この作品は、健康、国立がん研究所（1R21CA141039）、BDバイオサイエンス研究助成賞、がんパデュー大学センター米国癌協会の制度研究助成（IRG＃58-006-53）、国立研究所からの補助金によって賄われていた研究、健康研究およびアルバータがん会研究イニシアティブプログラムのカナダの協会。 MPは、国立衛生研究所、国立がん研究所、がん予防インターンシッププログラムによってサポートされていました（R25CA128770、PI：D. Teegarden）腫瘍学科学総合研究センターとパデュー大学のディスカバリー·ラーニング研究所で投与。

1。事前準備<ol><li> 4℃で滅菌した血清学的ピペットおよびピペットチップを保つ トラブルシューティング：室温（RT）でマトリゲルゲル、寒ピペット·チップを使用して、培養セットアップ時にゲル化マトリゲルを防ぐことができます。 </li><li> 4℃で一晩マトリゲルの瓶を解凍する。 </li></ol> 2。試薬の調製<ol><li>フィブロネクチンのストック溶液の調製：100mlの蒸留水に100mgのヒトフィブロネクチンを溶解することによってフィブロネクチンの1 mg / mlのストック溶液を作る。 6ヶ月まで4℃でのフィブロネクチンが溶解したら、滅菌フィルター、分量、店舗。 トラブルシューティング：フィブロネクチンは、迅速に溶解37℃の水浴セット内の数分間溶液をインキュベートしていない場合</li><li> 10×PBSの調製：80gの塩化ナトリウムのNaCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2gのKClおよび2.4グラムのKH 2 POを溶解<suB&gt;蒸留水1Lに4。 7.4、滅菌フィルターにpHを設定し、6ヶ月まで4℃で保存する。 </li><li>中和緩衝液20の調製：1 M HEPESおよび10×PBS原液を使用して、2×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で100mMのHEPESを含有する溶液を作る。 7.0に溶液のpHを調整します。 2〜3ヶ月、4℃で保存してください。 </li><li>ラット尾コラーゲンタイプの2 mg / mlの溶液の調製は、I：中和バッファー（ステップ2.3）中の2 mg / mlのコラーゲンI溶液を加えます。低速でのソリューションをボルテックスし、上下にピペッティングにより穏やかに混合。このコラーゲンは非常に粘性であるため、ピペッティングしながら、気泡の発生を避ける。これは、新鮮なたびに、コラーゲンI溶液を調製することが推奨される。使用するまで氷上で溶液を準備しておく。 </li><li>骨内膜コーティング（引き裂く）の調製：1X＆で、それぞれ77μg/ mlのおよび29μg/ mlの、最終濃度を2 mg / mlのコラーゲンIストック（2.1および2.4ステップ）で1 mg / mlのフィブロネクチン株式ミックス＃160;滅菌PBS。混合し、1ヶ月まで4℃で保存する。 </li><li>再構築された骨基質（RBM）の調製： <ol><li>氷上の予冷1.5mlのマイクロチューブ。常時氷上すべてのマトリックス溶液を保管してください。 </li><li> 4部マトリゲル（マトリゲル濃度はロットごとに異なりますが、変動は無視できる程度であることが判明した）、1 mg / mlのフィブロネクチンの2.5部と第ペッティングマトリゲルによる氷上で2 mg / mlのコラーゲンIへの1の部分をミックスフィブロネクチンとコラーゲンIをマトリゲルを追加し、コールドピペットチップを使用して、管を4℃以上の温度で固化し始めるので、マトリゲルピペッティングしながら、すぐに動作します。気泡を導入しないよう、上下にピペッティングによって、非常に静かに行列を混ぜる。 RBMを混合しながら氷上でチューブを保持します。 </li></ol></li><li>骨髄増殖培地（BMGM）の調製：6.2×10 -4 MのCaCl 2、10 -6 Mコハク酸ナトリウム、10 -6 Mヒドロコルチゾン、20％ヒト血漿（BMGM含有する500mlのを作る正常または健常ドナーまたは患者から採取悪性）、およびRPMI-1640中の1％のペニシリン/ストレプトマイシン。のCaCl 2、コハク酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン及びサプリメントは、1,000倍のストック溶液として&gt; 6ヶ月間-80℃で保存することができる。細胞株を成長させる際に、ウシ胎児血清（FBS）は、ヒト血漿の代わりに用いることができる。 </li><li> 10％中性緩衝ホルマリン（NBF）の調製：10％容量/ vのPBSで1Xを、37％ホルムアルデヒドストック溶液を追加よく混合し、光から保護し、2〜3週間、室温で保管してください。 </li><li> 1％ウシ血清アルブミン（BSA）の調製：BSAの適量を秤量し、1×PBSに溶かし。 4℃で保存し、1週間以内に使用しています。 BSA溶液は、より長い期間にわたって冷蔵した場合汚染さ傾向がある。あるいは、BSA溶液を等分し、長期保存のために-20℃で凍結することができる。凍結融解を避ける。 </li><li>細胞回収液（CRS）の調製：5mMのEDTA、1mMのバナジン酸ナトリウムせ（Naを&lt;メイク1×PBS中にサブ&gt; 3 VO 4）および1.5mMのフッ化ナトリウム（NaFの）溶液。 6ヶ月まで4℃で滅菌フィルターや店舗。 </li></ol> 3。非悪性および悪性のヒトBM細胞の組み込み3次元培養<ol><li>製造業者の説明書に従って、フィコール - プラーク勾配遠心分離により、一次BM単核細胞を精製する。 オプションのステップ ：細胞は、培養期間を通して細胞増殖を追跡する製造業者の指示につき0.25μMカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（CFSE）で標識することができる。 トラブルシューティング：細胞はCFSE染色後に死亡した場合は濃度が細胞の種類に依存するため、CFSEの量を滴定、0.25μMのは、一次骨髄単核細胞に適しています。 </li><li> 48ウェル組織培養処理プレートの各ウェルにREND液65μlを加える。ウェルの全面を覆うように均等にソリューションを広げ、&gt; 30インキュベートRTで分。 </li><li> 48ウェルプレートのウェルあたり1×PBSを10μlの0.5×10 6細胞の密度で細胞懸濁液を準備します。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにウェルあたりRBM行列100μlの細胞懸濁液を混ぜる。優しく上下にピペッティングにより細胞やRBM行列を混ぜ、泡を導入することを避ける。マトリックスのゲル化を防ぐために氷の上で、細胞/マトリックス混合物を保管してください。 注意：RBMシステムは完全にスケーラブルであり、非48ウェルフォーマットにシステムを設定するために、使用されるプレートの表面積に基づいてすべての試薬 ​​（行列や培地）の量を調整します。それに応じてめっきされる細胞の数をスケール。 </li><li>残りRENDを吸引し、ウェルの中央に、細胞/マトリックス混合物を追加します。すぐに、均一にウェルの表面全体を覆​​うように、細胞/マトリックス混合物を広げた。 37°Cで30〜60分間プレートを置き、5％CO 2組織培養インキュベータマトリックスを固化することを可能にする。振ったり、DISしないでくださいインキュベーション中、プレートをTURB。 トラブルシューティング：めっき前によく混ぜ、RBMのセルの偏在を防ぐため。すべての5の目だけでなく、チューブの底にセトリング細胞を避けるために、メッキ後に混ぜる。一度メッキ、細胞がマトリックスに表面張力により井戸の底に沈むしないでください。 トラブルシューティング：、RBMのセルの偏在を防ぐメッキによく前にミックスする。よくチューブの底にセトリング細胞を避けるために、メッキごとに5 回目の後に混ぜる。一度メッキ、細胞がマトリックスに表面張力により井戸の底に沈むしないでください。 </li><li> 37℃に設定した水浴中で予熱しBMGM </li><li> 30分後、行列が適切に設定されていることを確認してください、それはプレートが傾いたときに移動しない層のような柔らかいゲルを形成する。暖かいBMGM 1mlで細胞/マトリックス層を重ねる。非常にゆっくりと行列ピペット媒体の引き裂きを回避するために使用して（滴ずつ分注）血清学的ピペット。 37℃で、所望の時間のために、5％のCO 2組織培養インキュベーターや文化に組み立てRBM文化を置きます。 注：細胞生存率は、培地を交換せずに少なくとも30日間維持され、培地交換が必要な場合にのみたびに、培地の50％を変更する。 重要なステップ：それは冷たい温度が既に設定されている行列を乱す可能性があるため媒体が冷えていないことが重要です。それは柔らかいマトリックス層を壊すかもしれないで、マトリックスの上にメディアを噴出しないように注意してください。 トラブルシューティング：RBMシステムにおける細胞生存率が低い場合、細胞密度は、BM吸引液からの一次単核細胞以外の細胞を操作するときに実験的に決定されなければならない。細胞株を操作する場合、不死化細胞株は、初代細胞よりも速く増殖するように、細胞数を10倍減少させる。 </li></ol> 4。 「イン行列 &#39;イメージング<ol><li><strong&gt;光学顕微鏡<ol><li>明視野画像を用いて直接RBMで培養された細胞、微分干渉コントラスト（DIC）、共焦点又はマトリックスは、約1mmの厚さであるように、長距離の撮像を可能に任意の他の撮像技術。上から下まで全体の文化イメージに顕微鏡の多くで利用可能なzスタック機能を使用します。 </li></ol></li><li> 免疫蛍光染色 ヒント：以下の免疫染色プロトコルは染色/洗浄溶液を吸引しないようには、代わりにプレートを傾け、ピペットを用いてソリューションを削除します。 <ol><li>ピペットを使用してBMGMを削除し、RT 1XのPBSを100μl/洗浄/ウェルで2〜3倍を洗う。十分なPBSをウェルの表面全体をカバーするために使用されていることを確認してください。 </li><li>室温で15分間10％のNBFの（48ウェルプレート用）100μl/ウェルを添加することにより、マトリックス内の細胞を固定。 NBFを削除して、RT 1XのPBSを100μl/洗浄/ウェルで細胞を2回洗浄します。 ノート：それは、マトリックスを液化可能性がある冷たいNBFの使用は避けてください。 </li><li> PBSを除去する、抗体の非特異的結合をブロックするために室温で一晩又は4℃で1時間、1％BSAを加える。 </li><li>必要な希釈で、1％BSA中の一次抗体溶液を準備します。希釈は、メーカーに確認するか、最適な抗体濃度を決定するために滴定、各抗体ごとに異なります。一次抗体溶液100μL/ウェルを添加し、製造業者の指示に従ってインキュベートする。 重要なステップ：蛍光団または蛍光色素に結合させた抗体を含む全てのインキュベーションは、暗闇の中で行われるべきである。 </li><li>一次抗体溶液を除去し、5分間×PBSで3回洗浄します。 </li><li>間接免疫蛍光染色のために、室温で1時間の蛍光プローブに結合させた二次抗体とインキュベートします。製造元が推奨する濃度で、1％BSA中で抗体を希釈する。 </li><li>二次Aを削除ntibody液と5分間×PBSで3回洗浄します。 トラブルシューティング：高いバックグラウンドを回避するために撮像中に、蛍光結合二次抗体を滴定し、十分な信号を提供し、最も低い濃度を使用しています。高いバックグラウンドがまだ問題になる場合は、洗浄工程の数と期間を増やすか、直接結合一次抗体を使用して、ステップ4.2.6をスキップします。 </li><li>核は、製造業者によって示唆さの希釈率で、 &#39;、6 - ジアミジノ2 - フェニルインドール（DAPI）核染色溶液を4染色を追加し、室温で7-10分間インキュベートする。 </li><li>核染色溶液を除去し、5分間1X PBSで2回洗う。 </li><li>最後の洗浄から、PBSを削除し、蛍光を維持するために試料上に、封入剤の滴（正規集合）を追加します。蛍光または共焦点顕微鏡上で適切な励起/発光の設定を使用してイメージ。 注：画像は、染色の2日以内に行われるべきであるマトリックス及びRBMの完全性と蛍光シグナルが失われるの劣化を回避することができる。すぐに画像化されていない場合は、染色されたサンプルが撮像されるまで、光から保護し、4℃で維持されるべきである。 </li></ol></li></ol> 5。 RBMから細胞を分離<ol><li>マトリックス層を乱すことなく静かに培地を除去します。吸引しないでください。 </li><li>洗浄細胞は、滅菌1×PBSで2倍。吸引しないでください。 </li><li>各ウェルに氷冷したCRSの0.5ミリリットルを追加し、激しく上下にピペッティングにより、細胞と一緒に行列全体の層を除去する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の細胞、マトリックス、およびCRSを収集します。氷の上に置きます。 </li><li>同じウェルに追加の0.5ミリリットル、CRSを追加し、すべての残りの材料を集める。同じマイクロ遠心チューブに移します。 </li><li>渦細胞、マトリックス、およびCRSの混合物と1時間、氷上でインキュベートする。渦細胞は15分毎に、マトリックスからの放出を容易にする。 </li><li> 1時間後、目に見える塊の後に混合物を確認してください行列の存在すべきである。 トラブルシューティング：行列の塊が1時間後に観察される場合は、より大きなチューブに転送細胞/マトリックス/ CRSの混合物、CRSの追加の2〜5ミリリットルを追加し、さらに30〜60分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で5〜10分間、1,000 rpmで、CRSでの遠心細胞上清を除去し、冷たい1×1mlのPBSに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 5〜10分間1,000 rpmで遠心分離し、上清を除去します。 PBS洗浄をもう一度繰り返します。 </li><li>第PBS洗浄等は、 インビボ移植において 、フローサイトメトリー、マトリックスおよび単離された細胞からの細胞の回復は、このようなDNA / RNA /タンパク質の単離などの任意の下流の適用のために使用することができる完了する。 </li></ol>

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著者らは、競合する利害を宣言していません。

RBMモデルは、BMの細胞組成物は、最大30日間、ex vivoで維持される総合的なシステムを提供しています。その機能が密接に生体内で見つかったBMアーキテクチャを模倣に従ってRBM自己層別化で成長させた骨髄細胞。さらに、これは多発性骨髄腫クローン8の膨張を可能にする最初のシステムである。 BM細胞の力強い成長と文化の全体的な成功を確保するための最も重要なス?...

組織培養は、無傷の生物において各種の処理を比較するとき、全身の変動を最小限に抑えるために制御された環境における細胞の挙動を研究するために開発された。この方法は、最初に初期の1900年の1,2年に設立され、組織外植片をガラス皿にex vivoで培養した技術を意味した。半ば1900年代では、システムではなく、無傷の組織の断片よりも分散した細胞を増殖するように適合され、用語「組織培養」と「細胞培養」は3の代名詞となった。このような従来の細胞培養系において、細胞は、種々の成長因子を補充した増殖培地を重層した組織培養プラスチックの表面上に成長させる。接着細胞培養、細胞が付着し、細胞を懸濁液中で増殖された組織培養プラスチックおよび非接着性培養物、上に広げ：培養物の2つのタイプが種々の細胞の接着能力に基づいて、浮上している。細胞の初期の頃から培養物は、多数の不死化細胞株は、HeLa細胞4、第一のヒト癌細胞株として、作成されている。これらの細胞株は、細胞培養で無限に増殖する能力を有し、そしてほとんどが生存能力を維持するために特別な処理を必要としない。 元の細胞培養法の還元主義的アプローチは、細胞生存および増殖を維持するのに必要なだけ最低限の成分を含むことによって、可能な限りシステムを簡素化するために設計された。しかし、簡略化された細胞培養アプローチは、有限の寿命を有するex vivoで最も主要なヒト細胞タイプをサポートすることができない。従って、新たな培養系は、したがって、細胞外植片を生理的条件下で増殖させ、可能な限り厳密に組織微小環境に近似するように設計されている。還元主義/従来の細胞培養手法とは対照的に、3次元（3-D）培養システムは、現在、種々の培養を効率的に好適な方法になってきているヒト細胞株および初代細胞は、その後、支持微小環境の文脈において、健康および疾患に関与する機構を研究する。このような3次元システムは、通常、目的の細胞型を研究する組織の微小環境を再現するためには、成長因子を添加し、再構成された行列、および/またはメディアを使用して設定されています。これらの3次元（3-D）培養モデルの第一は、乳腺発達を研究するために開発された。乳腺上皮細胞をマトリゲルに包埋した天然条件下、コラーゲンIVおよび細胞外マトリックス（ECM）のラミニン豊富な供給源を細胞に提供し、成長培地を重層する。このような条件下では、乳房上皮細胞が乳腺腺房に似たクラスターを形成し、乳腺刺激ホルモンによる刺激の際に、これらの腺房は、腺房様構造の中空lumenaに、カゼイン、および他の乳タンパク質を分泌した。カゼイン分泌あってもプロラクチン5の添加後、標準的な培養では観察されなかったさらに、細胞の形態学的および表現型の特徴を維持における微小環境の役割を強調している。細胞は、それらの生理学的微小環境の文脈から取り出される正常な細胞機能の喪失の別のデモでは、支持的微小環境なしに、ケラチノサイトは重層化表皮6を形成するために失敗していることの証明である。他の3-Dモデルの数は、初代細胞のex vivo増殖7,8を可能にするために作成されている。 細胞挙動における微小環境の重要な役割は、エレガントな乳腺上皮細胞は、私が行列コラーゲン中で培養し、マトリゲル内に形成された正確に偏光した腺房と比較した「インサイド·アウト」腺房形成の研究で実証された。ラミニン産筋上皮細胞は、コラーゲンI培養9に追加されたときに適切な形態のこの損失は、元に戻されました。また、正確な微小環境を正確に必要です遺伝子型症状。 CEACAM1は、非トランスフェクトCEACAM陰性細胞とまったく同じように動作し、細胞 - 細胞接着分子でトランスフェクトされた皿、MCF7乳癌細胞で増殖させた。しかし、非悪性乳腺上皮10との間に確立されているようにCEACAM1にトランスフェクトされたMCF7細胞は、中空lumenaの正規表現型および形態腺房に戻りつつECM、野生型MCF7形腫瘍のような構造と接触し、マトリゲルで培養した。同様に、乳癌細胞におけるβ1-インテグリンの遮断は、標準的な培養条件下で、それらの動作を変更したが、3-D培養物で行った同じ実験は、β1-インテグリンの遮断が正常な表現型11に悪性細胞を戻すことを実証しない。したがって、組織微小環境は、細胞生存率を維持するために必要とされるだけでなく、適切な細胞機能を保持する。 細胞の挙動は、生理的条件下で研究することができるシステムを提供することに加えてsは3-D培養物は、新規治療薬8,12,13の前臨床試験のための堅牢で信頼性の高い媒体として機能する。 3-Dで細胞を培養すると、細胞-細胞および細胞-ECM間接着の寄与を評価することができる環境媒介性薬剤耐性14に記載の条件下での治験化合物のスクリーニングを可能にする。さらに、新規化合物のオフターゲット毒性は、種々の組織の複数の細胞区画に組み込むことによって確認することができる。このようなスクリーンは、より迅速に行われ、より費用対効果のインビボ 8 で同等の試験よりもすることができる。 ここでは、正常および悪性の骨髄（BM）細胞が密接にヒトBMの微小環境を模倣するシステムにおいてex vivoで増殖する 、再構成された骨髄（RBM）の3-Dモデルの設定を提示する。 BM間質の様々な構成要素を有する2-D培養物は、液体または接着共培養において初代ヒトBM細胞を増殖する以前の試み、又は3-D、半固体寒天培養物は、組織微小環境15-18の成分を細胞に供給することができないことに限られた成功しか収めていない。これらのシステムでは、一次骨髄細胞は、貧しい人々の生存能力を持っていたし、ex vivoでの増殖することができませんでした。ヒトBM前駆細胞は、BM間質細胞との共培養スフェロイドで増殖させる別のシステムは、造血幹細胞の生存および増殖は、少なくとも96時間持続した19 3-Dシステムである。造血前駆細胞生物学の理解に非常に有益なものの、このシステムは、忠実にその有用性を制限するため、ECM成分が存在しないためBMの微小環境を再現しない。ここで説明するRBMモデルは、人間の骨髄の両方細胞および細胞外区画は、in vitroで再構成され、総合的なシステムを提供します。我々は、RBM培養物は、正常ヒトBM細胞のex vivoでの増殖を支持することができることを示しているとして、我々様々な血液疾患の患者から単離された細胞のようにチェック！

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

組織培養は、通常の開発から病気に、細胞機能の多くの側面を研究するための貴重なツールとなっている。従来の細胞培養方法は、組織培養皿の固体基質に付着したり、液体媒体中で懸濁液中で増殖するいずれかの細胞の能力に依存する。多数の不死化細胞株が作成され、そのようなアプローチを用いて成長させた初代細胞がex vivoで成長させる必要がある場合、しかしながら、これらの方法はしばしば失敗する。このような障害は、組織培養プラスチックは、細胞増殖のための表面として使用される一般的なシステムからの組織の微小環境の適切な細胞外マトリックス成分の不在に起因している。細胞外マトリクスは、組織微小環境の不可欠な構成要素であり、その存在は、細胞の極性化、生存および増殖などの生理的機能の維持のために重要である。ここでは、一次骨髄セル3次元組織培養法を提示lsのは、ヒト骨（RBM系）の微小環境を再現するように処方細胞外マトリックス中で増殖させる。細胞外マトリックス中に埋め込まれ、細胞は、このように一次組織の細胞組成を維持しながら、細胞生存および増殖は、30日まで持続することができる総合的なシステムを提供し、ヒト血漿を補充した培地を介して栄養素が供給される。 RBMシステムを使用して、我々は成功し、正常なドナーや患者アミ​​ロイドーシス、および様々な血液悪性腫瘍からの一次骨髄細胞を成長している。 RBMシステムは、直接、イン行列リアルタイム細胞の挙動の可視化と新規治療薬の前臨床効果の評価が可能になります。さらに、細胞は、RBMから単離し、続いてインビボでの移植、細胞選別、フローサイトメトリー、および核酸とタンパク質分析のために使用することができる。一緒になって、RBMの方法は、一次骨marroの成長のために信頼性の高いシステムを提供しています生理的条件下で細胞ワット。

一次骨髄細胞は、標準的な組織培養条件下で増殖することができないので、RBMシステムは密接に培養システムを提供し、骨の微小環境を模倣し、ex vivoで BM細胞を増殖するために作成された。 BM細胞外マトリックス、フィブロネクチン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニンおよび21の主要な構成要素は、この3-D培養物に構造的な足場を提供するために、RBMマトリックスに組み?...

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A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K ビュー.  Purdue University. 標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

医学

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

人間の前庭神経鞘腫の初代培養

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...