このプロトコルは、生態学的生息地からの炭化水素分解微生物の分離、培養、および同定の概要を示しています。この方法は、高度な機器を必要とせず、標準的な実験室のセットアップで簡単に実行できます。また、他の基質の研究にも簡単に適合させることができます。
この技術は、さまざまな生態学的ニッチに簡単に変換でき、さまざまな基質の分解を評価できます。手順を実演するのは、リチャ・プリヤダルシニ博士の研究室の博士課程の学生であるディーパ・セティです。まず、異なる水域の場所から5つの滅菌ガラス瓶に500ミリリットルの水サンプルを収集し、各サンプルのpHと温度を測定します。
次に、無菌条件下でサンプルを100ミリリットルのバッチで0.22ミクロンの孔径フィルターシートでろ過します。そして、シートを異なる栄養培地プレートの上に置き、プレートごとに1枚の紙を置きます。2時間後、滅菌鉗子を使用して紙をはがします。
次に、回収した水サンプル100マイクロリットルを滅菌二重蒸留水900マイクロリットルに加えて、ろ過されていない水サンプルを希釈します。1対1, 000, 000の希釈比に達するまで10倍希釈を続けます。ピペッティングで混合し、各希釈液の最終容量が1ミリリットルになるようにします。
100マイクロリットルの希釈水サンプルを、すべての増殖培地プレートに個別に3回に分けて広げます。コロニーの成長に応じて、プレートを摂氏30度で24〜48時間インキュベートします。コロニーを分離するには、滅菌爪楊枝またはピペットチップを使用してコロニーを選択します。
象限ストリーキングを実行し、プレートを一晩インキュベートします。翌日、色、質感、形状、サイズ、余白、標高などの形態学的特徴に基づいてコロニーをスクリーニングします。純粋な培養物を得るためにコロニーを再ストリークします。
各純培養物のグラム染色を行った後、3ミリリットルの適切な増殖培地に単一のコロニーを接種し、摂氏30度でインキュベートすることにより、グリセロールストックを調製します。翌日、700マイクロリットルの一晩培養物と300マイクロリットルの100%グリセロールをクライオバイアルに加える。長期保存のためにバイアルを摂氏マイナス80度で凍結します。
縞模様のプレートからコロニーを選び、5ミリリットルのトリプシック大豆ブロスまたは栄養ブロスに接種します。吸光度が約2に達するまで、200 RPMで振とうしながら、摂氏30度で一晩培養物を成長させます。翌日、細胞をペレット化します。
上清を捨て、ペレットを2ミリリットルのオートクレーブ生理食塩水で2回洗浄する。細胞を再度回転させ、ペレットを2ミリリットルの液体カーボンフリー基礎培地(LCFBM)に再懸濁し、吸光度を測定します。次に、2つの滅菌150ミリリットル三角フラスコをAおよびBとしてラベル付けし、それぞれ対照群および実験群について示す。
フラスコAに、40ミリリットルのLCFBMを加え、続いて5ミリモルの最終濃度のスチレンを加える。フラスコBに、35ミリリットルのLCFBMとスチレンを加えます。次に、最終吸光度が約0.1の細胞懸濁液を追加します。
フラスコBの容量をLCFBMで40ミリリットルにした後、両方のフラスコを摂氏30度で200RPMで30日間振とうしながらインキュベートします。各フラスコの吸光度を5日毎に測定し、成長曲線をプロットした。細菌がスチレンを利用できる場合は、インキュベーションを最大45日間増やします。
吸光度の増加は、細菌がスチレンを代謝できることを示しています。グラム陰性菌からゲノムDNAを単離するには、単一のコロニーを選び、滅菌試験管内の新鮮な増殖培地に接種します。振とうインキュベーター内で一晩インキュベートした後、増殖した培養物を1.5ミリリットルペレット化する。
上清を除去し、ペレットを200マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁します。次に、66マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム溶液を加え、よく混ぜます。得られた混合物を遠心分離した後、透明な仰臥位を新鮮なマイクロ遠心管でピペットで送り、等量のクロロホルムを加える。
乳白色の溶液が観察されるまで、溶液を複数回反転させて混合します。チューブを再度回転させ、上清をきれいなバイアルに移します。次に、氷冷した100%エタノール1ミリリットルを加え、反転させて混合し、白いDNA鎖が沈殿するまで混ぜます。
沈殿したDNAを遠心分離します。上清を捨てる。そしてペレットを1ミリリットルの70%エタノールで洗浄する。
洗浄液を廃棄した後、DNAペレットを室温で5分間乾燥させます。乾燥したら、ペレットを100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーに再懸濁します。分光光度計を使用してDNA濃度を測定し、1%アガロースゲル上でDNAを実行してその品質を評価します。
株を同定するには、細菌の16SリボソームRNA配列を標的とするユニバーサルプライマーを用いて、純粋な細菌培養物から単離されたDNAをPCRによって増幅します。氷上で25マイクロリットルのPCRミックスを準備し、1マイクロリットルのDNAテンプレートを追加し、遺伝子増幅のサイクリング条件を設定します。PCR後、5マイクロリットルのサンプルを1マイクロリットルの5倍DNAローディング色素と混合します。
そして、それを1%アガロースゲル上で実行して、増幅を検証します。16Sリボソームの場合、rNA遺伝子配列決定は、先に述べたのと同じ反応を、しかしより高い量で設定する。次に、サンガーシーケンシング用のアンプリコンを精製し、サンプル全体をDNAローディング色素と混合し、アガロースゲルにロードしてゲル抽出法を実行します。
シーケンシングが完了したら、結果ファイルをより高速な形式に変換し、NCBIのBLASTツールを使用してシーケンスの類似性を確認します。インドのダドリの湿地からの水サンプルから分離された細菌コロニーがここに示されています。単離された細菌は、液体スチレンを唯一の炭素源として、それぞれの培地で個別に増殖させた。
細菌分離株の炭化水素分解電位を、カテコール分解アッセイを用いて評価した。単離株の1つの代表的なアッセイをここに示します。ゲノムDNAの完全性は、アガロースゲル上の小さなDNAサンプルを視覚化することによって確認されました。
そして16SリボソームrNA遺伝子をユニバーサルプライマーを用いて増幅した。湿地から分離されたエクシグオバクテリウム株と既知のエクシグオバクテリウム種との関連性を示すために系統樹が構築されました。プロトコルの重要なステップは、テスト対象の基板の使用率を確認することです。
成長特性によっては、微生物が試験対象の基質の利用にすぐに適応しない場合があり、濃縮プロセスが必要になる場合があります。この方法は、環境サンプル中の培養可能な細菌集団に焦点を当てています。研究者はさらに、細菌の全ゲノム配列決定や代謝プロファイリングなどの実験を実行して、炭化水素分解に関与する遺伝子と経路に関する貴重な洞察を提供することができます。
