この作品は、オーストラリア研究評議会連盟ディスカバリープロジェクト助成金#1096623によって資金提供されました。

1. 再結合ベクトルの作成
<ol><li>N-またはC末端に対象のウイルス遺伝子を標識するために必要な相同性の150bpの長い横置き領域(左右の腕と呼ばれる)を特定する( 図1b参照)。</li>
	<li>選択した一対の制限部位によって分離された150bp左右の腕を含むオリゴヌクレオチド配列を設計する。この全体のシーケンスは、合成された後にTDSベクターに組み込むことを可能にするために、(最初のペアとは異なる)第2の制限部位のペアによって横たわらなければならない。配列が所望の挿入部位とフレーム内にあるという制限部位を有するオリゴヌクレオチドを設計する際には注意してください。</li>
	<li>合成用オリゴヌクレオチドを設計する際には、左右の腕の間に制限部位を組み込み、選択した蛍光タグの開いた読み取りフレームに隣接するものと一致する必要がある( 図1b参照)。NotI制限部位を、左腕と蛍光タグの開始との間の3つのアミノ酸リンカーとして使用することができる。</li>
	<li>PCRによって蛍光タグの両側にこれら同じ制限部位を組み込む( 図1cを参照)。</li>
	<li>合成したフラグメントを TDS ベクターに複製します。</li>
	<li>ホモロジーの左右の腕領域の間の制限部位を使用して、得られた再結合ベクターに蛍光タグをクローン化する( 図1dを参照)。</li>
</ol>2. 組換えウイルス生成
<ol><li>図2に従って、多重感染性(MOI)>1で、血清フリー培地中のバクシニアウイルスを有するBS-C-1細胞の単層に感染する。</li>
	<li>1時間の感染後、Dulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)を有するレスキュー細胞と、無血清培地中の3:1の比での組換えベクタープラスミドおよびトランスフェクション試薬の混合物を用いたトランスフェクト。</li>
	<li>24時間後、牛胎児血清(FBS)を含んでいないDMEMの細胞を掻き取り、回収し、開いた細胞を破壊してウイルス粒子を放出するために3回の凍結融解サイクルを行う。</li>
	<li>10% FBS DMEMおよびGPT選択試薬ミコフェノール酸(25 μg/ml)とキサンチン(250 μg/ml)の液体オーバーレイで、次のようにプラークアッセイを実行します。<ol>
<li>6ウェルプレートにBS-C-1細胞の単層をシードします。</li>
		<li>ウイルス粒子を含む凍結解凍細胞の連続希釈液を100%コンフルエント細胞単層に感染させることで、個々のプラークの適切な分離を確実にする。</li>
		<li>GPT選択試薬を含むDMEMを含む液体10%FBSとのオーバーレイ - ミコフェノール酸とキサンチンは、それぞれ25 μg/mlと250 μg/mlの最終濃度で。</li>
	</ol></li>
	<li>24時間のインキュベーションの後、液体のオーバーレイを取り除き、蛍光顕微鏡を使用して、TDSベクターからウイルスへのmCherryの組み込みに対応する拡散赤色蛍光を示すプラークを探します。標的遺伝子および選択した蛍光タグに応じて、タグ付き遺伝子の局在した蛍光も同じ赤色プラークで観察され得る。</li>
	<li>各組換えウイルスに対して、ピペットチップを使用した局所的な擦り傷と、DMEMを含む5%FBSの100 μlの100 μlを選んで細胞をエッペンドルフチューブに移し、続いて3ラウンドの掻き取り細胞を凍結解凍して組換えウイルスを放出する。</li>
	<li>凍結解凍ウイルスを含むDMEMを12ウェルプレートの細胞の単層に加え、増殖培地中のGPT選択試薬で組換えウイルスを増幅する。感染後24時間の増幅に成功した。</li>
	<li>赤い蛍光を示すプラークの正常に増幅されたプラークのプラークアッセイを実行し、今度はアガロースオーバーレイとGPT選択を行い、次のように行います。<ol>
<li>6ウェルプレートにBS-C-1細胞の単層をシードします。</li>
		<li>組換えウイルスの連続希釈を行い、FBSフリーDMEMで増加するウイルスの希釈にウェルに感染します。</li>
		<li>感染後1時間、液体培地を取り除き、2.5%FBS、292 μg/ml L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含む最小必須培地(MEM)で0.5%アガロースを重ねたGPT選択試薬を重ねた。</li>
	</ol></li>
	<li>感染後2〜3日、選択した蛍光タグの赤色と色の両方が再び増幅される蛍光を示すプラークをピックし、今回はGPT選択なし。</li>
	<li>選択なしのアガロースオーバーレイで次のプラークアッセイを実行します。</li>
	<li>拡散赤蛍光を失ったが、選択したタグに対応する局所的な蛍光を保持しているプラークを選んでください。</li>
	<li>選択なしでプラークの精製を続けると 、mCherry および gpt 選択遺伝子を失ったが、選択されたタグに対応する局所的な蛍光を保持する組換えウイルスの純粋なストックを得る。チェック株はプラークアッセイによって純粋であり、すべてのプラークは同様のプラーク表現型を有するべきである。</li>
	<li>ゲノムDNAのPCRスクリーニングを使用して、ウイルスストックが純粋であることを確認します。<ol>
<li>蛍光遺伝子挿入部位に隣接するプライマーと、挿入された蛍光遺伝子自体を増幅するプライマーを設計する。これらのプライマーの異なる組み合わせは、遺伝子挿入を検出し、純度を示すPCRアンプリコンを生成します。</li>
		<li>ウイルス株を増幅して、PCRを1つのウェルでスクリーニングし、BS-C-1細胞の12ウェルプレート単層をスクリーニングする。</li>
		<li>感染後24時間、感染した細胞をDMEMの250 μlに擦り込む。</li>
		<li>遠心分離機感染細胞(18,000 x g 10分間、4°C)、上清を除去し、500 μl TE(10 mM Tris-HClおよび1 mM EDTA、pH 8)で細胞ペレットを0.1%(v/v)SDSで再懸濁します。細胞をライスするボルテックス。</li>
		<li>500 μl フェノール-クロロホルム-イソアミルアコホールを加え、インバートを混ぜます。遠心分離機(18,000 x g 4分、4°C)。上清を取り、繰り返します。</li>
		<li>1ml100%エタノール(チルド)と50μl酢酸ナトリウムを加えて上清にエタノール沈殿を行い、インバートを混合する。</li>
		<li>-20 °Cで一晩、または-80°Cで1時間放置します。遠心分離機(30分間18,000 x g、4°C)、すべての液体を取り除き、沈殿したDNAを空気乾燥させます。50 μl TE で再中断します。</li>
		<li>これをゲノムDNA PCRスクリーニングのテンプレートとして使用します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 複数のタグを持つ組換えウイルスの生成
<ol><li>同じ細胞単層を蛍光組換えウイルスと共感染させて、ダブルまたはトリプル標識ウイルスを作成するか、プロトコル1)から繰り返し手順を別のタグで作成します。</li>
	<li>プラーク表現型またはPCRスクリーニングに基づいてウイルスを精製するウイルス分離ゲノムDNA。</li>
</ol>

<ol>
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利益相反は宣言されていません。

この技術は、蛍光タグ付きウイルスタンパク質を発現する組換えウイルスを作成するための効率的かつモジュール的なプロトコルを記述する。この方法は、ウイルスゲノムへの唯一の変化がタグまたはマーカーの追加であることを保証し、選択マーカーを残さない。相同組換えに必要な短い腕の長さは、その直接合成を可能にし、数回の時間のかかるPCRとクローニングを排除し、mCherryおよび代謝GPT選択の蛍光を使用してウイルス組換え中間体を分離します。これらの中間体は、選択の除去に続いて、タグ付き遺伝子を有するウイルスに対して、または親のタイプに戻って解決することができる。蛍光性と代謝選択の両方の使用を含む同様の方法は、以前に説明された27 の、この研究で使用される方法は、相同性の短い、合成された領域を利用し、目的のタグ付き遺伝子の蛍光を画像化することによって所望の組換えウイルスの同定を可能にする。この二次選択は、プラークアッセイで十分な蛍光を生成する高発現ウイルス遺伝子のタグ付けにのみ適用可能である。あるいは、強力なウイルスプロモーターの下での蛍光タンパク質など、完全発現カセットの挿入を想定することができる。この場合、左右の腕は、タグ付けされるウイルス遺伝子ではなく、挿入点を定義するであろう。
実験手順の間に役立ついくつかの重要なステップがあります。上記のステップ2.3.3の液体オーバーレイは、赤/緑色蛍光プラークの検出と分離にとって極めて重要であることが判明した。GPT選択試薬とアガロースオーバーレイの組み合わせは、組換えウイルスの増殖を抑止し、トランスフェクション後のウイルスを増幅する第一歩のために液体オーバーレイに切り替えたと考えています。また、濃縮および精製のために局所的なタグ色蛍光を示す蛍光プラークを選ぶことも重要であり、左腕の組換えから生じる中間体は、左腕にもプロモーター配列が含まれている場合にプラークに観察される拡散蛍光をもたらす可能性があるためである。TDSベクター中のmCherryマーカー遺伝子は、例えば蛍光タグとしてmCherryを容易に取り込み、選択できるようにするためにgfpに置き換えてもよい。
上記のいくつかの技術は、組換えワクシニアウイルスを作成する確立された方法からわずかに異なります.例えば、組換え剤を作るために用いられるウイルスのMOIは通常128未満であるが、この方法によって組換え性ワクシニアウイルスを作り出すためには、より高いMOIの使用が十分であった。GPT選択試薬の使用は通常、選択試薬18を用いて細胞の前入れを必要とするが、救助段階の感染後に細胞を加えることは、特に蛍光選択マーカーの存在のために、依然として所望の組換え物の十分な選択を提供した。
前述のように、この技術の限界の1つは、二次蛍光選択ステップが、関心のあるタグ付きタンパク質が高発現されていることに依存し、プラークアッセイにおいて目で検出できるレベルにある点である。これがなければ 、mCherry 蛍光のみを示すウイルスを精製することができ、そのうち少なくとも50%は所望の組換えウイルスを含み、上記のステップ2.12で説明したPCRのような分子戦略によって同定することができる。別の制限は、タグ付けの結果として特定のタンパク質の不活性化である可能性があります。.蛍光タグは、経時の経大化を伴う組換えウイルスによって突然変異を受けたり、切除されたりする。そのため、顕微鏡法やPCRによる組換えウイルスストックの定期サンプリングが推奨されます。最後に、単一のウイルスに組み込むことができる蛍光タグ付きタンパク質の数に制限があるかもしれません。この 1 つの側面は、それらをすべて同時に視覚化する機能です。利用可能な蛍光タグの発光スペクトルの重複する性質を考えると、最小限のスペクトルブリードスルーを確実にするためにそれらを慎重に選択することが重要です。さらに、GFPやセルリアンなどの密接に関連するタグを使用すると、組み換えゲノム内の位置に応じて、両者の間に再結合の可能性が開かれます。
この技術のモジュール性は他の染色および/またはタグの選択との互換性に基づいて蛍光タグの簡単な置換を可能にする。選択マーカーを切除することにより、TDS法は、様々な蛍光タンパク質の連続付加、またはTDSベースのタグ付けと、フェロチ法によるTDSベースの遺伝子欠失の組み合わせを可能にする29。このアプローチの有用性の一例として、ウイルスコアとWV膜に標識する二重タグ付き蛍光ウイルスが生成された。このウイルスによるイメージング研究は、ウイルス複製中のウイルスの動き、形態形成およびラッピングを研究するために使用することができる。まだ特徴のないワクシニアウイルスタンパク質として、この技術によってタグ付けおよび研究することもできる。
ワクシニアウイルスは、生細胞顕微鏡に好ましいウイルスの多くの特性のためにイメージング研究で広く使用されています。蛍光タグはウイルスゲノムから発現し、トランスフェクションの必要性を排除し、感染動物または非トランスフェクター細胞に由来する一次細胞を容易に分析することを可能にする。当初、蛍光VVはウイルス運動30の単純な細胞内追跡に使用されたが、より最近のアプローチはFRET研究31、単一ウイルス粒子32でのFRAP、プロモーターレポーター33、生体内イメージング34、および構造研究35-37を含むようにその有用性を拡大している。これらの技術はすべて、組換え蛍光ウイルスを作成するこの方法と相まって、より簡単で近い範囲内にある可能性があります。

ワクシニアウイルス(VACV)は原型ポックスウイルスであり、天然痘の原因物質であるバリオラウイルスとの関連性が高い。これらのウイルスはいずれも、サルモンポックスやエクトロメリアウイルス(マウスポックス)1などの他の注目すべき病原体を含む正射体属のメンバーである。オルソポックスウイルスは、200以上の予測オープンリーディングフレーム2,3をコードする大きな二本鎖DNAゲノム(180〜220kb)を有する。これらのウイルスの複製は、成熟したウイルス(MV)がなされる核周辺ウイルス工場の形成と、MVのサブセットがラップされたウイルス(WV)を生成するために2つの追加膜を獲得するトランスゴルジネットワーク(ロバーツとスミス4によってレビューされた)を含む。オルソポックスゲノムは、VACVゲノム複製の特徴である遺伝子組換えの高度に起因する遺伝子操作に対して非常に適しており、ウイルスDNAポリメラーゼ5によって媒介される。組換えウイルスの生成は、ホマロジーが12bp以下の相似性の相似組換えおよび線形DNA分子に依存し、ワクシニアウイルス感染細胞6の再結合を媒介するのに十分である。ワクシニアウイルスの蛍光標識は、オルソポックス粒子の大きなサイズのために非常に明るいウイルス粒子を生じることができ、これはビリオン7あたり多くの蛍光タンパク質の組み込みを可能にする。ワクシニアは、外来DNA8の大きな断片を運ぶ能力を有し、さらに、硬質キャプシド対称性の欠如は、それらの内因性遺伝子9からウイルスタンパク質遺伝子融合を発現する際の柔軟性の程度を可能にし得る。VACVタンパク質の蛍光タグ付けは、細胞内レベルでの宿主と病原体相互作用の研究に非常に有用であることが証明されており、特にウイルス侵入10の分野において、輸送11〜13、および形態形成、特に包まれたビリオン7の。
組換えウイルスは、減衰成長表現型14,15、代謝選択16-18、またはマーカー遺伝子の発現(例えばX-gal19または蛍光タンパク質13,20)の救助によって選択することができる。ここでは、蛍光性と代謝性の選択の強力な組み合わせを用いた蛍光ウイルスの選択について説明する。フォークナーとモス(1990)21によって開発された過渡的な支配的選択(TDS)ベクターは、目的の望ましい蛍光タグ付き遺伝子と一緒にマーカーを統合することを可能にする。代謝選択が除去されると、選択遺伝子を切除する二次的な組換え事象が起こり得るが、蛍光タグ付きウイルスタンパク質はそのまま残る。下図2は、実験手順の概要を示す。本研究で利用される選択遺伝子は、mCherryおよび大腸菌グアニンホスホリルトランスビセラーゼ(gpt)遺伝子であり、いずれも合成早期/後期ウイルスプロモーターから発現し、Cordeiroららが以前に使用した。22加えて、対象とするタグ付き融合タンパク質の蛍光がある。代謝選択が除去されると、選択可能なマーカー(mCherryおよびgpt)が切除され、タグ付き遺伝子の蛍光のみが残り、正しい組換えウイルスの同定が可能になる。選択マーカーの切除は、複数の蛍光タグを組み合わせる可能性を提供し、複数のウイルスタンパク質を同時に蛍光標識する能力を持つウイルスを作成することを可能にします。これまでの研究では、ワクシニアウイルス感染細胞にトランスフェクトされた直線的および円形DNA分子のワクシニア再結合に関する最小限の相同性要件を決定した。我々は、ワクシニアウイルスゲノムへの組み込みを通じて、gpt-mCherry TDSベクターにおける横向きの腕の様々な相同性の長さの再結合効率を決定したかった。TDSベクター中の100bpの相同領域は、相同組換えによって組換えDNAをVACVゲノムに標的化し、媒介するのに十分であると判断した(図4)。より小さな相同性の長さはまた、組み換えを可能にするが、100 bp相同性の長さは、代謝および蛍光選択で容易に識別できる十分な組換えウイルスを提供した。このサイズのDNA断片は、比較的低コストで商業的に合成することができ、組換えウイルスの作成のための複数のベクターの産生を大いに促進する。我々は、隣接する領域のオリゴヌクレオチド配列の合成のコストを抑えながら、より大きな再結合頻度を提供するために、相同性の長さを150 bpに増やすことを選んだ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

ウイルスタンパク質に蛍光タンパク質をタグ付けすることは、ウイルスと宿主の相互作用に関する理解を深める上で不可欠なアプローチであることが証明されています。天然痘の根絶に用いられる生ワクチンであるワクシニアウイルス(VACV)は、その大きなビリオンサイズとゲノムレベルでの操作が容易なため、蛍光生細胞顕微鏡に特に適度である。我々は、組換えウイルスを生成するための最適化されたプロトコルをここに報告する。ワクシニア複製時の標的相同組換えの最小要件を決定し、構築物生成の簡素化を可能にした。これにより、蛍光レポーターと代謝選択との一過性支配的選択(TDS)のアライアンスが可能になり、蛍光的に標識されたウイルスタンパク質に対する迅速かつモジュール的なアプローチが可能になりました。蛍光組換えウイルスの生成を合理化することにより、ウイルス複製中に発生するウイルス・宿主相互作用の多くの側面の高度なイメージング解析などの下流アプリケーションを容易にすることができる。

図 1は、この手順に必要なさまざまな構成体を示しています。 図2は、選択プロセスの各ステップに対して描かれたA3-GFP組換式VACVの代表的な蛍光プラーク画像を用いた実験手順の概要を示している。図3において、内部ウイルスコア23および外包24の一部であるウイルス構造タンパク質A3およびF13を標的とする蛍光マーカーでタグ付けされたタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスが、それぞれ示されている。作成された組換えウイルスのそれぞれについて、ウイルスプラークおよび感染細胞の観察が描かれている。VACVゲノムとの相同組換えの効率は、それに対する相同性の70bp領域を低く含み、試験を行い、その結果を図4に示した。100 bp相同性を含むベクターとの組み換えから作られたウイルスプラークを同定する相対的な成功は、標的遺伝子に150 bpの長さの左右の腕の相同性を合成することを選択した背後にある推論であった。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> 図 1.過渡的選択(TDS)の組換えベクトル。() gptとmCherry選択マーカーを持つ TDS ベクター。(b) ホモロジーの左右の腕は、間に、そして相同性の腕を横たわる特定の制限部位で設計されています。この方法で使用される左右の腕の間の制限部位はNotIとBamHIであり、NotIサイトは遺伝子と蛍光タグとの間のリンカーとしても使用されている。(c)この方法と互換性のある蛍光タグは、対応する制限部位によって横になっている。使用されるいくつかのタグは、GFP(緑色蛍光タンパク質)、RFP(赤色蛍光タンパク質)、セルリアン(ECFP、シアン蛍光タンパク質、サイト指向変異誘発25による改善)およびmini-SOG、およびミニSOG、照明26上のEMによって解決可能な製品を作成するGFPから作り出す蛍光タンパク質である。(d) 最終 TDS 組換えベクトルの生成に関与するクローニング手順。左右の横側の腕を含む合成オリゴヌクレオチドは、まずTDSベクターにクローン化される。これは、左右の腕の間に組み込まれた制限部位にクローニングすることによって、選択した任意のタグを往復できる組み換えベクトルを提供する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> 図 2.組換えワクシニアウイルスを作り出す実験手順の概要遺伝的および細胞レベルで起こる事象は、A3-GFP標識蛍光ワクシニアウイルスの作成後のステップを概説する代表的なプラーク画像と共に描かれている。(A)ワクシニアウイルスに感染した細胞は、TDSの組換えベクターにトランスフェクトされる。(B)この図では、左手組換えの結果のみが描かれて、例では選択した蛍光タグとしてGFPを使用しています。右手の組み換えは、TDSプラスミド全体が同様の方法でゲノムに組み込まれることになるが、タグが中間ステップ、すなわちステップCにおいて標的遺伝子全体に融合されることを除いて。プラークアッセイは、再結合ミックスを用いて細胞単層上で行われ、GPT選択を行う。(C)赤と緑の両方の蛍光を呈するプラークは、それぞれmCherryおよびGFP発現に対応し、摘み取られ、増幅される。選択が除去されると、gpt遺伝子とmCherry遺伝子(D)の喪失に対応する赤色蛍光の損失が生じ、緑色蛍光のみを呈するプラークが摘み取られ増幅される(E)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> 図 3.TDS組換えシステムの代表結果。画像は、48時間後に細胞に感染する組換えVACVの全プラーク(a,c,e;スケールバー100μm)を表し、8時間後に対応する組換えウイルスに感染した単一細胞の画像(b、d、f;スケールバー10μm)を伴う。 ウイルス粒子を可視化するために、ビリオンに局在するタンパク質に対応する遺伝子を選択した。A3は、ワクシニアビリオン(a、b)およびF13(c、d)のコアタンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質である。 蛍光標識A3とF13(e,f)の両方を有する二重タグ付きウイルスも示されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> 図 4.組換えベクターとVACVゲノムの組換え効率の定量的解析 BS-C-1単層は、VACVに感染し、500bp、100bp、または70bpのいずれかの相同性領域を含む3つの再結合ベクターを持つ1時間の再結合ベクターをVACVゲノムにトランスフェクトした。各ベクターには 、gpt および mCherry 選択遺伝子を含むTDSカセットも含まれていた。細胞を感染後24時間回収し、リセドして形成された組換えウイルスを放出した。プラークアッセイは、GPT選択培地を用いた細胞ライセートに対して行われ、mCherry蛍光を示すプラークは、正常な組換えとしてカウントされた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> 図 5.複数のクローニング部位を示す gpt-mCherry TDSベクトルの地図。 ベクターは、以前に説明されている22 とベクター マップは、EZ プラスミド マップ v1.9 の助けを借りて作成されました、 張研究室グループ (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。

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Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

一過性の支配的選択の方法を使用して蛍光タグ付きタンパク質を同時に発現する組換えワクシニアウイルスの生成のための迅速かつモジュール的なプロトコルがここに記載されている。

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K ビュー.  University of Sydney. 一過性の支配的選択の方法を使用して蛍光タグ付きタンパク質を同時に発現する組換えワクシニアウイルスの生成のための迅速かつモジュール的なプロトコルがここに記載されている。

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

運動誘発性リンパ球のアポトーシスの決定のための指先穿刺の採血方法

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...