この方法は、適応免疫応答の役割やこの多因子性疾患の病因など、結核の分野における重要な質問に答える助けとなる。この核酸塩基法の主な利点は、細菌負荷と遺伝子発現レベルの両方を同じ個体から測定できることである。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、7H10プレート上の培養M.marinum。
ADC濃縮を含む7H9培地の10ミリリットルを転写し、ポリソルベート80、およびグリセロールを細胞培養フラスコに移す。次に、滅菌1マイクロリットル接種ループを使用して、M.marinum細菌塊のループをフラスコに無菌で伝達する。キャップを緩めたままにするか、OD600が約0.7に達するまで3〜4日間揺れることなく、暗闇の中で摂氏29度で十分なガス交換と培養を可能にするためにフィルターキャップを使用してください。
テキストに概説されているように、細菌を希釈し、培養し続けます。感染のための細菌溶液の調製を開始するには、培養物の1ミリリットルを新鮮なチューブに移す。遠心分離機を10,000gで3分間行う。
上清を取り除き、滅菌PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。滅菌PBSをトレーサーとしてフェノールレッドのミリリットル当たり0.3ミリグラムで使用し、懸濁液を希釈して所望の細菌濃度に達する。この後、1ミリリットルの注射器を使用して、27ゲージの針を通してサスペンションを3回ゆっくりと引っ張ります。
各アリコートに対して使用する直前にこの手順を実行します。まず、希釈された細菌溶液の5マイクロリットルの液滴をパラフィンフィルムの一部にピペットする。その後、液滴を30ゲージのインスリン針に引き込みます。
この実験には5〜8ヶ月の魚を使用し、1つは野生のタイプの魚であり、もう1つはボロ突然変異魚です。湿った泡立ったプラスチックの破片のスリットにこれらの魚の腹側を上に置きます。45度の角度で骨盤のフィンの間にインスリン針を注入します。
針を上向きに開いたままにして、開口部全体が腹腔内にあることを確認します。次いで、細菌溶液をゆっくりと注入する。この後、慎重に針を取り出し、すぐに新鮮なタンクの水で満たされた回収槽に魚を転送します。
7H10プレートで15分ごとに使用されている細菌アリコートからサンプルを採取します。これらのサンプルを摂氏29度で5日間インキュベートし、感染量を確認します。魚の幸福を定期的に確認し、3アミノ安息香酸エチルエステルの0.02%以上で水中でインキュベートすることで、感染症状を伴う魚を安楽死させることを確認してください。
魚を安楽死させた後、枝柱線に後方にピンを挿入します。尾に2番目のピンを挿入して、魚をプラットフォームに取り付けます。メスを使用して、腹腔全体を開きます。
その後、小さなスプーンと鋭いピンセットを使用して、心臓から始まり、背骨に沿って尾に向かって働いて1つのブロック内臓を取り外します。ピンセットを使用して、クロアカから腸網を取り外し、半ダースの2.8ミリメートルセラミックビーズを含む1.5ミリリットルの均質化チューブに臓器を移します。すぐにチューブをドライアイスの上に置き、サンプルを凍結します。
均質化する準備ができるまで、サンプルをマイナス80°Cで保存します。DNAとRNAを抽出した後、テキストプロトコルに概説されているように定量PCRによりマイコバクテリア負荷を測定します。この研究では、成体ゼブラフィッシュは腹腔内注射によってM.marinumに感染している。
高い感染量は、平均負荷が最終的に魚を殺す約500万の細菌に達するまで、マイコバクテリア負荷が増加し続ける進行性疾患につながると見られる。一方、低用量は、進行性、潜伏、再活性化、および滅菌感染症を有するヒト結核に見られるのと同様の疾患スペクトルの発症につながる。この場合、負荷は4週間増加し続け、その後、病気は魚の大部分で安定した状態に達する。
このデータは、魚に感染するために使用されるマイコバクテリアの最初の数が感染の結果のための重要な決定要因であることを明らかにします。ラグー変異ゼブラフィッシュは、高い細菌負荷と罹患率の増加につながるマイコバクテリアの成長を十分に制限することができないと見られています。これは明らかにマイコバクテリア感染を制御する適応免疫の重要性を示しています。
インターロイキン-4のレベルは、インターロイキン-4の効率的な導入には適応応答が必要であるが、マイコバクテリア感染後のインターフェロンガンマの導入には欠かせないことが明らかな野生型群では有意に高い。このプロトコルは、同じサンプルからDNAとRNAの両方を収集することを可能にし、サンプルのマイコバクテリアの負担と宿主と細菌の両方の遺伝子発現データを組み合わせることを可能にする。この技術は、抗細菌性負荷および免疫応答に対するそれらの効果を評価するために、薬物またはワクチン候補の投与と組み合わせることができる。
この手順を試みる間、バイオセーフティレベル2病原体で作業する際には、個人の安全と廃棄物処理に関する現地ガイドラインに従うことを忘れないでください。この技術により、生体内モデルで倫理的な非哺乳類であるゼブラフィッシュにおける休眠中のマイコバクテリアを用いた活性結核と潜伏結核の両方を研究することが可能になる。
