原稿の編集と議論をしてくれたモーガン・プセニカと、図のフォーマットを支援してくれたグラハム・キッド博士に感謝します。この作業は、NIAID K22 AI125466(JLW)によってサポートされました。

注:すべての動物実験は、クリーブランドクリニックラーナー研究所の施設動物管理および使用委員会によって承認および承認されました。
1.解剖用の培地と消耗品を準備します
メモ: すべてのバッファおよびメディアレシピを 表 1 に示します。この手順は、組織培養で指定されたバイオセーフティキャビネット内で無菌条件下で行われます。
<ol><li>混合グリア培地(MGM)を調製し、滅菌濾過する。これは前日に行い、4°Cで保存することができます。</li>
	<li>フィブロネクチンを滅菌H2Oで1:100の濃度で希釈する。希釈されたフィブロネクチンの量は、実験に使用された子犬の数とCNS領域によって異なります。1つの皮質に1つのT25フラスコ、2〜4小脳に1つのT25フラスコ、2〜4の脳幹に1つのT25フラスコ、2〜4の脊髄に1つのT25フラスコを使用します。 注:上記の基準を使用して同じ領域の組織を組み合わせると、以下に説明するプロトコルを変更することなく、適切な解離が可能になります。ステップ1.2に記載したよりも多くの組織を組み合わせるには、解離試薬濃度のさらなる最適化が必要になります。</li>
	<li>希釈したフィブロネクチン3 mLを室温でT25フラスコにピペットで入れ、2分間放置します。</li>
	<li>フィブロネクチンを吸引し、フラスコの蓋を緩めた状態でフラスコを一晩乾燥させます。</li>
</ol>2.皮質、小脳、脳幹、脊髄解離
注:この手順はベンチトップで行うことができ、解剖スコープが必要です。手順のすべてのステップに厳格な無菌技術を使用し、室内の空気への組織の暴露を最小限に抑えます。解剖中はすべての培地を氷上で冷やして、組織を最大限に保存してください。あるいは、この手順は、内部解剖スコープの使用を可能にするフード内で行うことができます。
<ol><li>70%エタノールですべての領域を拭きます。</li>
	<li>10 mLのPBS/抗生物質溶液(PAS)を10 cmのペトリ皿にピペットで入れます。解剖する子犬ごとに1つのペトリ皿を準備します。溶液を冷やしておくために氷の上に置きます。</li>
	<li>消毒した組織培養フードで、9 mLのDMEM(添加物なし)を4本の別々の15 mLコニカルチューブ(CNS領域ごとに1本ずつ)にピペットし、チューブキャップを交換し、氷上に置きます。解剖スコープから届く距離内にチューブ付きのアイスバケツを置きます。</li>
	<li>ステップ2.2で調製した10cmのシャーレを消毒した解剖スコープステージに置く。</li>
	<li>施設のプロトコルに従ってマウスの子犬を麻酔して安楽死させ、鋭いハサミで迅速に斬首して頭を取り除きます。 注:出生後(P)3〜5匹の子犬が使用されます。年配の子犬はより発達したCNSを持っており、グリア細胞を拡大する適切な供給源ではない可能性があります。若い子犬(P)0-2は、より多くのグリアを産出する可能性があり、使用することができます。しかし、脊髄組織は、サイズのためにこの若い年齢で解剖することは非常に困難です。</li>
	<li>70%エタノールを使用して子犬の皮膚をきれいにします。</li>
	<li>細かいハサミを使用して、鼻に達するまで、尾側から始めて吻側を動かしながら、動物の頭の正中線に沿って皮膚層を切ります。組織の損傷を避けるために、頭蓋骨に深く切り込むことは避けてください。</li>
	<li>頭を下に傾け、皮膚層を頭蓋骨の両側に引き、スプリングハサミを使用して、頭蓋骨の正中線に沿って、大孔から始めて切開し、再び尾側から吻側に切断します。</li>
	<li>先端の細かい鉗子で、頭蓋骨の半分を左右に引っ張り、皮質、小脳、脳幹を露出させます。</li>
	<li>露出したら、脳を頭蓋骨からそっと持ち上げ、ステップ2.2で準備した10cmのペトリ皿に入れます。解剖学的構造を維持するために、後脳を取り付けた状態で、脳が損傷を受けていないことを確認してください。</li>
	<li>鉗子の先端を上に向けて、先端が湾曲した細かい鉗子を使用して、小脳をつまみます。髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLコニカルチューブに入れます。</li>
	<li>脳幹が小脳の直接腹側にあり、小脳の除去後に見えることを確認してください。先端の細かい鉗子でそれを取り除き、髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLのコニカルチューブに入れます。</li>
	<li>中脳を皮質から分離し、皮質髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLの円錐管に入れます。</li>
	<li>脊髄を取り外すには、切断されたマウスの子犬を仰臥位(上向きに横たわっている)に置き、切断された脊柱を研究者に向かって持ち上げます。</li>
	<li>70%エタノールを再度スプレーします。</li>
	<li>脊柱の外側に沿って、吻側から尾方向に、後肢に達するまで胸郭を通して切断します。切断しながら、脊柱が見えるまで内臓を押し戻します。</li>
	<li>脊柱の各側面に沿って分離されるまで切断し、ステップ2.2で準備した10cmのペトリ皿に入れます。</li>
	<li>腹側を上にして、細かいスプリングハサミを使用して、各椎骨の右側と左側を腰部に到達するまで交互に切断し、脊髄組織を露出させます。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下で、先端の細かい鉗子で脊髄と髄膜をそっと取り除きます。アイスバケット内の指定された15mLコニカルチューブに入れます。</li>
	<li>子犬ごとに手順2.5.〜2.19を繰り返し、同じ領域の組織を組み合わせて、準備されたT25フラスコごとに手順1.2で概説した基準に適合させます。 注意: 髄膜をできるだけ完全に取り除きます。かなりの量の髄膜が残っている場合、髄膜細胞の線維芽細胞様表現型が増殖し、細胞培養を圧倒します。特定の細胞培養物を生成するために、等しい表現型の複数の脊髄を組み合わせることができる。グリアポトーシスや表現型の差別化につながる可能性のある細胞の過密が起こらないように注意してください。</li>
</ol>3.組織解離
注:以下の手順はすべて、無菌技術と滅菌材料を使用して、滅菌組織培養で指定されたバイオセーフティキャビネットで実行されます。
<ol><li>0.53 mM EDTAを含む0.05%トリプシンを1 mL 9 mL DMEMおよび組織の各15 mLコニカルチューブに追加して、組織溶解を開始します。 注:DMEMには、トリプシンの阻害剤として機能する可能性のある塩化カルシウムが大量に含まれています。概説された手順に従って解離が完了しない場合は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクスバランス塩溶液を使用できます。トリプシン処理後、トリプシン阻害剤を添加することで酵素を中和できますが、カルシウムは後続のステップで使用されるDNase Iの補因子であるため、溶液に戻す必要があります。</li>
	<li>10 mLピペットで約20倍に粉砕します。</li>
	<li>細胞懸濁液を空の50 mLコニカルチューブに移します。</li>
	<li>この溶液を37°C、5%CO2 で15分間インキュベートし、8分後にライセートを穏やかに撹拌する。</li>
	<li>5 mLのMGMと200 μL(5 mg/mL)のDNase Iを各チューブに加え、最終濃度は50 μg/mLになります。</li>
	<li>各ライセートを10 mLピペットで10倍粉砕します。</li>
	<li>細胞懸濁液を室温で3分間放置して、解離していない組織がチューブの底に定着できるようにします。</li>
	<li>細胞懸濁液を新しい50 mLコニカルチューブに移し、解離していない組織を残します。 注:上記の溶解および粉砕ステップは、解離していない組織の量を大幅に制限します。</li>
	<li>チューブを300 x g で4°Cで3分間、ブレーキなしで遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、残りの細胞ペレットを5 mLのMGMに再懸濁します。</li>
	<li>ペレットを5 mLピペットで20倍に粉砕します。</li>
	<li>5 mL 細胞懸濁液をコーティングされた T25 フラスコにプレートします。</li>
	<li>細胞を37°C、5%CO2 でインキュベートし、24時間後に最初に培地を交換して細胞破片を除去します。 メモ: 一部のプロトコルでは、72 時間後に最初のメディア交換を推奨しています。このステップの最適化が必要になる場合があります。</li>
	<li>細胞が80%コンフルエントになるまで、MGMで48〜72時間ごとに100%の培地交換を実行します(約5〜7日)。 メモ: メディアを交換する前に、すべてのメディアを 37 °C に温める必要があります。</li>
</ol>4. ミクログリアの分離
<ol><li>混合グリア培養が80%のコンフルエントに達したら、蓋を締め、パラフィンフィルムで密封して振とう用のフラスコを準備します。</li>
	<li>混合グリア培養物からミクログリアを除去するには、フラスコを37°Cのインキュベーター内のオービタルシェーカーに水平に固定します。フラスコを15 x g で1時間振とうします。</li>
	<li>培地とピペットを取り出し、15 mLのコニカルチューブに入れます。フラスコを3 mLの温かいMGMで2回すすぎ、15 mLのコニカルチューブに洗浄を加えます。これらはミクログリアです。</li>
	<li>5 mLの温かく新鮮なMGMを培養フラスコに加えます。</li>
	<li>フラスコをパラフィンフィルムで再密封し、フラスコをシェーカーで水平に固定し、15 x g で37°Cで15時間振とうして、アストロサイトからOPCを分離します。 注:この手順は一晩で実行できますが、過剰な時間は細胞死を引き起こす可能性があるため、15時間の振とう時間が重要です。</li>
	<li>ステップ4.3の上清を遠心分離する。300 x g で3分間、標準プロトコル16 に従ってミクログリアを培養するか、生物学的アッセイに使用します。</li>
</ol>5. 希突起膠細胞前駆細胞単離
注意: 最初の分離後にOPCをメッキする場合は、ポリDリジンコーティングされた表面(滅菌プレートまたはカバースリップ)にメッキする必要があります。このセクションを完了する前に、これらの資料を準備してください。
<ol><li>15時間振とうした後、フラスコから上清を取り除き、滅菌済みの100 mmペトリ皿にプレートします。</li>
	<li>上清を37°C、5%CO2 で30分間インキュベートし、15分後に旋回させて残りのミクログリアを除去します。非組織培養処理ペトリ皿をこの工程に用いてもよい。</li>
	<li>非接着性細胞上清を除去し、カウントし、ポリD-リジンコーティングされた表面上のプレートにします。通常、7,500〜10,000個のOPCがメッキ/ cm2です。</li>
	<li>37°C、5%CO2 で少なくとも1時間(最大6時間)インキュベートし、95%の培地を穏やかに吸引し、温かいOPC培地をゆっくりと加え、培地をウェルの壁にピペッティングしてOPCの破壊を最小限に抑えます。細胞が使用可能になるまで、48時間ごとに培地を交換してください。 注: 一度に 1 つのウェルのみを交換することが重要です。OPCは敏感であり、特に乾燥条件に耐性がありません。OPC培地へのPDGF-AAの添加は、希突起膠細胞へのOPC成熟を遅らせることである。この因子は、実験の焦点が成熟希突起膠細胞である場合、培地から除外され得る。</li>
</ol>6.アストロサイトの分離
<ol><li>15時間振とうした後、上清を取り除き、フラスコを温かい1x PBSで2回すすぎます。</li>
	<li>0.53 mM EDTAを含む0.05%トリプシン4 mLを加え、37°C、5%CO2 で5分間、または細胞が持ち上げられるまでインキュベートします。星状細胞が浮き上がったことを確認するには、標準の広視野顕微鏡を使用して星状細胞を視覚化します。アストロサイトは、トリプシン処理後に球状に見えます。</li>
	<li>アストロサイトが剥離したら、フラスコを垂直に立て、4 mL MGMを加えます。粉砕して混ぜる。</li>
	<li>アストロサイトを15 mLのコニカルチューブにピペットで入れ、300 x g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>ステップ1.2の説明に従って、アストロサイト培地およびプレートをフィブロネクチンコーティング表面に再懸濁します。または生物学的アッセイに使用します。 注:20 ng/mLのマウス線維芽細胞増殖因子は、最初の培地交換時に添加して、星状細胞培養の確立に役立てることができます。さらに、標準的なゼラチンコーティングは、フィブロネクチンの低コストの代替品であり得る。</li>
</ol>7. 免疫細胞化学を用いたミクログリア、OPC、アストロサイト、成熟希突起膠細胞の同定と単離
<ol><li>播種した細胞が適切なコンフルエントに達したら、培地を静かに取り除き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して接着細胞を10分間固定します。バイオセーフティキャビネットでこのステップを実行します。 注:溶液を吸引または追加するときは、細胞の剥離を防ぐために穏やかな圧力でピペットで留めてください。</li>
	<li>PFAをゆっくりと吸引し、細胞を1x PBSで3回5分間洗浄します。</li>
	<li>1x PBSで10%血清と0.1%Triton X-100を使用して適切なブロッキング溶液を調製します。 注:血清源は、二次抗体が産生された宿主動物を反映しています。例えば、二次抗体がヤギ抗ウサギである場合、適切なブロッキング血清は正常ヤギ血清である。同様に、二次抗体がロバ抗ウサギである場合、ブロッキング血清は正常なロバ血清でなければなりません。</li>
	<li>細胞が完全に覆われるまでブロッキング溶液を追加します。室温で1時間ブロックします。</li>
	<li>抗体希釈液(1x PBSの9 mL、ウシ血清アルブミン0.01 g、Triton X-10030 μL)を準備します。あるいは、抗体は、ステップ6.3に記載されるブロッキング溶液中で希釈することができる。</li>
	<li>以下に特異的な一次抗体を抗体希釈液またはブロッキング溶液で希釈する:<ol><li>ミクログリア:イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)を1:250希釈(2.4 μg/mL)。</li>
		<li>OPC:神経/グリア抗原2(NG2)を1:200希釈(5 μg/mL)。</li>
		<li>成熟希突起膠細胞:1:400希釈のミエリン塩基性タンパク質(MBP)(濃度はロットに依存し、最適化が必要な場合があります)。</li>
		<li>アストロサイト:グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)を1:400希釈(0.25 μg/mL)17。 注:同じ種で育てられた一次抗体を混合しないでください。 注:GFAPは白質星状細胞を確実に標識します。灰白質星状細胞の場合、代替マーカーを使用する必要がある場合があります。</li>
	</ol></li>
	<li>一次抗体を4°Cで一晩インキュベートします(穏やかな攪拌が好ましい)。</li>
	<li>1x PBSで3回5分間洗浄し、一次抗体を除去します。</li>
	<li>適切な二次抗体を含む細胞を、抗体希釈液または光から保護されたブロッキング溶液中で1:400に希釈してインキュベートします。 注:二次抗体は蛍光色素に結合しており、利用可能な顕微鏡パラメータに応じて交換できます。蛍光二次抗体を塗布したら、できるだけ光から保護してください。</li>
	<li>二次抗体を室温で1時間インキュベートし、光への曝露を制限します。</li>
	<li>1x PBSで5分間3回洗浄して、余分な二次抗体を除去します。</li>
	<li>核を標識するには、1:1,000 DAPI/PBS溶液を使用し、暗所で室温で5分間細胞をインキュベートします。</li>
	<li>暗闇の中で3x PBSで5分間5x洗浄します。</li>
	<li>マウントするには、封入剤を塗布し、暗所で乾かしてからイメージングします。 注意: マウントされたスライドは、室温で2〜3日間保存できます。長期保存の場合は、スライドを4°Cに移動します。 最大の信号を得るために1週間以内に画像。すべての代表的な画像は共焦点顕微鏡で画像化されています。ただし、倒立蛍光顕微鏡も推奨されます。</li>
</ol>

<ol>
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著者は開示すべき利益相反を持っています。

このプロトコルでは、マウスCNSからの3つの主要なグリア細胞亜集団(ミクログリア、OPC、およびアストロサイト)の単離について説明します。神経変性および神経炎症性CNS疾患の調査における大きな後退は、一次ヒト細胞および組織、特に局所的で同じ患者由来のものの欠如である。ほとんどの場合、ヒトCNS細胞株は形質転換された不死化癌細胞に由来し、正常な生理学的挙動を正確に表していない可能性があります20、21、22。したがって、制御された方法でCNS細胞表現型を研究するには、代替方法が必要である。さらに、神経学的グリア細胞集団の多様性は、細胞の自律機能と非自律機能の両方を再現するために、互いに独立して、また共培養条件で各サブタイプを調べる必要があります。グリア細胞は、神経細胞サポート23、学習/認知24,25、およびCNS免疫学的応答26に至るまで、CNSにおいて多種多様な重要な機能を有する。そのため、各グリア亜集団の分子および細胞機能を生理学的および病理学的文脈で理解する必要があります。そのために、生存可能なグリアサブタイプの抽出と単離のための信頼できる方法をここに提供します。ヒト被験者の研究における実用的および倫理的制約のために、動物モデルは現在、ヒトグリア細胞生物学にとって最も関連性の高い代用物です。特に、マウスは、ゲノムを操作および分析して、健康と病気の根底にある特定の分子メカニズムをさらに解剖できるため、理想的なモデル動物です。したがって、マウスミクログリア、OPC、および星状細胞の除去と分離の成功は、生理学的、神経変性、または神経炎症状態におけるグリアの機能を調べるための重要なツールです。
このプロトコルは、CNS細胞の局所的不均一性を探索するように最適化することができる。グリアは形態と機能において地域的な不均一性を示すことがますます明らかになりつつある。アストロサイトは地域的に多様であり、CNS27内の位置に応じて異なる形態を示します。さらに、アストロサイトの密度とその有糸分裂指数は解剖学的領域を定義することができ、局所的なアストロサイトの不均一性はCNS28内の位置に基づく分子的および機能的違いを反映している可能性があるという仮説を支持しています。ミクログリアの局所的不均一性も活発に研究されていますが、CNSの発生または行動におけるミクログリアの多様性の根底にあるメカニズムと機能的影響は現在不明です。しかし、成体のミクログリアは、細胞数、細胞および細胞内構造、および分子シグネチャに多様性を示すことが知られています29。さらに、マルチプレックスマスサイトメトリーの最近の進歩は、ミクログリアの局所的不均一性をさらに定義し、9人のヒトドナーの5つの異なるCNS領域からの細胞表現型を分析し、ヒトミクログリアの大規模なイムノフェノタイピングを可能にしました30。現在、そのようなアプローチは初期段階にあり、動物実験はCNS疾患の発症における局所グリアの研究のための実行可能な解決策となっています。最後に、希突起膠細胞においても最近、局所的な不均一性が記載されている。幼若および成体CNSの10領域からの5072個の個別細胞に対する単一細胞RNAシーケンシングにより、分化の異なる段階にわたる13の異なる亜集団が同定された31。重要なことに、希突起膠細胞がOPCから成熟するにつれて、それらの転写プロファイルが分岐し、それらの機能的表現型が変化し、CNS31内の希突起膠細胞の不均一性を強調することもわかりました。
したがって、多様な隣接ニューロンおよび他のグリアの状況における様々な常在CNS細胞の局所的不均一性を理解することは、神経炎症性および神経変性疾患を治療するための新しい治療法の将来の開発のための重要な理論的根拠を提供するかもしれない。このプロトコルは、グリア亜集団の抽出、分離、および同定に焦点を当てていますが、それらの機能を調べるための便利な出発点を提供します。さらに、グリア細胞生物学に関連する遺伝的メカニズムを研究するために、トランスジェニックマウスモデルに適合させて組み合わせることができます。また、共培養アッセイにおけるグリア細胞の相互に対する応答を調べるためにも使用できます。概説されたステップは、さまざまなCNSグリア集団を抽出および分離するコスト効率の高いハイスループットの方法を表しており、さまざまな実験パラメーターに適合させることができます。注意する必要があります。しかしながら、本明細書に記載の方法は、髄鞘形成のレベルが低く、増殖グリアの密度が高いために新生児を利用する。これらの理由から、成体動物と比較して、新生児から生存グリアを単離することは技術的により実現可能である。したがって、成人グリアと比較した新生児グリアの表現型の違いは、実験デザインおよびデータ解釈中に考慮する必要があります。

グリアは、中枢神経系における適切な神経機能に必要です。それらは、星状細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアの3つの主要な亜集団で構成されており、それぞれが異なるが不可欠な役割を持っています1。適切なグリア細胞の多様性と活動がなければ、神経機能は深刻な影響を受け、中枢神経系障害につながります。グリアは神経伝達に影響を与えることができ、各細胞型は独自の方法で影響を及ぼします。脳内のグリア細胞は、適切なCNS機能を促進するために、神経細胞と同様にそれらの間で通信する能力を持っています2。希突起膠細胞は、ミエリン鞘の形成を通じて電気伝達の速度を増加させ、ニューロン活動電位生成3の部位であるランビエのノードでのイオンチャネルのクラスタリングを促進します。ミクログリアは、シナプス伝達を監視し、損傷後のニューロン接続を「再配線」することにより、シナプスの剪定に重要です4。さらに、ミクログリアはCNSの最も豊富な常在免疫細胞であり、病原体に対する宿主防御の主要な形態として作用する5。アストロサイトは、細胞外カリウム6の濃度を修飾することにより、ニューロン間のシナプス伝達を調節することができる。また、局所的な血流7の制御、神経調節要素の放出と取り込み8、血液脳関門の維持9にも重要な役割を果たしています。したがって、各グリアサブタイプはCNS機能にとって重要であり、あらゆるタイプの欠陥は、精神疾患、てんかん、および神経変性状態を含む多種多様な病理学的状態に長い間関連してきた10。
CNS病理生物学の研究における最大の障害は、微小環境ニッチの文脈でヒト細胞を調査できないことです。ヒト生検組織は死後に最も多く採取され、細胞は抽出および処理中に容易に損傷または失われる可能性があります。さらに、腫瘍から不死化細胞株を誘導することなく、ヒト細胞をin vitroで長期間生き続け、生存させることは課題であり、その時点でそれらはもはやそれらの正常な生理学的特性を正確に反映しなくなる11,12。さらに、個々のグリア細胞タイプ間にはかなりの量の局所的な不均一性があり13、14、15、個々の患者から局所CNSサンプルを取得することはほぼ不可能です。そのため、特定のCNS障害における局所グリアの寄与を研究するための代替モデルを開発する必要があります。
ここでは、成熟希突起膠細胞を生じさせるミクログリア、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)、および星状細胞の操作と定量を可能にする、複数のグリア亜集団のマウスCNS領域特異的分離を使用したin vitroシステムについて説明します。各集団を個別に分離し、実験の必要性に応じて、薬物または分子処理、免疫細胞化学、タンパク質/RNA抽出および分析、およびその他の共培養システムを含むさまざまな実験技術にかけることができます。さらに、この単離技術は高い細胞数をもたらし、ハイスループットな方法で各グリア集団の特性評価と調査を可能にします。また、in vivo設定に通常存在する交絡因子を回避するために、制御された方法で多種多様な微小環境刺激に応答するCNS細胞の分化、成長、および増殖の研究を可能にします。最後に、この細胞単離技術は、異なるCNS領域内のグリア細胞集団の操作を容易にし、局所グリアが互いにどのように相互作用し、さまざまな刺激に応答するかを調査し、精度と再現性を可能にします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 180</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Standard reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, 25 cm2 cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690 175</td>
			<td>Cell culture (T25) flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement 50X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td>Confocal for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine stitch Scissors</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>64-3260</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21434</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20530081</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PMG8044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05-20UG</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine PDGF-AA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-17</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Blocking solution component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-272</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td>
			<td>Corning Biocoatt</td>
			<td>354086</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5320</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-myelin basic protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Tip Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-104</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Microscope for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>66-7644</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Cell permabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10109878001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

ここで提示された方法は、グリア亜集団の分離のためにマウス新生児から中枢神経系(CNS)の4つの異なる領域を解剖するための実験室手順を示しています。この手順の目的は、ミクログリア、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)、およびアストロサイトを皮質、小脳、脳幹、および脊髄組織から解離させて、さらなるin vitro分析を容易にすることです。CNS領域単離手順により、複数の細胞培養システムにおけるグリア間の局所的な不均一性を決定できます。迅速なCNS領域の単離が行われ、続いて髄膜の機械的除去が行われ、グリアの髄膜細胞汚染が防止されます。このプロトコルは、細胞の完全性と接着性を維持するように設計された特定のマトリックス上での穏やかな組織解離とメッキを組み合わせたものです。複数のCNS領域から混合グリアを分離することで、個々の実験動物を最大限に活用しながら、潜在的に不均一なグリアの包括的な分析が可能になります。さらに、局所組織の解離に続いて、混合グリアはさらにミクログリア、OPC、およびアストロサイトを含む複数の細胞タイプに分割され、単一細胞タイプ、細胞培養プレートインサート、または共培養システムのいずれかで使用されます。全体として、実証された技術は、マウス新生児からの4つの個々のCNS領域の注意深い解剖のための幅広い適用性の包括的なプロトコルを提供し、任意の数のin vitro細胞培養システムまたはアッセイにおける局所的な不均一性を調べるための3つの個々のグリア細胞タイプの単離方法を含みます。

以下に示す代表的なデータは、IFNγシグナル伝達がOPCの分化と成熟に影響を与えることを示しています。IFNγ受容体(IFNγR)が存在しないと、皮質OPCは成熟髄鞘形成希突起膠細胞に容易に分化せず、MBP染色がないことからも明らかです(図1)。希突起膠細胞とアストロサイトは共通の前駆細胞に由来するため、アストロサイトを標識するGFAP発現を解析しました。我々は、IFNγR欠損細胞がGFAPを強く発現していることを発見し、それらが星状細胞表現型を採用している可能性があることを示唆しており、以前の報告を裏付けています19。
CNS細胞の局所的な不均一性に関するさらなる証拠は、皮質、小脳、脳幹、および脊髄からの星状細胞に見られるように、星状細胞の形態が異なることによって証明されています(図2)。注目すべきことに、同じ領域の星状細胞も形態学的不均一性を示す可能性があり、このグリアサブタイプが非常に動的であるという考えを支持しています。細胞構造の違いは機能の多様性を示唆しているため、微小環境刺激の不在下および存在下での表現型応答を研究するには、グリア集団を分離する能力が必要です。
希突起膠細胞は、ニューロン軸索の髄鞘形成に不可欠であり、適切なCNS修復および機能に必要である。OPCは成熟した対応物を生み出し、分化能力の背後にある生物学を理解することが重要になります。サイトカインシグナル伝達は、幹細胞と免疫細胞の挙動に大きく影響します。したがって、OPCの局所応答がサイトカイン刺激の違いによってどのように変化するかを理解することが重要であり(図3)、成熟髄鞘形成希突起膠細胞への分化能力に影響を与える可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> 図1:外因性IFNγの存在下でのWTおよびIFNγR-/- マウスにおけるOPC分化を示す代表的なデータ。皮質OPCは、上記に概説した手順に従って、( A )WTおよび (B) IFNγR-/- P4マウスの子犬から単離されました。細胞を1 ng/mL IFNγで48時間処理した後、固定および染色して細胞分化を描写しました。OPCは、星状細胞表現型を採用しているものを同定するために、NG2およびGFAPについて標識された。同様に、OPCはNG2およびMBPについても標識され、成熟希突起膠細胞に分化しているものを同定した。スケールバー= 20μM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> 図2:アストロサイトの形態における地域的な不均一性を示す代表的なデータ。 皮質、小脳、脳幹、および脊髄からの星状細胞を、上記のプロトコルを使用してP4マウスの子犬から単離し、培養48時間後に免疫細胞化学によってGFAP(緑色)を標識しました。スケールバー= 20μM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> 図3:サイトカインに対する地域OPCの異なる応答を示す代表的なデータ。 OPCは、上記のプロトコルを使用して、P4マウスの子犬の脳幹および脊髄から分離されました。細胞を、有髄希突起膠細胞に分化する局所OPCの能力に対するサイトカインの異なる影響を調べるために、(A)IFNγまたは(B)インターロイキン(IL)-17の濃度 ( 1〜10 ng / mL ) で処理されました。特定のサイトカインで48時間インキュベートした後、OPCを固定し、NG2(緑)とMBP(赤)について標識しました。スケールバー= 20μM。データはSEM±平均を表す。 **, p < 0.01;, p < 0.001;, p < 0.0001 2-way ANOVAによる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS /抗生物質溶液(PAS):</td>
		</tr><tr><td>1.0ミリリットル</td>
			<td colspan="2">10,000単位/mLのペニシリンおよび10,000 mg/mLのストレプトマイシンを含む100X抗生物質/抗真菌剤</td>
		</tr><tr><td>25ミリグラム/ミリリットル</td>
			<td colspan="2">アムホテリシンB</td>
		</tr><tr><td>99ミリリットル</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">ミックスグリアメディア(MGM)</td>
		</tr><tr><td>88ミリリットル</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (高グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸Na含有)</td>
		</tr><tr><td>10ミリリットル</td>
			<td colspan="2">熱不活性化FBS</td>
		</tr><tr><td>1.0ミリリットル</td>
			<td colspan="2">L-グルタミン (100X)</td>
		</tr><tr><td>1.0ミリリットル</td>
			<td colspan="2">抗生物質/抗真菌薬</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPC培地 (50mL)</td>
		</tr><tr><td>49ミリリットル</td>
			<td colspan="2">神経基礎培地</td>
		</tr><tr><td>1.0ミリリットル</td>
			<td colspan="2">B27サプリメント(50X)</td>
		</tr><tr><td>10 ng/ml</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">注: PDGF-AA は、各メディア交換の前に新しく追加されます。</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">アストロサイト培地 (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764ミリリットル</td>
			<td colspan="2">グルタミンを含むアール塩を用いたMEM</td>
		</tr><tr><td>36ミリリットル</td>
			<td colspan="2">グルコース(20 mMの最終濃縮には100 mg/mLストックを使用)</td>
		</tr><tr><td>100ミリリットル</td>
			<td colspan="2">熱不活性化FBS</td>
		</tr><tr><td>100ミリリットル</td>
			<td colspan="2">熱不活性化馬血清</td>
		</tr><tr><td>10ミリリットル</td>
			<td colspan="2">グルタミン(ストック培地に含まれていない場合は200 mMストックを使用)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">オプション:10 ng/mL組換えマウス上皮成長因子</td>
		</tr><tr><td colspan="3">注意: すべての培地を滅菌ろ過し、使用するまで4°Cで保管してください。</td>
		</tr></tbody></table>表 1: バッファーとメディアのレシピ。

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Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

ここでは、マウスCNSからの複数のグリア細胞集団のin vitro単離のためのプロトコルを提示します。この方法では、局所ミクログリア、希突起膠細胞前駆細胞、およびアストロサイトの分離を可能にし、さまざまな培養システムにおけるそれぞれの表現型を研究することができます。

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

dissection-isolation-murine-glia-from-multiple-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.1K ビュー.  Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. ここでは、マウスCNSからの複数のグリア細胞集団のin vitro単離のためのプロトコルを提示します。この方法では、局所ミクログリア、希突起膠細胞前駆細胞、およびアストロサイトの分離を可能にし、さまざまな培養システムにおけるそれぞれの表現型を研究することができます。

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Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

神経科学

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...