トラウマ力学陸軍-UNLセンター（国防総省/ ARO、＃W911NF-11-1から0033チャイコフスキー：：博士なNAMAsチャンドラ）、UNL素人賞（26-1110-0033 -001著者が資金源に感謝したいと思いますチャイコフスキー：LIM）。

1。神経細胞培養<ol><li>神経細胞、アストロサイト、およびそれらの共培養を含む脳細胞は細胞モデルとして使用することもできる。実現可能性の実証として、細胞株の神経細胞の衝動的な加圧が提示されます。 </li><li> SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞（ATCC、CRL-2266）は、18ミリメートル直径のガラスカバースリップ上で培養されています。細胞をDMEMから成る増殖培地を用いて、2 3×10 3個/ cmの密度で播種し、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充した。細胞培養したガラススライドを37℃で5％CO 2の加湿インキュベーター内に保持され</li><li> SH-SY5Y細胞の神経細胞分化を得るためには、細胞をさらにメディアで7日間10μMのレチノイン酸（RA）を補充した培地で処理して2日ごとに変更されました。 7日目に、細胞が加圧されることができる状態になります。 </li></ol> 2。加圧装置：Kolskyバー<ol><li> Kolskyバー、デ1949年Kolsky 1 velopedによって、非常に高い負荷率で材料の機械的特性を測定するために用いられてきた。この装置は、バーとバーの間に接触して配置された試料を持つ2つの棒グラフで構成されます。インシデント·バー上に作成し、応力波は、波が反射および透過波に分割サンプルに伝播します。サンプル中のストレスは、送信波に比例します。そこで本研究では、セットアップKolskyの2小節分の間に配置されるセル加圧室を利用しています。 </li><li> 2つのアルミニウム合金棒（各6メートル長い）が整列真鍮ベアリングによって中断され、in vitro細胞加圧室内の棒の間に挟まれている。上流のバーは一端にクランプ130ポンドの質量を持つ入射バーです。摩擦クランプは、所望のパルス持続時間を与える位置に配置されている。クランプを係と質量と荷重支持体との間にはさみジャッキを締めて、入射バーのクランプの質量部は、事前-cです所望のレベルにompressed。油圧システムとの突然のブレークにクランプをロックノッチボルトを強制すると、急速に予め格納された圧縮を解放し、したがって圧力パルスを生成する。これは、入射バーを介して伝播し、試験室のピストンを駆動し、衝動的にチャンバー内の流体および細胞を加圧する。今度はチャンバー圧は、送信バー下流に伝播する圧力パルスを開始します。バールの圧力パルスに関連する株は45ボルトに興奮して化合物を高抵抗ひずみゲージで測定されます。ゲージ信号は荷重履歴として1 MHzの周波数でデジタルオシロスコープで記録されます。 </li><li> in vitro細胞加圧室内のピストン·シリンダーで構成されています。シリンダーは2.6センチメートル内径と3.8センチメートル外径を有し、空洞の底でタップ小さな穴があります。穴は細胞サンプルのインストール時に空気と過剰流体口として機能します。ピストンは7.5センチですと同じ棒材から作られています。ピストンは低摩擦シールとして配管工の（テフロン）テープの2〜3層でラップされます。エンドキャップの長さは32 mmで、ロード時にカバーガラスを（細胞が培養されている）を固定している2小さなステンレス製のネジがあります。 </li></ol> 3。神経細胞のインパルス加<ol><li>すべての加圧室パーツはオートクレーブを用いて滅菌されており、紫外光の下で保存されています。チャンバーの組み立ては細胞培養用フード内で行われる。チャンバー内のベントスクリュが緩く空洞の根元に空気抜きを行っています。あらかじめ温めておいた（37℃）新鮮な増殖培地の気泡を作ることなく、チャンバー内に分注される。その後、細胞培養スライドガラスをピックアップされており、（外部に面する細胞）ピストンのキャップの上に配置されます。小さな持株ネジが所定の位置に保持するために、スライド上にダウンして締められている。細胞培養したスライドガラスを備えたピストンが挿入されている少し私NTO室の空洞、およびアセンブリは最高点であるベント傾いている。ベントスクリュが削除され、ピストンがまず気泡、余分な水分を押し出す空洞内に押し込まれる。いずれかの基準マークや治具は、すべてのテストのための同じ培地の量を確保するためのガイドとして使用されています。チャンバー内のメディアの軸方向の寸法は約6mmです。ベントスクリュをサニタイズ密室水を作ってそれを交換してください。チャンバーは、それがない場合は、テフロンラップが交換または補強する必要があり、この静的荷重下で漏れないようにしてください。 </li><li>この時点で、Kolskyバーシステムはリセットされます。重い質量は元の位置に戻され、新しいロックボルトは、（壊れた）使用されたものに置き換えられています。約200psiに油圧を使用して新しいロックボルトと係合する。所望の値より少し高い圧力に入射バーのプリローディングセクションを圧縮するためにはさみジャッキを使用し、その後の完全な摩擦係合するように、それをオフにバックアップジャックのネジ。データ収集は現在、武装している。 </li><li>組み立てセル加圧室は、システムにマウントされています。それは、小さなラボはさみジャッキで支えVブロックに配置され、二つのバーと整列している。グリース各インターフェイス光グリース層との間の任意のエアギャップを解消するために一緒に突合せ面をこする。 </li><li>テストは続行する準備ができている。クランプロックボルトを素早く油圧クランプドライバをポンピングすることによって中断を余儀なくされている。クランプは分離され、データ収集、結果を表示する必要があります。セル加圧履歴を送信棒ゲージの測定値から決定されます。使用される送信バーが十分に長い場合、これが唯一の測定値が負圧を示すポイントへの最初の外乱からでなければなりません。気泡がトラップされている場合に送信されるパルスの持続時間は、入射パルスより短くなる場合があります。大きさは入射パルスのそれに達しないかもしれませんが、それは十分に経度を持つべきアンロードする前に、グラム台地。それ以外の場合は、密閉されたチャンバまたはアセンブリとバーの間に大きなずれ気泡のいずれかが発生した可能性があります。 </li><li>細胞の加圧室を除去し、細胞培養フード内に分解されました。ベントスクリュが削除され、ピストンをチャンバーの自由引っ張られる。細胞培養したスライドガラスは、ピストンの端から取られます。 </li></ol> 4。加圧された細胞の挙動を評価する<ol><li>加した後、細胞をすぐに検査することができるか、さらに後で調べるインキュベートした。適切な無菌操作プロセスを使用すると、長期的なポストインキュベーションが可能です。 </li><li>加圧された細胞はすべての分子細胞生物学的手法により調べることができます。具体的にTBIの条件で細胞と分子の生理機能を調査するために神経細胞の加圧、神経突起伸長の圧力誘起変化を評価するアッセイ、微小管細胞骨格の変化、神経細胞の遺伝子expre用ssion、アポトーシスなどを行うことができます。対照細胞試料を、同じ培養される細胞は、同じ期間の加圧室の内部に保持しますが、加圧されていないが（そのため、制御室とも呼ばれます）使用されている。 </li><li>神経突起伸長の変化を評価するために、加圧及びチャンバコントロール細胞はすぐに加圧およびポストインキュベーションの1時間および24時間後に光学顕微鏡で観察されています。神経細胞の画像の例は &quot;代表的な結果&quot;セクション（図2）に示されている。神経突起の長さの変化は、アクチン免疫蛍光染色と画像解析によって定量することができる。細胞を4％（w / v）のパラホルムアルデヒド溶液で固定0.05パーセントv / vのTween-20を洗浄緩衝液でリンスし、0.1％（v / v）のTriton X-100溶液を浸透されています。 1％w / vのウシ血清アルブミン溶液でブロッキングした後、細胞を、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）結合ファロイジンでインキュベートする。細胞の免疫蛍光画像は、蛍光灯を使用して得たものです顕微鏡と加圧と制御細胞に対する神経突起の長さはImageJのソフトウェア（NIH）を用いて定量化されています。 </li><li>神経突起は軸索や樹状突起として識別することができます。軸索や樹状突起の形態学的変化を評価するために、実験は上述の各構造を検出する抗体を用いて繰り返すことができ、すなわち、樹状突起のための軸索と微小管結合タンパク質（MAP2）抗体のニューロフィラメント（NF）の抗体。 </li><li>微小管は神経細胞の主要な細胞骨格成分の一つであり、微小管への損傷は神経損傷のマーカーとして使用されてきました。2微小管は、β-チューブリン抗体を用いた免疫蛍光可視化することができる。細胞は、後加圧の0〜24時間後に固定されたβ-チューブリン抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察しています。 </li><li>神経細胞とアポトーシス遺伝子発現に対する衝動的な加圧の効果を評価するために、全RNAは加圧され、コントロール細胞から抽出されます。ジェン電子式は、私たちのパブリッシュしたプロトコルと同様の定量的RT-PCRまたはリアルタイムRT-PCRを行うことにより調べることができます。3 </li></ol> 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：圧力プロファイルの例としては、加圧室内のセルに適用される。 Kolskyバー装置は正常に約0.7ミリ秒の期間で2MPaのレベルは、単一パルス型衝動的な加圧を生成します。 <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：衝動的な加圧に神経細胞応答の例。 SH-SY5Y細胞は、チャンバコントロール細胞と比較して2メガパスカルショー異なる神経突起/軸索内訳を衝動的な加圧にさらされる。 6。困難とその解決策<ol><li>チャンバーシールは克服すべき主要な障害の1つである。それはFOですOリング付きワイドディスクは暴利行為と増加摩擦の問題を持っていることウント。摩擦の影響を除去するだけでなく、ガウジング、テフロン配管工のテープでピストンテーピングの簡単な方法を防ぐために使用されます。これは、問題を解決し、所望の圧力レベルと継続時間を生成します。 </li><li>加圧された神経細胞の挙動、二次TBIのメカニズムや長期的な影響を評価する場合は特に、長いポストインキュベーション時間後に検討されるべきである。 Kolskyバーに移動させながら、細胞含有チャンバーは、加圧、および細胞培養フードに戻って移動する、潜在的にunsterile条件にさらされている。アセンブリ内の/分解細胞培養フード内側の細胞培養スライドとチャンバーのチャンバー部分と適切な動作のプリ殺菌により、長期的なポストインキュベーションは、最大数週間することが可能です。 </li><li>データの再現性は、細胞の機械的刺激実験の重要なパラメータである。我々のデバイス、reproducibilit用神経細胞応答のyは、所望の衝動的な加圧プロファイルは、圧力レベルと期間の両方で、繰り返し取得する方法を決定します。我々は、各加圧のために得られた圧力分布を記録しているので、不要な圧力プロファイルから細胞応答データは、後で手動で除外することができます。 </li><li>分解チャンバアセンブリ、Kolskyバーに転送してマウントし、加圧、転送バック、チャンバを含む全体の加圧ステップは、未満、10分かかる。隣の細胞培養スライドが前圧の直後に加圧することができる。このように、加圧実験の十分な数を効率的に完了することができます。私たちのセットアップは直径18mmのカバーガラスを採用しています。一加圧実験は西側が（また、加圧された細胞の一部が死んでいるのが理由の一つです）基板サイズによるイムノブロッティングのために十分なタンパク質を提供していません。約3繰り返し加圧実験はimmunoblに必要なタンパク質の量を提供otting。繰り返しになりますが、再現性は圧力プロファイルとするたびにチェックされます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

in vitroでの実験技術の多くは、TBIの条件で、脳細胞の損傷を研究するために試みられてきた。これらは、それは短期間の過圧がTBIのための支配的な物理的な要因であると仮定してきた4,5流れ誘起せん断応力、体重低下、スタイラス裂傷、レーザー切断、砕石等、ストレッチニューロン/アストロサイトが含まれます。特に6,7 、TBIの爆風の衝撃波は、ミリ秒オーダーのパルス持続時間を持っています4は、この前提と観察に基づき、一時的な加圧が可能なバロメーター室をTBIの条件下で脳細胞の挙動を評価するために開発され、使用されています。例えば、流体パーカッション気圧外傷室0.5MPaで20〜30ミリ長く持続し、最大のピーク圧力との圧力パルスでTBIの下でヒトのグリア細胞の挙動を調べるために使用されていました。6最近 、VandeVordら7使用される金属星状細胞を調べるためのボール打撃バロメーター室TBIのが、金属ボール打撃産複数の圧力パルスの下で行動。そこで本研究では、単一パルス型衝動的な加圧を生成する新規な細胞の加圧装置を開発しました。デバイスは、私たちの8と他の研究における材料試験装置として使われてきましたKolskyバーセットアップに基づいて開発されました。非常に高負荷率で1,9 Kolskyバーの材料試験能力ができるように変更されました加圧室（図1）内の培養細胞への単一パルス型の過圧を適用します。我々は、正常に衝動的な過圧の大きさと持続時間を制御することができた。代表的な細胞応答として、我々は加圧されていないチャンバーコントロール細胞と比較して、2 MPaの圧力SH-SY5Y神経細胞で有意な神経突起と軸索消失を表示することが実証された。 結論として、我々は特別に設計されたKolskyを用いた新規な衝動的な細胞の加圧装置を開発バー装置とはTBI条件における神経細胞の応答の調査に、その潜在的な利用を実証しました。我々はまた、この技術は、細胞の任意のタイプは様々なレベルと期間で衝動的な圧力にさらされることができるという点で非常に汎用性があることに注意してください。したがって、デバイスは、細胞を傷つけるためだけでなく、積極的にその機能と運命決定において細胞を刺激するためだけではなく、衝動的な圧力誘起細胞のメカノトランスダクションの振る舞い​​を調査するために使用することができます。

<ul><li> SH-SY5Y（ATCC、CRL-2266）は、ヒト神経芽腫細胞</li><li> 18ミリメートル直径のガラスカバースリップ</li><li>細胞培養培地：DMEM、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン</li><li>誘導ニューロン新生のためのレチノイン酸（10μM） </li><li> Kolskyバー衝動的な加圧装置</li><li>ピストンシリンダーセル加圧室</li><li>ピストンに細胞培養カバーグラスを固定するためのステンレス製ビス</li><li>セルチャンバーとKolskyバー間のインタフェース用グリース</li><li>加圧に細胞応答を評価するための一般的な分子生物学用品（固定剤、抗体、蛍光色素は、PCR消耗品など） </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

小説衝動的なセルの加圧実験は爆発誘発性外傷性脳損傷（TBI）を調査するためにKolskyバーのデバイスを使用して開発されました。我々は、爆風TBI関連の衝動的な加圧はin vitroで神経細胞にどのように適用されるかこのビデオの記事で実証している。これは、記録されたセルの加圧室内に完全な圧力履歴と、専門Kolskyバー装置によって作成された十分に制御された圧力パルスを用いることにより達成される。加圧された神経細胞は加圧後直ちに検査、またはさらなる神経突起/軸索伸長、ニューロンの遺伝子発現、アポトーシスなどに衝動的な加圧の長期的な影響を調べるためにインキュベートされる私たちは、約2 MPaでその衝動的な加圧を観察した別個の神経突起の損失の相対を誘導加圧されていない細胞に。我々の技術は十分に制御されたPRで、脳細胞の衝動的な加圧を介して、TBIの爆発物の分子/細胞メカニズムを調査するための新規な方法を提供する大きさと持続時間をessure。

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Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

小説衝動的なセルの加圧実験は爆発誘発外傷性脳損傷の分子/細胞のメカニズムを調べるためにKolskyバーのデバイスを使用して開発されました。

外傷性脳損傷の研究のための神経細胞のインパルス加

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K ビュー.  University of Nebraska-Lincoln. 小説衝動的なセルの加圧実験は爆発誘発外傷性脳損傷の分子/細胞のメカニズムを調べるためにKolskyバーのデバイスを使用して開発されました。

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

生物工学

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

パワードスーツを使用して歩行する脊髄損傷者のトレーニング

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

組織工学的応用の制御可能な形態の三次元 Poly(ε-caprolactone) 足場のエレクトロスピニング記述を溶かす

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

対話型、患者固有のモデルを用いた脳深部刺激療法の神経繊維の管を対象と

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

ヒアルロン酸を用いた神経膠芽腫患者由来細胞の 3次元培養ヒドロゲル

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...