織標本に存在する様々な組織学的実体のためだけではなく、挑戦することができます。これは、良性組織が大きく、間質組織および癌の領域である間質を欠いていた前立腺では特に困難です。 LCMは、2つの異なる細胞タイプ（ 図1A）のより正確な署名のための前立腺間質および...

前立腺は、主に平滑筋1で構成される線維筋間質に囲まれた腺房に配置された分泌上皮で構成される異種の組織です。基底細胞、分泌細胞、神経内分泌細胞、トランジット増幅細胞と幹細胞の2：上皮の区画は、5つの異なるが、組織的な細胞型で構成されています。管腔の上皮細胞から生じる前立腺癌（PCA）では、腺癌の成長は、間質コンパートメント3の明白な進行性の低下の原因となります。これらの理由のために、組織標本は、PCaの程度に基づいて、間質および上皮細胞型の割合の明確な違いがあります。これらの差異は、所望の細胞型の顕微解剖に関係なく、全体の組織から取得した遺伝子発現データのバイアスされた仮定を導くことができます。したがって、このバイアスを除去するために、RNA抽出前に別個の細胞型に必須であると遺伝子発現解析。 Macrodissectionまたは顕微解剖は、物理的に周囲の間質4 -6から十分に特徴付け上皮領域を分離するために使用することができます。 Macrodissectionは通常、解剖顕微鏡下でのかみそりの刃で行われ、大規模なPCAが間質から結節分離に適していますが、間質を取り巻くから良性の上皮を除去することができるではありません（ 図1の良性前立腺組織像の例を参照）。レーザー（LCM）と顕微解剖はmacrodissectionよりもはるかに多くの労働集約的であるが、非常に正確に良性の上皮4を分析することができます。 我々の研究室からの最近の刊行物は、RNAが正常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検または凍結組織4,7-9のいずれかからLCMによって抽出することができることを示しています。 LCM-RNA抽出の主要な課題は1である）を正確に組織の所望の領域を分析するため、及び2）Rを保存しますLCMおよび分離プロセス4,10の間に整合性NA。純粋な細胞集団から単離したRNAを逆転写定量的PCR（RT-qPCRの）7,8、マイクロアレイ11、及び深い-sequencing 12-14を含むいくつかの方法によって、遺伝子発現解析のために使用することができます。 このプロトコルの目的は、下流の遺伝子発現分析のために凍結した組織からのLCMの前立腺上皮からの全RNAを単離することです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNase-AWAY&#160;</td>
			<td>MBP</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN-membrane 4,0 mm slides&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11600289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, Superfrost Plus</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon labs.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining jar)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M900-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining rack)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M905-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperio ScanScope</td>
			<td>Aperio(Leica)</td>
			<td>ScanScope&#174; CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>89640-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous&#174;-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>203301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3536-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Richard Allan Scientific&#160;</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

以前の研究では、同じ患者4から凍結しFFPE前立腺組織からmRNAおよびマイクロRNAのRT-qPCRにより発現プロファイリングを比較する上皮および間質組織を収集するためのLCMの使用を実証しました。 LCMは、RNAの大量次世代配列決定分析のために収集される場合は特に、時間がかかります。そのため、作業スペースを維持するために重要であり、ツールは、RNaseフリー。これは、（次の段落で?...

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Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.3K ビュー.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

ビデオ: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

プロテオーム解析のための人間の硝子体の要素の解剖

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

医学

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

齧歯尿生殖洞間充織とヒト幹細胞の組織の組換えを用いたヒト前立腺上皮の形成

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

前立腺発がんおよび良性前立腺過形成の評価のための腎皮膜異種移植および皮下ペレット移植

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the quality of life. BPH includes 2 major treatments: medication and surgery. Surgical treatment is often the most effective and final intervention. Holmium laser enucleation of the prostate (HoLEP), one of the most efficient surgical procedures for BPH, is conducted transurethrally. During surgery, the most important and most difficult part is to locate the surgical capsule of the prostate, which is consistent to the idea of anatomic surgery. Different skills may be needed in treating different parts of the prostate. HoLEP tends to be efficient and safe with good hemostatic properties, and able to treat bladder calculus, which may be the complications of BPH. The technique is particularly suitable for prostate of varying volumes and sizes. Indeed, HoLEP also presents certain disadvantages, such as a long learning curve and costly equipment. Regardless, this method may be the "new standard" and the excellent method for the surgical treatment of BPH.

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate HoLEP.

Here we present a safe and efficient protocol, holmium laser enucleation of the prostate, to treat benign prostatic hyperplasia.

前立腺肥大症の外科治療: ホルミウム レーザー核出術 (HoLEP) 前立腺の。

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

レーザーによる肺の結核病変における薬物の空間の定量化をキャプチャ レーザーマイクロダイ セクション液体クロマトグラフィー質量分析法 (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...