この作品は、（CACへによってR00MH080599、ノースカロライナ州にR 21 NS062313、およびNS069844）国立科学財団、（認可番号CACへのIOS-0842701）、および国立衛生研究所によってサポートされていました。私たちは、技術サポート、フライラインのブルーミントンストックセンターのジェームズ·シャッツ、エミリーハン、とレニチュオンを承認したいと思います。すべてのチップは、ミシガン大学でルーリーナノファブリケーション施設で製造された。

1。 PDMSチップを作る SU-8鋳型からPDMSチップを作るために、手順1.1から1.7に従ってください。チップが手元ですが、使用のために組み立てする必要がある場合は、1.8に進みます。 <ol><li> PDMSベースの45グラムと小型使い捨てのプラスチック容器に、PDMSキットからエージェント（10:1比率）を硬化の4.5グラムを混合し、徹底的にプラスチック製攪拌棒を使用してそれらをミックス。 </li><li>任意の気泡を除去するために10分間の真空容器（ 例えば 、デシケーター）内の容器を置きます。 </li><li>直径のプラスチック皿の中の150ミリメートルの下部にあるSU-8型を置き、ゆっくりと鋳型にPDMSの混合物を注ぐ。 PDMSを注いでいる間に気泡を発生しないように注意してください。 </li><li> 4時間650℃のオーブン中でPDMS（またはインキュベーター）を硬化させる。 </li><li>オーブンから硬化したPDMS/SU-8モールドを取り外して、数分間冷ます。 </li><li>カミソリの刃を使用して、SU-8鋳型の縁に沿って硬化したPDMSをカットして、SU-8鋳型から取り外し。 </li><li> PDMSスラブを分割カミソリの刃を使用して、個々のPDMSチップに。 </li><li> 21 Gの分注針を用いて、PDMSチップの（ 図1Aに示されている）真空ポートの穴を突く。 </li><li> 23のGペンシングニードルを取り、針がロックハブから切断先端破るために、そのベースから何度か針の先端をねじる。 </li><li>チューブは、針の少なくともミリメートルを覆うようにポリエチレンチューブの小片に23Gの針の先端を挿入します。その後、離れて針から余分なチューブをカットするカミソリの刃を使用しています。これは、真空吸入口に挿入されたときにシールを作成する針の一方の端部の周りにプラスチックリングを作成する。 </li><li>真空ポートの穴に23 G針先端を挿入し、 倒立顕微鏡（ 図1Bおよび図2A-B）で使用する。 正立顕微鏡（ 図1Cおよび2C-D）で使用するために：21のGの塗料で、PDMSチップ側の第2の穴を突く針をnsing、この穴は、側面から最初の穴へのアクセスを提供します。そして、サイ​​ドの穴にチューブリング23のG針の先端を挿入します。上の穴（ 図1C）をシールするために、PDMSチップの上に両面テープの一部を配置します。 </li><li>長さ約20cmでポリエチレンチューブの部分を取る。真空ポートに挿入された針の先端にチューブの一方の側を接続する。 </li><li> （材料のリストに「3方コックを参照）3方弁のポートにチューブの反対側を接続する</li><li>残りの2つのポートのいずれかに20ミリリットルの注射器を取り付けます。最後のポートは、環境に開放されています。 </li></ol> 2。ライブイメージングのための幼虫チップを使用して<ol><li>透明粘着テープでPDMSチップを清掃してください。チップの底にテープ片を取り付けます。テープが全体のPDMS表面に接触されていることを確認した後、テープを剥がし。 </li><li>そこを確認するために、上記のステップ2〜3倍を繰り返しPDMSチップの表面には粒子または（以前の実験から保持）のオイルはありません。 PDMSチップは再利用可能であるので、それはガラスにPDMSの接着に影響を及ぼし、不十分なシールをもたらすことができるように、オイル残留物を除去することが非常に重要である。 </li><li>水を入れたペトリ皿に初期（IE採餌） 第3齢幼虫を転送します。 （採餌第3齢幼虫ではなく培養バイアルの側面よりも、食品にあります）。培養液を除去するために水に幼虫を浸し。 </li><li>清浄なガラスカバースリップを取ると、その中心にハロカーボン700油の小滴を配置します。 </li><li>鉗子を使用して、優しくクリーンを拾う、（幼虫は長さ〜3.5〜4ミリメートルであるべき）水からの第3齢幼虫を早期上演した。余分な水を除去した後、油滴の上に置き、軽量拭きや紙タオルの上に簡単に動物を配置します。降下が十分に小さい幼虫の気管が被覆されていないようなものであるべきである。幼虫のSTAを聞かせて10秒間、油滴上のY。 </li><li>油滴から幼虫を外し、きれいなガラスカバースリップの上に置きます。 </li><li>別のきれいなカバーガラスに幼虫を移します。このステップは、余分な油を除去します。 </li><li>幼虫の向きに注意してください。神経コードと分節神経を画像化するための、幼虫の腹側はカバースリップの上に座る必要があります。 2縦気管チューブが特徴の背側には、上方を向くようにします。注：これは、幼虫が自然好む向きです。 </li><li>そっと幼虫の上にPDMSチップを配置します。幼虫は真空ポートを志向尻尾と、マイクロチャンバーの中央を中央に配置する必要があります。幼虫は、チャンバの縁に接触しないように注意してください。これは前部と後部気管端末では特に重要です。注記：この手順は、最高の実体顕微鏡下で行われている。 </li><li>良好なシールを達成するためのカバーガラスに対して、PDMSチップを押し込みます。幼虫が完全であることを確認してくださいPDMSチップはカバーガラスに触れているマイクロチャンバーで囲まれた。 </li><li>注射器は、真空を作成する（チューブを通して）PDMSマイクロチャンバーから空気を引き出すことができるように三方弁を切り替える。 </li><li>片手でしっかりとPDMSチップ/カバーガラスを保持します。シリンジプランジャを引くもう一方の手を使用してください。抵抗は、真空を作成するために、注射器のハンドルに感じられるまで、空気の2〜2.5ミリリットルを引き出す。真空は、PDMSチップ、油、およびカバーガラスのインターフェース間の緊密なシールを生成し、幼虫の移動性を制限しています。 </li><li> PDMSチップは注射器から、環境から隔離されるように、バルブのスイッチを切る。その結果、比較的安定した真空レベルは、シリンジプランジャを保持する必要なしにマイクロチャンバーに保持される。 </li><li>全体動物の体はマイクロチャンバの内部に配置されていることを確認するためにステレオスコープの下で幼虫を確認し、動物が不動であること。気管を表示する必要がある。残りのPDMSチップは、カバーガラスで接触していなければならない。注：正しくチップに固定化された動物の例については、図2Eと2Fを参照してください。いくつかの誤った向きは、 図2G及び2Hに示されている。 </li><li>顕微鏡で幼虫チップ（PDMSチップ+カバーガラス）を配置します。幼虫チップ、チューブと注射器はカバーガラスからのPDMSチップの剥離を避けるために、慎重に処理する必要があります。正立顕微鏡のために、両面テープ（ 図1C）を顕微鏡ステージにチップの「上部」側に固定してください。 </li><li>興味のある動物の構造（複数可）を検索し、撮影を行うために、高倍率の対物レンズ（油浸、40-63Xを推奨）を使用します。いくつかの場合において、より低い倍率を高倍率に切り替える前に、撮像のための所望の領域を同定するために必要とされてもよい。 </li><li>撮像が完了すると、位置にバルブを切り替えることにより、真空を解放するそれは、環境に開放されています。 </li><li>カバーガラスからのPDMSチップを取り外します。幼虫は、すぐに運動性である必要があります。 </li><li>マイクロチャンバーから幼虫を削除して、ゆっくりと回復のためのブドウジュース寒天プレートに幼虫を配置する鉗子を使用してください。 </li></ol> 3。幼虫分節の神経に神経挫滅傷害を誘発する<ol><li>隔離するために、上記のステップ2.3に従って早期希望の遺伝子型の第3齢幼虫を上演した。ステップ2.3で説明したように食物を除去するために水に幼虫を浸し。 </li><li> CO 2パッドで、標準的なフライのCO 2麻酔ステーションを使用して幼虫を征服するために、解剖実体顕微鏡下に保持。幼虫は1〜2分間のCO 2パッドの上に配置した後に不動になる必 ​​要があります。 </li><li>今実体顕微鏡下でブドウジュース寒天プレート上に単一の麻酔をかけた幼虫を置く。腹側神経索を視覚化し、（キューティクルを通して神経を分節するように動物腹側を回し<strオング&gt;図3）。幼虫が完全に不動であることを確認してください。 </li><li> Dumostar番号 - 5鉗子を使用して、しっかりと5月10日秒クチクラを通して分節神経をつまむ。これが正しく行われると、キューティクルが無傷のままであり、体壁を貫通されていない。注：傷害は、前後体軸に沿って異なる位置で行うことができるのであれば、腹側神経索、唾液腺、および腸のような損傷を受けない。 図3Dに示すように、最も効果的な傷害の場所は、第3 の腹部セグメントの終点に向かっている。この場所の損害賠償最も神経の傷害とは、動物を殺すことなく再現することが最も簡単です。 </li><li>損傷後、ブドウの板の上に動物のように、その腹側を下に向ける。それは、そのヘッドを移動して食べることができるはずです。怪我が成功した場合には、幼虫の後半分が麻痺します。 </li><li> 25でグレープジュース寒天プレート上で負傷した動物を飼う＆＃176;、Cの実験目的に応じて所望の時間。運動ニューロンのために、近位断端が負傷14の8から10時間以内に発芽し始め、遠位断端が6-8時間15以内に退化し始めます。クラスIV DA感覚ニューロンでは、近位断端は4-6時間以内に発芽し始め、遠位断端は損傷後3〜4時間以内に退化し始める。注：適切なGal4のドライバと蛍光リポーターで、発芽および変性（例えば、 図6を参照）幼虫チップに観察することができる。 </li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

作ったり、幼虫チップを得た。 幼虫チップは、カバーガラスに付着したPDMSブロック（ &#39;PDMSチップ」と呼ばれる）で構成されています。ステップ1のプロトコルは、SU-8鋳型が使用可能であると仮定すると、幼虫チップの製造および使用のための手順を説明します。 SU-8鋳型は、フォトリソグラフィ（詳細はGhannad-Rezaie ら 12を参照）、シリコンウエハ上に140μmの厚さのSU-8フォトレジスト層をパターニングすることによって微細加工される。 SU-8鋳型の微細加工が特殊な装置へのアクセスを必要とするように、我々は微細加工施設から、それを注文するお勧めします（ 例 。ミシガン州14大学のLNF施設）、またはそれらに提供されているチップ設計を送信することにより、鋳物工場から補足ファイルとして。一つはPDMSチップ（異なるサイズの幼虫で使用するための、例えば ）の設計を変更したい場合は、DXFファイル（ 例えば AutoCADの）を扱うCADソフトウェアを使用することができる。 SU-8金型もMondalの説明に従って、社内で行うことができら。27多くの読者はそれが便利なだけで、自分のチップを製造する前に、テクニックを試すために、サンプルのPDMSチップを得かもしれません。これは、要求に応じて、自由に利用可能になります。 ライブイメージングのためのマイクロ流体 &#39;幼虫チップ」を使用する： 幼虫チップ内の固定化方法は、動物の動きを制限するために、真空の適用を介して、麻酔薬の使用を避け、その代わりに圧力を伴う。動物は、複数の時間12用チップに固定化を生き残ることができますが、短い固定期間（5月15日分）をお勧めします。これは、細胞内カルシウムの変化、または高速軸索輸送など、関心のある多くの細胞事象を、画像化するための十分な時間である。これはまた、このようなレーザベースマイクロサージェリー、光退色、およびphotoconverなどの生きた動物で目的の操作のための十分な時間であるシオン。 単一の動物においてより長い期間にわたって長手方向にイベントを研究するために、動物は、チップ内に配置し、複数回撮像され、休止期間によって分離することができる。彼らは簡単な食料源と湿度を提供するようにグレープジュース寒天プレートは、イメージングセッション間で休憩に最適です。各セッションは（下記、トラブルでパート2を参照）が、動物にダメージを与えるためのいくつかのリスクがあるため、複数のイメージングセッションは、程度に幼虫の生存率に影響します。動物は、日常的に50％を超える生存率で二日間にわたって&gt; 5回撮像することができる。動物を麻酔していないので、彼らはすぐに、チップ内の真空度のリリース後に健康で、運動性である。そこ撮像セッション間の回復時間のための必要性が存在しないため、セッションの間の時間間隔はフレキシブルであり、実験の目的に合わせることができる。 トラブルシューティング： 最も一般的な技術である幼虫チップおよび推奨する解決方法は以下の通りと訴える。 （1） 動物があまり移動している。あまりにも多くの移動度は、撮像シーンを妨害する可能性がある。幼虫チップで、このための最も一般的な理由はa）の動物は、チップには小さすぎる、またはb）固定化工程の間に適用される真空圧が危険にさらされている。このプロトコルで説明幼虫チップは早期第3齢幼虫を上演するために設計されています。動物のための最適なサイズは、（前後軸に沿って）、長さ3.5〜4ミリメートルである。抵抗がハンドルに感じられるまで真空圧が十分であることを確実にするために、注射器2〜2.5ミリリットルを引っ張ったり、。真空が作動していることOne指示が周囲チャネル内の小さな気泡が真空源に向かってゆっくりと移動して見ることができることである。別の指標は、チップが（上から持ち上げたときカバーガラスは常にチップと一緒に旅行べきことであり、これは、チャンバを輸送するための方法をお勧めします幼虫は配置され、真空）にしたら。チューブに亀裂がある場合には真空が損なわれる可能性がある、または油は、チューブ内に存在する場合。これにより、容易に針の先端と（ステップ1.6から1.14まで）、ポリエチレン-50チューブを分配G 23置換することによって対処することができる。 （2）動物は、チップ内の画像形成後に死亡した。 手順は、動物の際に最小限のストレスを引き起こすためのものであり、野生型の遺伝子型の動物であっても、チップ12上の固定化の時間の後、&gt; 90％の生存率を有している。いくつかの遺伝子型は、チップのストレスが少なく弾力される可能性があるので、最初に野生型動物（たとえば、 カントンS）の固定化技術を生き残ることを確認してください。 A）致死のための最も一般的な原因は、幼虫の不正確な位置決め（ 図2G-H参照 ）である。クチクラ、頭部または気管の部分が完全にチャンバ内にない場合、それらは固定化の際に損傷を受けることがあり、そしてaチップ（&gt; 4mm）を大きすぎる幼虫が生存する可能性は低い。 B）致死はあまり一般的な原因は、過剰な圧力や真空チップのロードを使用することである。適切チップに配置されると、真空によって発生した圧力は十分に許容される。しかし真空から、または動物を配置する初期のいずれかの過剰な圧力は、問題となることがあります。それは、正しいサイズの野生型幼虫を試験によって経験的に必要とされる圧力の程度を学習することをお勧めします。あまりにも多くのハロカーボンオイルは、動物の気管をカバーしていた場合はC）動物は、潜在的に長期生存の問題を持つことができる。油は、チップのいくつかの重要な役割を果たしている：それは、結像光学系の間に真空を作成するために重要であり、チップ内の乾燥を妨げる。しかし、過剰な油は避けるべきである。 （これはまた、真空を損なう、チューブ、シリンジ内の油につながることができます）。そして提案されたプロトコルのコートオイルと幼虫のちょうど腹側、Rイメージングのための最終的なカバーガラスに転送する前に、きれいなカバースリップ上の幼虫の配置によって余分な油をemoves。 D）光毒性は、撮像セッションから体験することができます。任意のライブイメージング·アプリケーションと同様に、最高の高感度カメラまたは検出器を用いて達成される低強度のレーザ光で短い露光時間を使用することが理想的である。水銀光源によって作成された広域スペクトル光を含む、UV光での照射を最小化しようとする。 他の問題と今後の方向性： この方法は麻酔薬を使用しないので、動物の心が打ち続けています。これは、より多くの他よりもいくつかの場所で画像化に影響を与えるいくつかの避けられない機動性を作成します。ここでの例は、腹側神経索分節の神経及び体壁を容易に心拍からの干渉なしに撮像することができることを実証している。ハートビートは、撮像に影響を与える場合において、定期的な運動は、時々で補正することができる解析ソフトウェア（たとえば、ImageJのための手ブレ補正プラグイン）。個々のオブジェクトは、高速時間スケールで（高速軸索輸送については、例えば約1ミクロン/秒）または非常に遅い時間スケールで（数分から数時間）を移動している場合に適しています。しかし、ときにオブジェクト（S）の速度と方向の範囲に関心が移動するのではなく、ハートビート誘起動きを補正するために困難になることができます。 もう一つの問題は、動物から動物へ、あるいはチップ内の同じ動物の複数の撮像セッション間の光学系のわずかな変動である。深い関心のある物体が動物内で、より大きなこの変化はなります。分節性神経および腹側神経索は、次いで、通常は定期的な顕微鏡内に結像される動物深すぎる。しかし幼虫チップで経験穏やかな圧力は非常に近く、キューティクルやカバーガラスにこれらの構造をプッシュします。カバーガラスからのこれらの構造の正確な距離は、TRから小さな変化を持つことになります裁判にIAL。オブジェクトのための変化が、このような感覚ニューロンの細胞体として、キューティクルを閉じて、小さい。これは、光学系の変動を考慮するため、動物および独立した試験の大多数を利用すること、特に強度の測定を行うため、重要である。 ここに示す例は、神経細胞内のプロセスに焦点を当てているが、アプローチは、顕微鏡対物レンズの焦点深度内にもたらすことができる動物で任意の構造を画像化するために従順でなければならない。これは、キューティクル、体壁の筋肉、およびそれらのNMJを含む。動物の腹側に気管、潜在的に消化管のどの部分にも画像化されることがあります。動物はまた、背側表面近傍の構造の短期イメージングのためのカバーガラスに向かってその背側に配置することができる。動物内の深い画像構造化する能力を用いる顕微鏡対物レンズの作動距離によって制限される。このようなIMなどの構造aginalディスクは、高倍率（ 例えば 40倍）の目標にはアクセスできません。 このプロトコルで説明幼虫チップは（3.5〜4ミリメートルの大きさの範囲の）早期の第3齢段階で幼虫のために設計されています。しかし、多くの興味深い質問が異なる幼虫の段階で画像化を必要とする。後期第3齢に対応するために2 回目の幼虫、以上のチップを収容するための小さなチップを容易に同じ原理を用いて設計することができる。 （補足図1は、変更された室のサイズのシリコン金型を作るための容易に変更可能なDXFファイルが含まれています）。可逆的シールの単純な原理であっても、Cなどの他の生物に適用することができる主な変種はチャンバサイズであることと虫やゼブラフィッシュ、。有用な将来の方向は、スクリーニング目的に使用する、一度に多くの動物を固定化することができ、チップを設計することである。しかし、このために、設計が大幅に異なる必要があるであろうチップ内に動物を配置する問題は独立して各動物のために対処する必要がある現在のデバイスから。 幼虫末梢神経傷害応答を研究するための神経挫滅アッセイ： 幼虫分節神経のため、ここで説明した神経挫滅アッセイは、 ショウジョウバエの末梢軸索の損傷を導入するための簡単な方法です。この方法の利点は、a）それは、ショウジョウバエの研究室（実体顕微鏡用のCO 2源と鉗子）に見られる標準のツールで行うことが簡単であること、b）には、多くの動物のために迅速に行うことができ、損傷後の神経コードの生化学的解析を行っ14実現可能なこと、c）この傷害に対する分子や細胞応答は、14,15,28高い再現性であり、脊椎動物の神経細胞29,30にも重要なプロセスを発見するために使用することができます。 神経細胞を損傷するための代替方法がfocuことですSA高出力レーザー、例えばレーザー顕微17,31-33を経由して軸索を切断するため、パルスUVまたはフェムト秒レーザー、。幼虫のチップは、マイクロサージェリーのために動物を配置するための理想的な方法です。しかし、前述の試験で、間の光学における小さな差異に、レーザーベースの方法は、特に幼虫分節神経において、幼虫に再現することがより困難になることができます。また、レーザベースの軸索損傷は、（多数の動物を有する）を大規模に行うことはより困難であるため、各動物を位置決めするために多くの時間を必要とする。 トラブルシューティング： 神経挫滅から最も一般的に発生する技術的な問題は、内臓の損傷による死亡である。クラッシュを実施するときには、腹側神経索、唾液腺、または腸を挟まないようにすることが重要である。これは、キューティクルを穿刺しないことも重要です。これらの問題は、最高のキューティクルsurfacに45°の角度でピンセットを持って来ることによって回避される電子（ 図3参照）。 鉗子の品質は、その後クラッシュと生存の有効性に大きな影響を与えます。我々はDumostar数5鉗子をお勧めします。その切れ味を保持するには、鉗子は、注意して取り扱う他の目的に使用されていない、と彼らは鈍いか、曲がっになったら交換する必要があります。 動物の大きさはまた、クラッシュの有効性に影響を与えることができる。 （長さ3ミリメートル未満）の小さな動物ははるかに少ない傷害を生き残る可能性が高い。大型動物では、（ 第3齢を徘徊）、それは神経を見つけ、大きな唾液腺および腸への損傷を回避することがより困難であり、蛹化前に損傷応答を研究するための短い時間がある。神経挫滅を最 ​​も効果的に（前後軸に沿った長さが〜3〜4.5ミリメートルである）初期の第3齢幼虫で行われる。 動物が上に上昇する食料源が影響する可能性クラッシュ後のキューティクルと生存の強さ。これは、標準的な酵母 - グルコースのレシピから作られた食品中の動物を調達することをお勧めします。 効果的にクラッシュを行う方法を学習するための最良の方法は、最初にプライマリ生存を達成するという目標（とは蛹化）クラッシュ後の24時間で、多くの動物をで練習することです。初心者は、通常、低い生存率（ 例えば 、10％）を有するが、技術が学習されると、生存率は約90％に達することができる。 他の問題と今後の方向性： クラッシュアッセイは、損傷部位と軸索と損傷部位より遠位シナプスの変性に軸索の近位の発芽を研究するための強力な方法を提供する。変性の速度が異なるニューロンタイプ間で異なりますが、それらは傷害アッセイの再現性を証明するものを提供し、特定の神経細胞タイプの中で、高度に再現可能である。 対照的に、「回生」は出芽近位の軸索で観察された応答は、研究により困難である。分節神経のすべての軸索は（例えば、 図6と図3を参照）損傷部位に近い発芽広範な開始。しかし発芽の程度はニューロンからニューロンへの変化し、定量化することは困難であることができます。出芽における類似度変動性はUVパルス化色素レーザーを用いて導入分節神経の単一運動ニューロンのより局所性病変後に観察することができる。私たちは、発芽のnondiscriminate方向性が分節神経の指導の手がかりがないことによるものであることを解釈する。これとは対照的に、近くに自分の細胞体へのレーザにより負傷した感覚ニューロンの軸索は、失われた軸索34と同じ方向に新たな軸索 ​​成長を受ける。動物のこの領域における軸索は、おそらく再生軸索の指導のためのより具体的な位置情報にさらされている。分節神経内の環境はずっとresemblanを持っていることはほとんどありませんもともと胚におけるそれらの誘導中にナビゲ​​ートする軸索は、従って再生軸索を案内する情報を有することが期待されていないことを環境にCE。 分節神経挫滅アッセイを使用して再生を研究するための他の制限は、動物が受ける前に負傷した感覚と運動神経軸索はまだ彼らの目標を達成するために（0.25〜1ミリメートル）を覆うようにかなりの距離があり、限られた時間枠（&lt;3日間）ということです蛹化。最近の研究では、 第3齢幼虫35の長さをトリプルprothoraciotropicホルモン受容体の遺伝子操作を同定した。この操作は9ではなく3日間に、大幅に損傷後の神経細胞の回復と変性を研究するための時間枠を拡張します。これは損傷がシナプスエンディングに近い誘導される場合は特に、そのシナプス後の目標とそのような傷ついた軸索の再接続などの新しいイベントを、観察するのに十分な長さがあります。

ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエは 、100年以上のモデル生物として利用されており、基本的なシグナリングおよび無脊椎動物からヒトに保存されている発生経路を定義することに尽力証明されている。特定の細胞型で、蛍光タグ付けされたタンパク質を発現させるために利用できる多くの遺伝的なツールがあり、特に以来、ライブイメージングは、細胞のメカニズムを研究する重要なアプローチであり、シンプルなボディープランとショウジョウバエの幼虫の半透明のキューティクルは、ライブイメージングのための魅力的なシステムになります。 ライブイメージング技術のための重要な課題は、非侵襲的に固定化し、顕微鏡検査のために動物を配置することである。従来の固定化アプローチは、動物を殺すどちらの切開1,2またはクロロホルムの使用を含む。麻酔エーテル4およびイソフルラン5-8も使用されている。麻酔薬は、多くの利点を提供するが、彼らはまた、それゆえに研究プロセスに影響を与えると動物へのストレスを作成することができ、神経活動と（ハートビートを含む）の重要な生理学9月11日を阻害する。エーテルおよびイソフルランを操作するための人間の安全上の懸念もあります。 私たちは「幼虫チップ」12を呼び出して、単層のPDMSマイクロ流体デバイス、 ショウジョウバエの幼虫を固定化する薬物のない方法を開発した。このプロトコルは、取得したり、幼虫チップを作る方法を説明し、早期段階第3齢幼虫にライブイメージングのためにそれを利用する方法。チップがシリンジを介して真空を印加すると、その、ジャストフィットマイクロチャンバーから構成され、穏やかな機械的な力を介して動物に固定する。固定化方法は、ガラスカバースリップに近接内の神経索分節の神経及び体壁の筋肉のような腹側構造をもたらす。これは、高い開口アパーチャを有するような構造体の高分解能イメージングを可能にするTURE（高倍率）目的。 （I）幼虫チップの使用は、無麻酔動物のin vivoイメージングを可能にする、化学物質の使用を置き換えます。他の従来技術に比べて幼虫チップの利点は、次のものがあります。 （II）幼虫は、すぐに（イソフルラン8,13のための2時間の回復期とは対照的に）チップから放出された後に回復。これはミリ秒から数分に、時間や日に至るまで、幅広い時間スケールにわたって画像化を可能にします。 （ⅲ）ガス透過性材料であるPDMSの使用は、幼虫の体内への環境からの酸素/空気を連続的に拡散を可能にします。 （iv）のチップを使用するのは簡単かつ安全である、及び（v）それは再利用可能であり、最小限のコストで製造することができる。 幼虫チップを使用するための指示に加えて、このプロトコルは、 第3齢幼虫におけるニューロンのイベントを研究するためのその使用のいくつかの例を提供する。これらはaxonaのライブイメージングを含むL輸送、傷害に対するカルシウム応答、および長い距離と時間スケールでの光転換タンパク質の人身売買の経時的研究。 チップの別のアプリケーションは、軸索損傷に対するニューロンの応答を研究することである。このために、追加の手順は分節神経挫滅による末梢神経内で軸索が負傷のために（第3部）に記載されている。この単純なアッセイは、同時に処理されるべき多くの動物を可能にする標準的な解剖実体顕微鏡下の両方の迅速かつ再現可能に行うことができる。傷害に対する細胞応答は、幼虫チップでのライブイメージングによって研究することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:259px;">0.5 mm Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-170-11B</td>
			<td style="width:449px;">Polyethylene tubing, I.D. = 0.023&#8217;&#8217;, O.D. = 0.038&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1 mm Polyurethane tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">BB521-63</td>
			<td style="width:449px;">Polyurethane tubing, I.D. = 0.063&#8217;&#8217;,&#160; O.D. = 0.125&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">barb to barb connector</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8300</td>
			<td style="width:449px;">0.8 mm barb to barb connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">3-way stopcock valve</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8104</td>
			<td style="width:449px;">Screw on valve for the syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-817-33</td>
			<td style="width:449px;">Screw on 20 ml syringe for&#160; generating vacuum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;">75165A684</td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,&#160; .8mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;"><a href="http://www.mcmaster.com/#75165A679" title="Close">75165A679</a></td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:291px;">H8898</td>
			<td style="width:449px;">Halocarbon oil 700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumostar Number 5 Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:291px;">RS-498</td>
			<td style="width:449px;">For nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">PDMS Kit (Base and curing agent)</td>
			<td style="width:171px;">Ellsworth</td>
			<td style="width:291px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:449px;">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Glass Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">12-544-C</td>
			<td style="width:449px;">24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable Plastic Cup (9 oz.)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Plastic coffee stirrer stick</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Grape juice agar plates</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"><a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

ライブイメージングは​​、しかし、これは生きている動物に挑戦することができ、細胞生物学的プロセスを研究するための重要な技術である。 ショウジョウバエの幼虫の半透明のキューティクルは、ライブイメージング研究のための魅力的なモデル生物になります。しかし、ライブイメージング技術のための重要な課題は、非侵襲的に固定化し、顕微鏡で動物を配置することである。このプロトコルは、我々は&#39;幼虫チップ」と呼ぶポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイス上でショウジョウバエの幼虫を固定化し、画像化するためのメソッドを使用するシンプルで簡単に説明します。幼虫チップは注射器を介して真空を印加すると、動物を固定化し、このような神経索、分節神経、ボディなどの腹側の構造をもたらし、薄いカバーガラスに取り付けられぴったりフィットのPDMSマイクロチャンバーで構成されているカバーガラスのすぐ近く内の壁の筋肉、。これは、高分解能イメージングを可能にし、重要なことには、オクタンの使用を回避する生理学的プロセスの広い範囲の研究を促進するstheticsや化学物質、。幼虫が固定化から容易に回復するので、それらは容易に複数の撮像セッションを行うことができる。これは時間から日の範囲の時間経過にわたる長期的な研究が可能になります。このプロトコルは、ステップバイステップのチップとどのように第3齢幼虫における神経イベントのライブイメージングのためのチップを利用するに準備する方法について説明します。これらのイベントは、軸索、傷害に対するカルシウム応答、および長い距離と時間スケールでの光転換タンパク質の人身売買の経時的研究における細胞小器官の迅速な輸送が含まれています。チップの別のアプリケーションは、再生および軸索損傷の変性反応を研究することであるので、このプロトコルの第2の部分は、分節神経挫滅による末梢神経内で軸索が負傷のための新しい、簡単な手順を説明します。

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Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

15.4K ビュー.  University of Michigan.  ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。 

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Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング

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生物工学

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). We demonstrate in this video article how blast TBI-relevant impulsive pressurization is applied to the neuronal cells in vitro. This is achieved by using well-controlled pressure pulse created by a specialized Kolsky bar device, with complete pressure history within the cell pressurization chamber recorded. Pressurized neuronal cells are inspected immediately after pressurization, or further incubated to examine the long-term effects of impulsive pressurization on neurite/axonal outgrowth, neuronal gene expression, apoptosis, etc. We observed that impulsive pressurization at about 2 MPa induces distinct neurite loss relative to unpressurized cells. Our technique provides a novel method to investigate the molecular/cellular mechanisms of blast TBI, via impulsive pressurization of brain cells at well-controlled pressure magnitude and duration.

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate the molecular/cellular mechanisms of blast-induced traumatic brain injury.

外傷性脳損傷の研究のための神経細胞のインパルス加

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

パワードスーツを使用して歩行する脊髄損傷者のトレーニング

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

組織工学的応用の制御可能な形態の三次元 Poly(ε-caprolactone) 足場のエレクトロスピニング記述を溶かす

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...