抽出ピペットの開発のための資金は、DRPに授与され、社内の研究開発の助成金によって部分的に提供されていました。

1。サンプルの溶解<ol><li>サンプルが液体の形でなければなりません。サンプルが固体である場合、たとえば食品や便のために、サンプルは緩衝生理食塩水（PBS）などの水やリン酸塩として液体培地中に懸濁させなければなりません。 </li><li> 1.5 mlチューブに6Mグアニジンチオシアネート（pH6.5）を500μLの試料の500μLを混和します。 </li><li>周囲の空気を追い出し、抽出ピペットのバルブを押し下げます。 </li><li>電球が徐々に拡大することにより、吸着剤材料の上に、抽出ピペットに全体の1 mLのサンプルを引き出します。 </li><li>このような電球に吸着ビーズとサンプルドレインその抽出ツールを反転します。 </li><li>抽出ピペットの外にサンプルを追放しないように注意して電球のサンプルとの吸着剤ビーズを挽く。 </li></ol> 2。核酸の抽出（ 図1、パネルA） <ol><li>抽出ピペット（下向き開く）反転し、元の1.5 mlチューブに試料を追放する。 </li> &lt;Liは、&gt;抽出ピペットの首に吸着剤を保つように注意しながら、適度な速度で、吸着剤を通過する、抽出ピペットに全体の1 mLのサンプルを引き出します。 </li><li>電球を押すことによって1.5 mLのチューブにサンプル全体を追放する。 </li><li> 5パスの合計吸着4回以上のサンプルを渡して、ステップ2.2と2.3を繰り返します。 </li><li>吸着剤上の5番目のパスの後、タンパク質抽出緩衝液（15 mLコニカルチューブ）の4MLに全体の1 mLのサンプルを追放、チューブを閉じて、後で使用するために脇に置きます。 </li><li>最後の一節に、元のチューブにエタノールを返す、吸着剤3倍以上の95％エタノール1mLを渡すことによって、単離された核酸を洗浄します。 </li><li> 1秒加え、95％エタノール洗浄を使用して2.6を繰り返します。 </li><li>核酸/吸着剤床を乾燥させ抽出ピペットを通して周囲の空気を通過し、5分間バルブを押して離します。抽出ピペットuの先端からエタノールを拭くキムワイプを歌う。 </li><li>吸着剤の5倍以上の10 mMトリス（pH6.8）を250μLを渡すことによって、核酸を回復します。トリス緩衝液、例えばPBSなどの他の適当な水溶液で置き換えることができます。得られた溶液を抽出した核酸を含んでいます。 </li></ol> 3。タンパク質の抽出（図1、パネルB） <ol><li>反転することにより、ステップ2.5からのサンプルとタンパク質抽出バッファーチューブをミックスして新しい抽出ピペットの吸着剤を介してこの5 mLの試料の約2〜3ミリリットルを渡します。 </li><li>抽出ピペットの首に吸着剤を保つように注意して同じ15mlのコニカルチューブにサンプル全体を追放する。 </li><li>吸着剤の15倍以上のサンプルを渡して、ステップ3.1および3.2を繰り返します。 </li><li>吸着剤床の上に三回、その元のチューブに取り出すエタノールを95％エタノール1mLを渡すことによって、吸着剤と結合したタンパク質を洗浄します。 </li><li> 1秒加え、95％エタノール洗浄を使用して3.4を繰り返します。 </li><html><li>蛋白質/吸着剤床を乾燥させ抽出ピペットを通して周囲の空気を通過し、5分間バルブを押して離します。キムワイプを用いて抽出ピペットの先端からエタノールを拭きます。 </li><li>吸着剤の5倍以上のPBS 250μLを渡すことによって、タンパク質を回復します。 PBS緩衝液は、例えば、10mMトリス（pH6.8）を、任意の他の適当な水溶液で置き換えることができます。得られた溶液は、試料のタンパク質含有量を含んでいます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="図1A" /> 図1。 <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 コンテンツ &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

このレポートに記載され、ツール、化学およびプロトコルは、フィールドベースの、ポイントオブケアのアプリケーションで利用することができる電気フリー、マルチ高分子抽出システムの最初の知られている例を表しています。両方の高分子型は、下流の診断や分析デバイスの数に適用することができます。サンプルのタンパク質成分は、（ 図4）免疫反応性でありながら、例えば、単離された核酸は、PCRの品質（ 図2および3）である。世界の緊縮やリソースの限られた地域では、この抽出システムの利用率が大幅にそこに住んでいる集団に疾患の負担を減らすことができます。この抽出システムは、禁欲的な、または遠隔地でのサンプル処理のための堅牢でありながら、迅速かつ費用対効果の高い方法を提供することによって、世界中の疾病のサーベイランスプログラムに役立つ可能性があります。 上記の抽出方法の1つの重要な側面は、ということですそれはユーザによって変更することができます。たとえば、サンプルのサイズは最初の500μLs（ステップ1.2）より大きいか小さい場合には、ユーザーがそれに応じて試薬の量を調整することができます。絶対的なボリュームを変更することができますが、つ​​まり、サンプルサイズに試薬の体積比は一定のままにしてください。また、吸着剤上の通路の数の調整は、ユーザーの裁量で行うことができます。大規模なサンプル量が使用されている場合たとえば、記載されているよりも吸着剤回以上（ステップ2.4​​＆3.3）上のサンプルを渡すと、吸着剤に接触する高分子型（核酸またはタンパク質）の可能性を増加します。吸着飽和に達するまでの通路の増加は、捕獲効率を高める必要があります。 我々は、抽出ツールとそれに関連する化学物質は、タンパク質の抽出化学が高度にグリコシル化の回復のために非効率であることである最も重要なそのうちのいくつかの制限を持っていることを発見したタンパク質。下流の診断は、グリコシル化タンパク質を対象としているイベントでは、このシステムは、識別のための理想的ではありません。さらに、核酸またはタンパク質のいずれかの抽出効率の上限と下限はまだ決定され、最適化は回復効率を最大化するために進行中です。ツールの更なる発展は、これらの現在の知識のギャップを克服します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>チオシアン酸グアニジン</td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2 - プロパノール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> -4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

従来のような腸管出血性大腸菌 （EHEC）などの新興病原体、 ペスト菌、またはプリオンベースの疾患は、政府、産業、世界的な医療専門家のための重要な関心事である。たとえば、 赤痢菌と組み合わせるEHECsは、約325,000子供毎年の死に責任があると、米国で一般的な実験室ベースの識別が、1は使用できません発展途上国で特に普及している。低コストの開発と配布は、病原体や疾病マーカーの迅速な同定および/または診断のため、フィールドベースの、ポイントオブケアツールが劇的に病気の進行と患者の予後を変える可能性があります。我々は電気や関連する実験装置2せずに固相抽出（SPE）によってサンプルから核酸とタンパク質を分離するためのツールを開発しました。隔離された高分子はdiagnoに使用することができます前方にラボまたはフィールドベースのポイント·オブ·ケア·プラットフォームを使用して、いずれかのSIS。重要なのは、このメソッドは、ゲノムおよびプロテオーム解析の確証を通じて信頼を提供し、核酸および非分割試料からの蛋白質データの直接比較を提供します。 私たちのアイソレーションツールは、固相核酸の分離のための業界標準、シリカベースの粒子やフィルタ3への結合を介して、通常、カオトロピック塩溶液、グアニジンイソチオシアネートから核酸を分離するBOOM技術を利用しています。 CUBRC独自の固相抽出の化学は、核酸の分離4次の廃棄物やフロースルーから、このケースでは、カオトロピック塩溶液からタンパク質を精製するために使用されています。 包装することにより、小型で安価でシンプルなプラットフォームに化学反応を十分に特徴付けられ、我々は、varの下に行うことができ、核酸とタンパク質抽出のためのポータブルシステムを生成した条件のiety。単離された核酸は安定であり、タンパク質含有量がすぐに開かれた手や他の免疫ベースのアッセイで分析することができますが電源がPCR増幅のために使用可能な位置に移送することができます。フィールド内の疾患マーカーの迅速な同定が大幅に疾患の進行の早い段階で治療の適切なコースを向けることによって、患者の転帰を変更することができます。説明するツールと方法が実質的にすべての感染性病原体での使用に適していると同時に、それらの物流負担を軽減しながら、ユーザーに複数の高分子型解析の冗長性を提供します。

核酸分離：単離された核酸は、PCR増幅とタンパク質の混入は無料です。 例1：回復した核酸は、PCRベースのアプリケーションでの使用に適している。たとえば、 図2は、腸管出血性大腸菌に関連付けられた志賀毒素遺伝子の増幅を示しています。 大腸菌 O157：抽出ピペットを用いて核酸/タンパク質抽出プロシージャからH7株EDL-933（ATCC＃35150）。志賀毒素遺伝子STX 1 STX 2は温帯ラムダのようなバクテリオファージ、これと他の腸管出血性大腸菌の欠陥バクテリオファージで発見されたP Rプロモーター5 6 7 8の制御下に大腸菌株。 E.のSOS応答の活性化大腸菌誘導および/ ​​または毒素産生9ファージにつながる。我々は、Feng らによる多重PCR法の修正版を利用しました1。文化やスパイク下水サンプルの両方でSTX 1 STX 2遺伝子を識別するために1。レーンは、 図2のAとBは未処理の培養サンプル（レーンA）のPCR増幅および処理培養サンプル（レーンB）の結果を示しています。これらの結果は、処理または単離された核酸の忠実度の損失はありません実質的に同一の意味である。我々は次のスパイク生下水（レーンD）またはスパイク下水（レーンE＆F）から単離された核酸を増幅した。これらのデータは、単離された核酸は、スパイク下水試料からの非単離された核酸に対して大きな増幅をもたらしたことを示しています。そこで我々は自然に下水に見られるPCR阻害物質のいずれかが分離時に削除されたこと、または核酸の分離に集中していたと結論付けている。これら二つの仮説の組み合わせも可能です。 紫外分光法は、次の単離された核酸は比較的自由だったことを示すために使用されたOfの夾雑タンパク質。 図3は、2つの EのUVスペクトルを示しています。 大腸菌 O157：H7核酸抽出、標識された分離と分離bは、細菌培養の正規化されたスペクトルと比較して、事前に分離標識した。単離された核酸のUVスペクトルは260 nmと1.8 10に近づいて 280nmでの吸光度の計算された比を有する、純粋な核酸のスペクトルに似ています。これらのデータは記載された技術を用いて回収核酸分画にはほとんど夾雑タンパク質があることを示しています。 タンパク質のアイソレーション：核酸/タンパク質分離実験から回収したタンパク質は、免疫反応性と純粋な蛋白質に電気泳動的に同一である。 例2：単離されたタンパク質画分をRapidChek E.に適用された大腸菌 O157ラテラルフローアッセイストリップ（SDIX株式会社）。コントロールはE.を抱いて 、すべてのサンプルで陽性の識別を表示する大腸菌<html> STXの誘導（ 図4、レーンA、BおよびC、それぞれ）の有無にかかわらずO157、。 図4のデータは、E.を抱いて 、これらのサンプルで陽性結果を示す。抽出ピペットを用いて核酸や、タンパク質のために処理した大腸菌 O157。これらのデータは、各サンプルから単離されたタンパク質はこのように肯定的な反応を誘発する免疫反​​応性であることを示している。 PCR増幅は、（実施例1に記載のように）単離されたタンパク質画分は核酸の混入を欠いていたことを示すために、タンパク質サンプルを行った。これらの実験の結果は、ゲル電気泳動により、すべて陰性であった。そこで、サンプルのタンパク質含量は核酸を汚染から分離されたと結論付けている。これらの結果は、核酸とタンパク質含有量は別々の分画工程で分離されている核酸の分離ステップショーのために記載されていると全体での撮影です。 t &quot;は&gt;例3：単離されたタンパク質は電気泳動10に適している図5は、BSA（図5、レーン＆C）とBSAがロードされクマシー染色し、8％アクリルアミドゲル抽出ピペットを使用して、6Mグアニジンイソチオシアネートから単離され、関連付けられている示しています。プロトコル。単離されたタンパク質の電気泳動移動度は、対照試料と同一です。我々はこのように、抽出プロセスが単離されたタンパク質の共有結合構造を変更しないと結論付けている。 <img alt="図1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> 図1、パネルA：典型的な核酸抽出手順の描写サンプルがサンプルチューブ内の6Mグアニジンチオシアネートと混合して吸着剤を5回にわたって渡されます。最後に通過した後、試料をタンパク質抽出バッファーに追加されます。吸着剤と結合した核酸をエタノールで2回洗浄する。サンプルでは、​​その後空気dですリートと吸着剤から溶出した。 <img alt="図1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> 図1、パネルB：典型的なタンパク質抽出手順の描写ステップ1、 図1、第2の抽出ピペットの15倍の吸着剤を介して渡されたパネルからタンパク質の単離緩衝液と混合したサンプル。手順の残りの部分は、核酸抽出プロトコルのと同じです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> 図2：エチジウムブロマイド染色したアガロースゲルのネガティブ画像の多重化志賀毒素1と2の遺伝子増幅実験を培養試料（レーンAおよびB）または大腸菌でスパイクした生下水試料を用いて行った。 大腸菌 O157：H7（レーンD、EおよびF）。サンプルは、直接PCR反応チューブに添加した（レーンD）またはサンプルは、分離プロセスへを使用して処理されたsと抽出した核酸は、PCR反応チューブ（サンプルB、EおよびF）に追加されました。 PCRプロトコルは、Feng ら 11で説明したものを修正したものです。私たちの変更は、他のすべてのプライマーペアをドロップアウト、STX 1（下部バンド）及びSTX 2（上部バンド）のプライマー対により増幅されたもののみ対象とした。レーンCは、バイオラッドから1KBラダーです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> 図3：E.のUV分光法の結果大腸菌 O157：H7核酸が報告された抽出ピペットを用いて単離された単離された核酸を分離し、分離のbというラベルが付いています。サンプルのUVスペクトルは、前の核酸抽出にテストされています、事前に分離ラベルが付いています。スペクトルは日立U3010分光光度計および関連するソフトウェアパッケージを使用して得られた。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; 図4：RapidChekテストストリップのカラー写真を図2に使用されるサンプルのタンパク質含量は、抽出ピペットを用いて分離し、ラテラルフローアッセイにより免疫反応性について試験した。レーンACが未処理のコントロールであり、つまり、細胞培養は、核酸またはタンパク質を抽出せずに、テストストリップを追加しました。レーンであるE.陰性対照として大腸菌 BL21 DE3 pLysSを、レーンA、BおよびCのショーE.大腸菌 O157：H7（B）未処理であった、または4時間のマイトマイシンCで処理する（C）。 A〜HのレーンDは、ラテラルフローテストストリップに抽出したタンパク質を追加した結果を示しています。レーンDとEは大腸菌からのタンパク質抽出物を用いてプローブしたどちらかの（D）なしまたは負の対照としてマイトマイシンC処理（E）と大腸菌 BL21 DE3 pLysSを。 E.からタンパク質を抽出したときFHの結果を示すレーン大腸菌 O157：H7が使用されています。タンパク質は、（F）未処理、または2時間（G）または4時間（H）マイトマイシンC処理した培養物から抽出した。肯定的な結果は、二重赤線を生成します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> 図5：クマシー染色したSDS-PAGEの写真 BSAは、抽出ピペットと説明したプロトコルを使用して溶液から単離した。レーンとCそれぞれ250μg/ mLで、500μg/ mLのコントロール·レーンである。レーンBとDは、それぞれのコントロールと同じ濃度を含む溶液から回収したBSAを描いています。

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Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

ツールと化学が順次電気を必要とせずにサンプルからのタンパク質に続いて核酸を分離するために記述されています。このツールは、分離化学を固相抽出の原則に基づいている間に転送ピペット内に保持されて吸着剤から構成されています。隔離された高分子は、免疫系とPCRベースのアッセイにより分析することができます。

電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K ビュー.  CUBRC, Inc.. ツールと化学が順次電気を必要とせずにサンプルからのタンパク質に続いて核酸を分離するために記述されています。このツールは、分離化学を固相抽出の原則に基づいている間に転送ピペット内に保持されて吸着剤から構成されています。隔離された高分子は、免疫系とPCRベースのアッセイにより分析することができます。

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNAを有する核酸構造の分析と構築

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...