この研究は、イェール大学の気候·エネルギー研究所と米国国立科学財団からの資金によって支えられている。

1。ストレスとストレスのない条件下での飼育バッタ<ol><li>移民や動物種の移民（ 図1）を防ぐために0.5メートルの円形2、クローズドmesocosmsを使用しています。足場として1.5メートル、高¼ &quot;メッシュアルミフェンスの2.4メートルの長さを使用してmesocosmsを構築します。1.75メートル高いアルミニウム窓のスクリーニングはフェンシングの最上部と最下部に折り重ね、折り目に沿って一緒にホチキス2.5メートルの長さでフェンシングをカバー。フェンシングに参加黒丸を形成し、その後シールを作成するために一緒にスクリーニング重なったウィンドウ主食。mesocosomのベース約4センチ幅トレンチによる深10cmを掘ってフィールド内の土壌にメソコスムを設定し、メソコスムをに沈むこと終了トレンチその後はメソコスムのくぼんだ部分の周囲にトレンチのSODを固める。メソコスムのトップへウィンドウスクリーニングのステープルの円形部分。 </li><li>レプリケートされたペアの実験療のArray mesocosmsフィールドにあるn。プロット位置は、植物種のアイデンティティと植物相対カバーに一致するように選択されるべきである。プロットサイトで地面にケージ10センチ沈む。 </li><li>捕虫網を用いて、（2 nd）が早期齢バッタの幼虫を集めて、自然界の密度でmesocosmsにそれらを仕入れとなります。 </li><li>捕虫網を使って、（ないウェブ織り）シットアンドウェイト狩猟支配クモ捕食種の個体を捕獲。接着剤は、実際の生存選択は、クモの捕食を逃れるために、より良い能力を持つ個々のバッタを好むから切り離されたリスクの影響に速乾性のセメントでクモcheliceraの複数形（獲物を討伐するために使用される口器）をシャットダウンします。フィールド密度でクモ各ペアの1メソコスムの仕入れとなります。これは、ストレス処理となります。クモなしMesocosmsは、ストレスフリーの治療になります。 </li><li>バッタの幼虫（4 番目と5 番目 ）後期齢段階に開発することができます。ケージとRAからすべての個人を集めるndomly各ケージから以降3回のアッセイのグループのいずれかに個人を割り当てる：生理的ストレス状態の（1）の検証;体元素化学量論のシフト（2）の検証、（3）微生物分解。 </li></ol> 2。検証バッタの応力状態<ol><li>二酸化炭素排出量の割合としてバッタ標準代謝率（SMR）（測定<img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> ）水が流れ込むフロースルー呼吸計測システム200 ml / minの空気流量とインチ乾燥剤を流れる空気を通すことによって水蒸気を削除します。 </li><li> 16時間の絶食（水は使用可能でなければなりません）に続いて、個々のバッタを（±0.1 mg）の重量を量ると、透明50ミリリットル（9.2センチメートル長さx 2.0センチメートルD）にそれらを配置する呼吸室を、それらが少なくともに対する処理から回復できるよう測定前に10分開始。 </li><li>一定の平均周囲温度下<html>呼吸チャンバー内の温度（温度±1％の標準誤差変動）は、赤外線CO 2アナライザー（ 例えば量子ビットS151-1ppmの分解能）を用いて、呼吸空気を分析します。平均最小限の定常状態を測定<img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> 10分間。 </li><li>アナライザは、フラクショナルCO 2濃度（100万分の1）を提供し、まだSMRが率として報告されるべきであるので、一つとして録音を変換する必要があり<img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> = FR I（ <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg"/> ）/ {1 - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> [1 - （1/RQ）]}ここで、iles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg &quot;のfo：SRC =&quot; / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg &quot;/&gt;のCO 2 =水が流れ込む分数濃度; <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> = CO 2の突出形の分数濃度; FR =流量（ミリリットル分-1）; RQ =呼吸商は、草食動物では0.85に等しいと仮定した。 </li></ol> 3。ボディ元素化学量論で検証シフト<ol><li>窒素（C：N）フィールドのmesocosmsから収集されたバッタのサンプルの内容カーボンを評価します。 </li><li>解剖顕微鏡下でバッタの腸内容物を除去することにより、N近年の摂餌量へのC：のばらつきを低減。 </li><li> 48時間空腸と体を凍結乾燥してから均質の粉末に、個々の死骸や腸を挽く。 </li><li> CNHの自動分析装置を用いた粉体のN内容：Cを測定します。 </li></ol> 4。微生物分解<ol><li>場所は、現場（ 図3C）で（15.4センチ径、〜4センチメートル土壌に挿入）PVCの襟のペアを複製しました。土壌表面でのクリッピングを経由して、その中に全ての植生を削除します。これらのカラーは分解対策のために利用されています。さらに、13℃自然豊かコントロール（下記参照）として動作するように現場を横切ってPVCのカラーのセットを確立し、どちらにもバッタ草リットルが追加されます。 </li><li>フィールド·ケージを用いて上記のように捕食者のリスクと飼育バッタの2無傷、凍結乾燥した死骸（バイオマスが追加されたレコード）を追加し、それぞれのペアの一方の襟に。各ペア内の他の首輪に捕食リスクなしで飼育2無傷の凍結乾燥した死骸を追加します。 </li><li>プロットからのスカベンジャーでバッタ脱落を防止し、バッタの死骸が40日間分解できるように画面が付いているポリ塩化ビニールの襟をカバーしています。 </li><li>死骸が分解されていますが、ラベル草里13 Cとtter <ol><li>入口と出口弁（ 図3B）と明確なプレキシガラス室（60センチメートル×60センチメートル×1.5メートル）を構築。 </li><li>地面にシリコングリース5センチメートル（ 図3B）でコーティングされたゴム製シールを持つx 60センチメートル木製フレーム正方形60センチメートルを沈める。 </li><li>チャンバーはラバー（ 図3B）によってシールになるように木枠の上にチャンバーをスライドさせます。 </li><li>チャンバー内の99原子％、13 CO 2を含む圧縮ガスボンベにチャンバーインレットに接続します。植物は（昇降濃度を変化させる植物の炭素のパーティショニングため）CO 2濃度は、周囲のレベルで維持されている13 Cで標識されています。周囲のレベルが短時間だけのために標識CO 2をパルスすることによって維持されています。気温が5℃に到達した場合にも、室内温度が監視され、チャンバーは削除されますボーブアンビエント。 </li><li>一週間標識後、サーモDeltaPlus同位体比質量分析計（サーモ、サンノゼ、CA、USA）を用いて、同一の草種のランダムなサンプルから収集された自然豊かな値を持つ草リットルのδ13 Cを比較します。 </li></ol></li><li> 40日後には、以前にバッタの死骸で修正されたそれぞれの首輪に空気乾燥させ13 C標識草リットルの10グラムを追加します。 </li><li>各カラーをキャッピングし、合計土壌呼吸と13 CO 2の呼吸の両方を追跡することにより、75日を越え、in situで草リットルの無機化率を監視します。これは、8分間、リアルタイムでフロースルーチャンバー技法各襟からのガスサンプルが監視されている使用して達成される各使用キャビティリングダウン分光法（CRDS; Picarro社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;モデル：G1101 -I）。 CRDSは、同時に合計とδ13 Cの両方を追跡するように、1つを可能に土壌呼吸の。 </li><li>同位体混合方程式を用いて合計土壌呼吸への13 C標識草リットルの寄与を推定する。 CO 2を導出草ゴミの量は、次のように計算されます：C 草リットル派生 = C× 合計 （δ13 C 呼吸 - δ13 C nat.abn）/（δ13 C 草リットル - δ13 C NAT 。ABN）、Cの合計は、与えられた測定中における呼吸Cの合計量、δ13 Cの呼吸は、標識された草の落葉、δ13 C nat.abnと改正首輪用、呼吸-Cのδ13 Cです。平均δ3豊かな自然の首輪で、呼吸、Cの13 C（ すなわちごみと改正されなかったもの）、およびδ13 C 草リットル草ごみのδ13 Cは共同に追加されているllars。 </li><li>温度や湿度の違いによる土壌呼吸の違いを補正するために、手持ちのプローブを用いて実験を横切って土壌温度と水分の両方を監視します。 </li><li>フィールドでの使用のために意図したものであるが、キャビティリングダウン分光法装置（Picarro社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;モデル：G1101-I）の測定値が動きに敏感です。したがって、1はPVCの襟を含むプロットのすべての中央基地測定ステーションを建てると、PVCチューブの長さと襟に楽器を接続する必要があります。 </li></ol>

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	<li>Wardle, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+linkages+between+aboveground+and+belowground+biota.">Ecological linkages between aboveground and belowground biota.</a> Science. 304, 1629-1633 (2004).</li><li>Hattenschwiler, S., Tiunov, A. V., Scheu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+and+litter+decomposition+in+terrestrial+ecosystems.">Biodiversity and litter decomposition in terrestrial ecosystems.</a> Annu. Rev. Ecol. Syst. 36, 191-218 (2005).</li><li>Cebrian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+first-order+consumers+in+ecosystem+carbon+flow.">Role of first-order consumers in ecosystem carbon flow.</a> Ecol. Lett. 7, 232-240 (2004).</li><li>Bardgett, R. D., Wardle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aboveground-Belowground Linkages. , (2010).</li><li>Schmitz, O. J., Hawlena, D., Trussell, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predator+control+of+ecosystem+nutrient+dynamics.">Predator control of ecosystem nutrient dynamics.</a> Ecol. Lett. 13, 1199-1209 (2010).</li><li>Hawlena, D., Strickland, M. S., Bradford, M. A., Schmitz, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fear+of+predation+slows+plant+litter+decomposition.">Fear of predation slows plant litter decomposition.</a> Science. 336, 1434-1438 (2012).</li><li>Hawlena, D., Schmitz, O. 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我々は、開示することは何もない。

ここで紹介する方法のシーケンスは、植物リターのその後の分解の変化につながる方法で地上の食物網を構成する種の応力ができますプライム土壌微生物群集の方法を体系的に測定できるようにする必要があります。無傷の食物網が空間外接とmesocosms内に収容することができるので、方法は節足動物の消費者や草本植物から成る生態系を研究するための理想的です。 空間的変動が背景土壌水分の勾配による存在していても、土壌の温度、植物栄養素含有量などが研究デザインは、効果を分析する際に、配列mescosmsとPVCの襟に1つがそのような環境変化の空間的な環境勾配に沿ってブロックすることにより、アカウントすることができます。 フィールドでの使用のために意図したものであるが、キャビティリングダウン分光法装置（Picarro社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;モデル：G1101-i）の読みがSEである動きにnsitive。したがって、1はPVCの襟を含むプロットのすべての中央基地測定ステーションを建てると、PVCチューブの長さと襟に楽器を接続する必要があります。 土壌リター分解は、伝統的に、グラスファイバーメッシュの袋にごみの既知量を囲んでフィールド内の土壌表面にバッグを堆積させ、定期的にごみの消失率（分解）を定量化するために袋を再測定することによって測定されてきた。この方法の制限は、1つは分解物の運命をたどるか、バックグラウンドの土壌のCO 2石灰から土壌改良（追加リットル）の2石灰化をCOへの寄与を決定することができないということです。ここで紹介する標識されたCO 2を用いたトレーサー法は、この物流制約を緩和するのに役立ちます。 生態系生態学と生物地球化学、作業パラダイムの下で運営しているそのため、食べられていない植物リッターはデトリタスの大半を占める、地下生態系のプロセスはわずかにそのような草食動物は自分自身6などの地上の食物網における高い栄養レベル、バイオマスからの入力の影響を受けています。しかし、生態系の高い栄養レベルの種は地下1,4,5プロセスに大きな影響を持つことができることを成長の証拠がある。ここで紹介する方法は、直接枝肉蒸着（ 例えば 12、13）や排泄や排せつ物からバイオマス（ 例えば 14、15）を介して、または間接的に植物群落組成物（ 例えば、9の改変を通じ、より高い栄養レベルの寄与の定量化を強化するために立っている）生態系の栄養循環に。このような定量化は、動物が生態系の機能上の生物的防除の現在の作業パラダイムを強化し、修正する努力の一環として、生態系のダイナミクスを制御するメカニズムを明らかにするのに役立ちます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>分光器ダウンキャビティリング</td><td> Picarro社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国</td><td>モデル＃G1101-I </td><td></td></tr><tr><td> CO2の呼吸</td><td>量子ビットシステム、キングストン、ON、カナダ</td><td>モデル＃S151 </td><td></td></tr><tr><td> 13C </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 372382 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>サーモ、サンノゼCA、USA </td><td>モデル：デルタV Plusの同位体比質量分光光度計</td><td></td></tr></tbody></table>

linking predation risk, herbivore physiological stress and microbial decomposition of plant litter

土壌に入るデトリタスの量と質は、微生物群集と同様に窒素（N）と炭素（C）隔離1,2のリサイクル料金で分解速度を決定します。植物リターはデトリタス3の大半を占めるので、それは分解がわずか4,5などの草食動物と肉食動物のような動物からのバイオマス入力によって影響されることが想定されます。しかし、肉食動物は捕食リスクはターンを変化させるの土壌微生物の機能に草食動物の死骸が6を分解していること、その草食動物を捕食の生理機能を変化させている相互作用の連鎖を介して植物リターの微生物分解に影響を及ぼす可能性がある。捕食の危険がある草食動物による生理ストレス反応は、Cを変更することができます：草食バイオマス7,8,9のN元素組成を捕食リスクからストレスが草食基底エネルギー需要が増大するため、その栄養を制限されたシステムを強制的に草食動物で高まり代謝6をサポートするために、Cの豊富な炭水化物のリソースへの成長と再生をサポートするために、N-豊富な資源から消費をシフトするの。彼らは炭水化物-C 7消費が増えるにつれ、草食動物が過剰な栄養分を蓄積する能力を制限してきたので、草食動物の排泄Nを強調した。結局、自分の体Cを増やす捕食リスクが強調捕食：N比7,10を 、それらの微生物酵素の生産6の不安定なNの低い可用性への可能性の高い原因は、土壌微生物のプール用の貧しい品質のリソースとなっています。したがって、ストレス草食動物の死体の分解が植物リター6,10,11を分解する微生物のに後続の能力を低下させる微生物群集の機能にプライミング効果を持っています。 我々は土壌微生物によって捕食リスクとリター分解の間の結合を評価するための方法論を提示する。捕食リスクから草食動物にストレスを誘導する; MEA：我々は、する方法を説明しますそれらのストレス応答を確認し、微生物分解に影響を測定します。我々は、狩猟クモ捕食者（Pisuarinaミラ ）、ドミナントバッタ草食動物（Melanoplus femurrubrum）、草や広葉草本植物9の様々なモデルを構成する草原生態系からの洞察を使用しています。

ストレスとストレスのない条件下でのバッタの標準代謝率のプロット例を図2に示されている。ボディ·マス·個々のバッタの違い、代謝率は体重に応じて変化するという事実のため、プロットはバッタ体重との関係で代謝率を提示しなければならない。さまざまな治療法のための並列動向はその代謝率は、すべてのストレスを受けた個人のための標準代謝率の定数倍（ 即ち、身体の質量×代謝率の相互作用はありません）のように上昇することを示します。 バッタ本体Cとリスクとリスクフリーの条件でN元素の内容を表1に示す。治療間N比：それは本体Cが非常に小さい（4％）に差があることは注目に値する。それにもかかわらず、これらの小さな違いが土壌微生物のプールサイドで草リター分解の差が大きい（ 図3）に変換することができます。 </p&gt; 記述の曲線に反映されているように以前にストレスやストレスのないバッタと改正のPVCカラーに草ゴミを追加すると、リターの分解の程度の違いにつながる微生物の呼吸（ 図3）による土壌からのCO 2放出を累計する。曲線が飽和し始めるまで、累計実験を監視する必要があります。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ストレス </td><td> 無料ストレス </td></tr><tr><td>カーボン（％） </td><td> 48.44±0.32 </td><td> 44.73±0.46 </td></tr><tr><td>窒素（％） </td><td> 12.11±0.08 </td><td> 11.62±0.12 </td></tr><tr><td>炭素：窒素</td><td> 4.00±0.03 </td><td> 3.85±0.04 </td></tr></tbody></table> 表1。バッタ草食動物車の化学物質含有量の比較彼らは捕食リスク（ストレス）および捕食リスクは、（ストレスフリー）欠席した直面している条件からcasses。値は平均値±1標準誤差である。 <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig1.jpg" alt="図1"/> 図1リター分解のリスクの影響の実験的評価の実験と全体的なスキームで使用されるフィールドmesocosmsのデザインのイラスト。 <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig2.jpg" alt="図2"/> 図2草食動物体重の関係で草食標準代謝率をプロットした。ストレスを誘導するために捕食（捕食）、したがって、捕食者（コントロール）と無誘導性ストレスなしmesocosmsを含むmesocosmsからバッタ：データは、実験的な治療に応じて2つのクラスに分けられます。データはD HalwenaからですそしてOJシュミッツ2010年、未公表。 <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3highres.jpg"/> 図3：ポリ塩化ビニールの襟で実験草リター入力を分解する微生物の中にプールサイドでの累積CO 2放出を記述する曲線。プロットされた値は平均±1標準誤差。グラフは、土壌は19パーセントのストレスバッタの死骸（捕食者）結果ストレスフリーバッタの死骸（コントロール）で下塗りした土壌よりも低い（ANOVAはF 1,6 = 9.06、P &lt;0.05）、植物リター分解率で下塗りしていることを示しています。挿入図は、フィールド内のPVCの襟装置を示している。 Hawlena らから再生された図6の <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50061/50061fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を見るときはここをCick</a> 。

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Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

私たちは、捕食リスクが高まりストレスの要求を満たすために食生活の変化を誘導することによって、草食動物の餌の化学的性質を変えることができるかを評価するための方法を提示し、どのようにこれらのストレス草食動物から死体の分解は土壌微生物によって後続の植物リターの分解が遅くなります。

捕食リスク、草食動物生理的ストレスと植物リターの微生物分解を結ぶ

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

linking-predation-risk-herbivore-physiological-stress-microbial

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K ビュー.  Yale University. 私たちは、捕食リスクが高まりストレスの要求を満たすために食生活の変化を誘導することによって、草食動物の餌の化学的性質を変えることができるかを評価するための方法を提示し、どのようにこれらのストレス草食動物から死体の分解は土壌微生物によって後続の植物リターの分解が遅くなります。

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Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

マイクロインジェクションを使用してアブラムシのウイルス伝播の生理学的障壁のテスト

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

生物学

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

好気性菌による制御植物組織の分解のための寒天ブロックの小宇宙

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

草食動物によって誘導されたブルーベリー揮発性物質とイントラ植物のシグナリング

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定<em&gt;ネッタイシマカ</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

透明化顕微鏡と蛍光顕微鏡を組み合わせて、アブラナ原虫に対する遺伝子発現の変化と生理学的応答を視覚化

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage seedlings of the small model plant, Arabidopsis thaliana, is technically challenging and time consuming due to the size and fragility of its seedlings. A growing collection of published methods describe this technique with varying success rates, difficulty, and associated costs. This paper describes a simple procedure to make an in-house reusable grafting device using silicone elastomer mix, and how to use this device for seedling grafting. At the time of this publication, each reusable grafting device costs only $0.47 in consumable materials to produce. Using this method, beginners can have their first successfully grafted seedlings in less than 3 weeks from start to finish. This highly accessible procedure will allow plant molecular genetics labs to establish seedling grafting as a normal part of their experimental process. Due to the full control users have in the creation and design of these grafting devices, this technique could be easily adjusted for use in larger plants, such as tomato or tobacco, if desired.

This protocol describes a robust seedling grafting method that requires no prior experience or training and can be executed at a very low cost using materials easily accessible in most molecular biology labs.

スケーラブルで柔軟性があり、費用対効果の高い苗接ぎ木

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...