私たちは、実験室での支援をアンジェリカベルクに感謝します。この作品は、マックスプランク協会および微生物コミュニケーション（JSMC）のためのイエナ大学によってサポートされ、融資された。

1。昆虫飼育<ol><li> ハスモンヨトウの卵のクラッチを購入するか、入手し、独自の飼育からサ ​​キシマスオウノキ 。孵化するまで室温（RT）での滅菌ペトリ皿で​​それらを維持する。 </li><li>次のように飼育昆虫人工飼料を準備します。 <ol><li> 100mlの水に一晩500グラムのグランド白い豆を浸す。 </li><li> H 2 Oを蒸留千ミリリットルに9.0グラムのアスコルビン酸および75グラム寒天を追加し、後でそれを沸かす。 </li><li>混合物を冷却するしましょう​​、それを（白いワックス状固体混合物に）固化する際に使用するまで4℃で保管してください。 </li></ol></li><li>照明の16時間と闇の8時間と長日体制の下で23〜25℃で人工飼料に清潔なプラス​​チックの箱とリア、それらを新たに孵化した幼虫を転送します。幼虫はすべて6幼虫齢​​を経るまで、毎日食べ物を変更します。 </li></ol>代謝的に活性な腸細菌におけるDNAの2。13 C標識<ol><li>蒸留し、脱イオン水（のddH 2 O）と完全に13 C標識グルコースの186.1ミリグラムを溶解し、SIP実験用人工飼料を100グラムとよく混ぜる。人工飼料に10 mMの最終13 C-グルコース濃度を確認してください。これは、S.の腸内でその場でのグルコース濃度を模倣するシャオら （提出）に応じて綿植物上の幼虫の摂食をサキシマスオウノキ 。 </li><li>新鮮な13 C-グルコースを含む滅菌プラスチックペトリ皿（シャーレにつき1幼虫）の飼育箱からの転送9月15日、健康な二齢幼虫を人工飼料をスパイク。説明したように、対照群を供給するための、天然のグルコース（12 C-グルコース）を同量含有する人工飼料を使用する。 </li><li>潜伏期間（1日）の間、頻繁に人工飼料を新たにする。ステップ1.3のように、飼育条件を使用してください。 </li><li>後で処理（DNA抽出）のために各治療から9幼虫を収集します。各3個人によって構成されている複製、治療ごとに少なくとも3回の反復を行います。 </li></ol> 3。昆虫解剖<ol><li>清潔で、エタノール70％（ツール= Vannasはさみ、ピンセット、高級替刃で、メス）で作業の最初に解剖ツールを消毒。 </li><li>柔らかピンセットで虫を取り、蒸留水で表面的に彼らの皮膚を洗浄する。それらを麻酔するために、少なくとも30分間氷上に置きます。 </li><li>まだそれらを殺すために1時間0℃で行われ、それらを麻酔している間。数分間のエタノール（70％）でそれらを浸漬することによって表面的に死んだ虫を駆除。 </li><li> pHを7.4に調整し、約15ミリリットルの滅菌1×PBSペトリ皿（1×PBS = 137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3のNa 2 HPO 4、1.47 mMのKH 2 PO 4の上に堆積されたボリュームに昆虫切開を行うオートクレーブ）。完全solutを中に浸漬し、全昆虫の体を持っていることの確認してください全体解剖期間中にイオン。 </li><li>頭に開始し、肛門に仕上げて、右と昆虫の左側に沿って皮膚を切開することによって解剖を開始します。肌全体、マルピーギ細管、および脂肪体を取り外します。腸を切開する前に、新鮮な緩衝液に変更します。セクションの腸前後、中、そして必要なときに後腸。冷凍庫に組織を保存（-80〜-20℃）までのDNA抽出</li></ol> 4。 DNA抽出および増幅<ol><li> 1.5ミリリットルの滅菌遠心管中昆虫組織を置き、真空濃縮器装置中で45℃ですべてのサンプルを乾燥させる。滅菌プラスチック乳棒で乾燥させた組織をつぶす。 </li><li>土壌DNA抽出に適したキットを用いてゲノムDNAを抽出する。キットの反応チューブに乾いたティッシュを転送し、製造業者によって示される指示に従ってください。 </li><li>分光光度計を使用して、最終的な溶出したDNAの濃度を測定する。 </li><li>付くYA真正細菌の一般的なプライマー27F（5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3）を使用した診断PCR法を用意することで昆虫の腸からの微生物メタゲノムDNAの抽出成功と1492r（5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3）。 PCR反応は以下のように設定します。 <ol><li> 1×緩衝液を含有する50μlの反応混合物を設定し、1.5のMgCl 2、10 mMの4種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）のTaq DNAポリメラーゼ2.5 Uの各プライマー、0.5 mMおよび抽出されたDNAを鋳型として60ngの。 </li><li>次のようにサーモサイクラーを用いてPCR反応を実行する：3分94℃での初期変性、続いて35サイクル：45秒、30秒、55℃でのアニーリング、および1分間72℃、伸長94℃ 。 10分間72℃での最終伸長工程を使用してください。 </li><li> 1％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド（EB）染色ゲル（1μlのEBで1×TAE緩衝液と染色100mlにアガロース1gを溶かす）に成功したPCR増幅を確認してください。目の寄託5μLEのPCR産物+ゲルポケットに6Xローディング色素1μlの。 （1×TAEでpHを8に調整し、40mMトリス - 塩基、20mMの氷酢酸、1mMのEDTAを=）。 </li><li> CAの300 V、115ミリアンペア時1xTAE緩衝液を使用したゲルを実行します。電気泳動チャンバー内の20分。ゲルドキュメンテーション室（デジタルカメラやコンピュータに接続されているUVトランスイルミネーター）を使用してゲルを観察し、また、ロードされた遺伝子マーカーを使用して、最終製品のサイズを比較して、アンプリコンの正確な大きさは約1.5kbである必要があります。 </li></ol></li><li>優先的に、急速冷凍条件でPCR産物を格納-80°C、使用するまで。 </li></ol> 5。 DNA分離 - 塩化セシウム勾配超遠心<ol><li>次のように超遠心分離のための勾配のための試薬を準備<ol><li>徐のddH 2 Oに塩化セシウムの603.0グラムに溶解することにより7.163 M塩化セシウム（CsClの）溶液を調製し、500ミリリットルの最終容量に埋める。 </li><li>正確にデ三連による3桁のバランスに1.0ミリリットル分量を計量することにより準備された塩化セシウム溶液の密度をtermine。これは通常、室温で1.88及び1.89グラム/ mlの範囲である。 </li><li> 1 Mトリス-HCl（pH8.0）、0.5 M EDTA 1mlの液（pH 8）、決勝でのKCl、3.75gの50mlのを組み合わせることによって、勾配緩衝液（100mMトリス、100mMのKCl及び1mM EDTA）を調製のddH 2 Oを使用して500ミリリットルの容量フィルター（0.22μm）を、このソリューションを殺菌し、オートクレーブ。 </li></ol></li><li> DNA分離<ol><li>点4.3のように測定扱わ昆虫の個々のDNA濃度を、決定すると、一緒に複製するように対応し、それぞれの1は、同じようにプールしたサンプルに寄与することを確実にするために彼らのDNA濃度を正常化するもの昆虫プール。 DNAの500〜5,000 ngの（再度の最終濃度を測定）の最終濃度は、超遠心分離工程21に適している。 </li><li>グラデーションメディアを設定するには、定量化されたDNAを、勾配バッファANを組み合わせるD一緒に7.163 M塩化セシウム水溶液4.8ミリリットルの滅菌15ミリリットルのスクリューキャップチューブ中の6.0ミリリットルの混合量（勾配中期DNA混合物の生成）する。 </li><li>慎重に注射器と針を用いて（チューブ首の付け根まで記入）5.1ミリリットル超遠心管に準備された勾配、中のDNAの混合物を配置します。気泡をポンプまたは形成することは避けてください。基準傾きとして各遠心実行で（代わりにDNAののddH 2 Oを使用して）1つ以上の空白グラデーションが含まれています。 </li><li>各必須勾配媒体後の重量を10mg以内に平衡管ペアは、それぞれの超遠心管に充​​填される。 &quot;チューブトッパー」でチューブをシールし、シールは漏れのないチューブを反転させて、手で適度な圧力を加えていることを確認してください。 </li><li>超遠心分離のために5.1ミリリットル超遠心管を保持するための8ウェルを備えたほぼ垂直ローターを使用してください。慎重にローター井戸をシールし、MAに応じて超遠心機にローターを読み込むnufacturerの指示に従ってください。超遠心分離条件を設定します（177,000 XG前後）5万でスピン、20℃の温度、超遠心分離、真空で40時間の時間を実行している。ブレーキなしの最大加速と減速を選択します。 </li><li>一度終了し、慎重に鉗子を使用して遠心ローターからチューブを取り外します。チューブ内に形成された勾配を乱すことなく、ラックに配置します。任意の拡散を最小限に抑えるために、できるだけ早く勾配分画のサンプルを処理する。 </li></ol></li><li>分別によって等密度別居勾配からのDNAの検索<ol><li>同じように超遠心チューブトップ置​​換法から形成された勾配を分離勾配分画を、実行するために、正確なHPLCポンプシステムを使用しています。 1Lの変位をddH 2 Oで満たされたボトルにHPLCポンプ（100％流量勾配）を接続し、しっかりと注射針23のG 1で開いたポンプチューブに取り付ける。十分なBを追加それを濃い青色を与えることのddH 2 Oに青色色素をromophenol。これは、勾配媒体とのddH 2 Oの変位との間の界面の可視化を容易にする</li><li> 850μlの/分の流速、ポンプを設定し、青色のddH 2 Oの一滴まで、システムを平衡化することは、注射針の外に出る。 </li><li>慎重にクランプスタンドに超遠心分離管を固定し、長い針での注射器23のG 1とチューブの底に穴を開け。チューブの上部にポンプチューブに取り付けられた針を挿入することにより、超遠心管にポンプを接続し、直接、滅菌1.5ml微量遠心管に下から滴を集める。約425分あたりのμLとグラデーション当たり12画分の合計額、分数ごとに30秒を収集します。最後の画分（画分12）は、通常の変位のddH 2 Oが含まれ、廃棄されるべきであることに注意してください。 </li><li>分別後、MEステップ5.1.2で説明したように化学天秤を使用して、すべての分離された画分の密度をASURE。 </li><li>第一のDNAの少量の沈殿のためのキャリアとして1μlのグリコーゲン（のddH 2 O中に20μg/μL、オートクレーブ処理）を添加することにより、（425μL程度）各分画からDNAを沈殿させる。反転によりよく混ぜる。 </li><li>ポリエチレングリコール（PEG）溶液（ポリエチレングリコール6000 150gを500 mLの全量のddH 2 O中のNaCl 46.8gの溶解する。濾過し、滅菌し、オートクレーブ2倍量（850μl）を添加する。PEG溶液が30である％PEG 6000および1.6 MのNaCl）と、10回転倒再び混ぜる。 </li><li> （必要であれば一晩）、DNAを沈殿させ、少なくとも2時間、室温で管を残す。 </li><li>室温で30分間13,000×gで沈殿物を遠心分離する。目に見えるペレットを形成すべきである。 </li><li>慎重にピペットで上清を除去し、70％エタノール500μlでペレットを洗浄。同じ下遠心分離機再び10分間の条件。 </li><li>慎重に上清を廃棄し、室温で15分間、ペレットを空気乾燥させます。 </li><li>のddH 2 O30μlの中で乾燥させたDNAペレットを再溶解し、ゆっくりとチューブをタップしてよく混ぜる。長期間の保管が必要な場合は、ステップ4.3ストア-20℃または-80の下のサンプルのように、それぞれの勾配分でDNAを定量化する。 </li></ol></li></ol> 6。パイロによるDNAの特徴付け<ol><li> 13 C標識DNAが周囲に1.720〜1.735グラム/ mlの密度を持っているのに対し、非標識のネイティブ（12℃）のDNAは、1.705グラム/ミリリットルから1.720グラム/ mlまで密度範囲を占めていることを確認してください。ネイティブおよび環境試料から抽出された13 C標識DNAの両方は、いくつかの勾配画にまたがることに注意してください。光DNAが留分9月11日、フラクション4-6に関連付けられる重いDNAと関連していると期待しています。 </li><li>シングル「コンパイルされた「代表端数ACを作成するために、キーの分画を組み合わせ密度分解、DNAの特定のピークの割り当てにコーディング。あるいは、このような濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）23変性などの同位体比質量分析（IRMS）を用いて分離された画分を調べるための他の手段22又はフィンガープリント法は、配列決定の前に適切な画分を選択するのを助けることができる。 </li><li>個々の勾配のコンパイルされた、重い、中、軽留分からPCR増幅した細菌の16S rRNA遺伝子のピロシーケンスを実行します。この方法を使用して、SIPインキュベートした試料における系統および代謝的に活性な細菌種の相対存在量を同定することは可能である。次のようにパイロシーケンシングを実行します。 <ol><li>チタン試薬とロシュ454 FLX機器を用いてアンプリコンピロシーケンスを実行します。 </li><li> 24,25は目で拡張（5 - - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3）Gray28Fを設定フュージョンプライマーを用いて多重化するためのバーコードアンプリコンを準備し、Gray519r（GTNTTACNGCGGCKGCTG -3 5）EそれぞれのプライマーアダプターA / Bおよびサンプル固有の多重化識別子（MID）。 </li><li>シーケンシングライブラリーを生成するために、ホットスタートTaqポリメラーゼを用い、30サイクルの一段階PCRを適用する。 </li><li>サプライヤーとのプロトコルに基づいてアンプリコンの配列を決定し、で説明したように順方向（Gray28F）から読み込み延長<a href="http://www.researchandtesting.com/">http://www.researchandtesting.com/</a> 。 </li></ol></li></ol> 7。パイロシーケンシングデータ解析<ol><li>生のシーケンスは「微生物生態学への定量的な洞察力」、QIIMEのソフトウェア·パイプライン26で454パイロシーケンシングによって生成された読み取り分析する。次のように処理を実行します。 <ol><li>最初は、process_sff.pyスクリプトFASTA、QUALとフローグラムのファイルに454-機械生成SFFファイルを変換します。 </li><li> （check_id_map.pyに基づいて）マッピングファイルを検証し、多重化されたが、生物学的なSAMへの読み込み割り当てるples split_libraries.pyスクリプトで。低品質の50のスライディングウィンドウサイズと25の平均品質のカットオフパラメータで終わるトリム、データセットから短い曖昧な配列（長さ&lt;200 bp）をも排除する。 </li><li> denoise_wrapper.pyを使用して454のデータをノイズ除去。 </li><li>次に、複数のOTUピッキング法（pick_otus.py 97％の配列類似カットオフした）を使用した高品質の操作的分類単位（OTUs）に読み込み、クラスター化。 </li><li> pick_rep_set.pyを使用して、各OTUからの代表的な配列を選択してください。 </li><li> assign_taxonomy.pyに基づいた代表的な配列セットに分類を割り当てます。0.80に設定されたレコードの割り当て最小自信を持ってリボソームデータベースプロジェクト（RDP）分類器を使用してください。 </li><li>アルゴリズムPyNast（align_seqs.pyを使用してプリアライメントGreengenesコア16S配列に対して設定された代表シーケンスを揃える75最小配列同一性パ​​ーセントを設定した）。 </li><li>さらに、identify_chimeric_seqs.pyを実行することで、さらなる分析からキメラを枯渇。 </li><li>系統樹（make_phylogeny.py）を構築する前にlanemaskテンプレート（filter_alignment.py）と（系統発生推論には有用ではない）、全てのギャップ位置を削除します。 </li><li>最終的に、それぞれの試料中の細菌の系統型の発生を記述し、make_otu_table.pyでOTUテーブルを生成。細菌豊かさと活性を比較するためのヒートマップを構築するために、OTU表を使用します。 </li><li>必要に応じて、それぞれ、サンプル内および間でαおよびβの多様性を計算する。同様にして、希薄曲線（シーケンシング深さに対する多様性のグラフ）および微生物群集の関係を表すプリンシパル座標分析（PCoAの）プロットを調製することもできる。 </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ほとんどの昆虫の消化管は、豊かで複雑 ​​な微生物群集を保有。通常、10 7 -10 9原核細胞は、ほとんどの場合、宿主自身の細胞をより多かっ、そこに留まる。このように、昆虫の腸は共生27を義務づけるための病因から、微生物関係のさまざまな側面を表現する、多様な微生物活動のための「ホットスポット」である。多くの研究が昆虫の腸の微生物コミュニティの...

昆虫、細菌の共生アソシエーションは昆虫種7多数のために知られている。これらの共生協会では、微生物は、昆虫の成長と発展に重要な役割を果たしている。微生物は、必須アミノ酸4の合成、およびホストへアクセスできなく食物の消化を含む昆虫再生1、フェロモン生合成3、栄養に貢献することが示されている。腸の細菌団体の広大な様にもかかわらず、はるかに少ない彼らは昆虫の賛成で遊ぶ機能的役割についてはほとんど知られていない。シロアリのみの場合には、リグノセルロースの共生消化は、原核生物、原生動物、および真菌によって行う、8,9広く研究されている。これとは対照的に、少しはコットンリーフワーム、すなわち 、 ハスモンヨトウのサキシマスオウノキ。また、原因植物宿主の彼らの頻繁なシフトに、一般的なジェネラリスト昆虫の消化管に存在する共生関連についてはほとんど知られていないIST昆虫とその消化管関連細菌群集は永続的にその食性は植物化学物質の過多で植物を消費するにリンクされ、新たな課題にさらされている。この他に、鱗翅目における腸環境は、 それ自体が高いため、腸pH 10の細菌の増殖のための過酷な環境を表す。特にSの場合、 サキシマスオウノキ 、それはカリフォルニア 、前腸内の10.5の範囲である。腸内の9のpHにほぼ7後腸11。一方、細菌群集はSの腸に関連するサキシマスオウノキは簡単です。唐、Freitak ら 12は、この虫に関連する細菌群集の唯一のメンバーとして7種類の細菌種の合計に属する36系統型の最大値を報告した。この他にも、複雑な飼育手順は、実験室での昆虫成長のために必要ありません。さらに、この昆虫の短いライフサイクルは、マルチグラムを容易にするenerational研究、腸管微生物の相互作用を研究するための理想的なモデルシステムにこの種を回す。 PCRベースのシーケンシング技術の出現により、いくつかの生物（ すなわち 、人間、昆虫、または海洋生物）の腸の生物相を扱う多くの研究が増加している。また、結果は、従来のように腸保有菌の分離と栽培から独立しています。細菌のほぼ99％が耕作されず、腸内で優勢な環境条件のシミュレーションが12困難である。 PCRを用いて、16S rRNA遺伝子断片（細菌の間で広く使用される系統発生遺伝子マーカー）を選択的に、腸管細菌群集との混合DNA鋳型から増幅され、配列決定し、クローン化することができる。この情報により、ユーザは、公開データベース13,14からの配列情報を取得した後、細菌の種を同定することができる。それにもかかわらず、配列決定は、細菌を記述するために近づくコミュニティは、コミュニティ内の個々の種の本質的な代謝の貢献に関する情報の不足のために不十分なままです。 （SIP）をプロービング安定同位体は、有望な文化のない手法である。これは、しばしば特定の代謝活動にリンクされた微生物の系統発生を分析するために、環境微生物学で使用される。これは、リン脂質由来の脂肪酸、DNA、RNAおよび5のような微生物のバイオマーカーへの基材から、安定同位体標識された炭素原子を追跡することによって達成される。核酸を考慮すると、方法論は、密度勾配超遠心分離することにより、非標識DNA 6から13 C標識DNAまたはRNAの分離に基づいている。原因のDNAラベルと代謝活性の間のこの直接の接続に、核酸の下流分子解析は、種を識別し、代謝活動に関する情報を提供しています。さらに、DNA-SIP及びパイロシーケンシングの組み合わせによって適用されるPilloni、フォンNetzer ら 15は 、重い13 C標識DNA画分に存在する細菌種の特定の単純で敏感な同定を可能にする。これまで、この技術は、好気性および嫌気性条件下16,17 18,19の下で、土壌中の生物地球化学的プロセスに関与する細菌群集を記述するために適用されている。難消化性炭水化物に反応して、人間の腸内細菌叢の異なる系統発生のグループの代謝活動を説明しライハルトら 5によって報告されるように環境科学での使用のほかに、技術は医学に適用されている。 ここでは、「ラベル」に、腸内の代謝活性のある細菌種のDNAを13 C-グルコースを使用しています。グルコースは、例外が20知られているが、広範なエントナー·（ED）経路に沿ってほとんどの細菌種によって利用糖である。この関心と確立された経路に沿って炭素源の代謝物との間のリンクを提供して信頼性の代謝プローブとして13 C-グルコースの使用を正当化する。科学的な質問、他の基質、 すなわち 13 C-メタン、13 CO 2、又は13 CO 2雰囲気下で昇植物に依存して、代謝活性をアドレス指定するために使用することができる。 この時点で、我々はジェネラリスト昆虫の消化管細菌群集の代謝特性評価、すなわち、Sに適用されるプロトコルを提示サキシマスオウノキ （ 鱗翅目、ヤガ科 ）。さらに、技術が順番に高い分解能と精度で昆虫の腸細菌群集の同定を可能にするパイロシーケンシングに結合した。メイン基板として、13 C-標識されたグルコースは、実験中に使用した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

ほとんどの昆虫の根性が共生非病原性細菌の複雑な共同体が生息している。そのような微生物群集内では、相利共生又は細菌種を同定することができる。後者のものは、特に必須アミノ酸4の合成を含む免疫応答2、フェロモン産3、ならびに栄養を、昇圧、 すなわち昆虫再生1に助け、昆虫に複数の機能を果たすことが観察されている。 により、これらの団体の重要性に、多くの努力が、個々のメンバーにまで社会を特徴づけるために行われてきた。しかしながら、これらの努力のほとんどは、いずれかの栽培方法に基づいて、または最終同定のために配列決定した16S rRNA遺伝子断片の生成に依拠した。残念ながら、これらのアプローチは、腸内に存在する細菌種を特定しないのinformatありません微生物の代謝活性へのイオン。 昆虫の腸内で代謝的に活性な細菌種を特徴づけるために、我々は、ユニバーサル基質として13 C-グルコースを用いたin vivoで （SIP）をプロービング安定同位体を使用した。これは彼らの特定の代謝活性のための微生物系統発生の連結を可能にする有望な文化のない手法である。これは、DNAやRNAなどの微生物のバイオマーカー5の中に基質から安定な同位体標識された炭素原子を追跡することが可能である。 13 Cの取り込みは、非標識（12 C）標識されたものと比較してDNAの濃度を増加させるDNAに同位。最後に、13 C-標識されたDNAまたはRNAは、12 C-標識されていない同様のものを6から密度勾配超遠心分離によって分離される。分離された核酸のアイソトポマーのその後の分析は、分子種の代謝活性とアイデンティティとの間の接続を提供する。 ここでは、ジェネラリスト昆虫（我々のモデル系）、 スポドプテラ·リトラリス （ 鱗翅目、ヤガ科 ）の腸内で代謝活性細菌を特徴づけるために使用されるプロトコルを提示する。 DNAの系統解析は、昆虫の腸内細菌集団の同定を高い分解能と精度を可能にピロシーケンスを使用して行った。メイン基板として、13 C-標識されたグルコースは、実験で使用した。基板は、人工飼料を使用して、昆虫に供給した。

昆虫の腸に存在する代謝活性のある細菌の十分なラベリングを実現するために、昆虫は1ラベルのない軽いから簡単にラベルされた重い画分の分離を可能にするのに十分な、以前に最適化された期間、13 Cが豊富な基質にさらされている必要があります。この例では、13 C-グルコースは、1日目（ 図1A）のために10mMの最終濃度で人工飼料に添加した。正常なグルコー?...

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Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

ハスモンヨトウのサキシマスオウノキの腸に関連するアクティブ細菌群集は、ピロシーケンスに結合された安定同位体プロービング（SIP）により決定した。この方法論を使用して、コミュニティ内の代謝的に活性な細菌種の同定は、高分解能かつ高精度に行った。

ジェネラリストの腸内で代謝的に活性な細菌の同定<em&gt;ハスモンヨトウリットラリス</em&gt; DNAを安定同位体を経由して使用するプロービング<sup&gt; 13</sup&gt; C-グルコース

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

15.2K ビュー.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  ハスモンヨトウのサキシマスオウノキの腸に関連するアクティブ細菌群集は、ピロシーケンスに結合された安定同位体プロービング（SIP）により決定した。この方法論を使用して、コミュニティ内の代謝的に活性な細菌種の同定は、高分解能かつ高精度に行った。 

ビデオ: Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

シロアリの腸内微生物（Zootermopsis Angusticollis）からDNAを抽出し、腸内微生物の可視化

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

生物学

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

プロービングDNA安定同位体（DNA - SIP）

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

無脊椎動物モデル システムとしてショウジョウバエを使用して毒性を実験室でテストするための実験プロトコル

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

口腔から共生サッカリバクテリアの安定したバイナリ培養を確立する

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...