このアプローチは、組換えワクチンの迅速な開発のために、他のウイルス抗原をHVTゲノムに導入する効率的な方法を提供する。この技術の利点は、GFP発現カセットが最初に挿入物に取り付けられ、簡単に視覚化され、次にCre-LoxPシステムによって除去される点です。同じアプローチは、HVTゲノムの異なる場所に、または多価組換えワクチンの開発のための他の鳥類ヘルペスウイルスにより多くのウイルス遺伝子を挿入するために使用することができる。
この手順のデモンストレーションは、セルソートの専門家であるケイティ・モファットです。ナ・タン、ヤオヤオ・ザン、広剛、私の研究室の科学者。トランスフェクションの前日は、テキストプロトコルに概説されているように、ひよこ胚線維芽細胞を準備します。
6つのウェルプレートの各ウェルに2.5ミリリットルの培地で130万個の細胞をシードします。CEF細胞を2つのCas9ガイドRNAプラスミドのそれぞれ0.5マイクログラムでトランスフェクトし、メーカーの指示に従って適切なトランスフェクション試薬を使用してドナープラスミドのマイクログラムを1マイクログラム入れ替えます。5%の二酸化炭素で38.5度の細胞を12時間インキュベートします。
トランスフェクション後12時間でM199培地でHVTウイルスストックを1ミリリットル当たり100,000プラーク形成単位の濃度まで希釈した。130マイクロリットルの希釈ウイルスをトランスフェクトされた細胞の各ウェルに加えます。非感染細胞の井戸を陰性コントロールとして設定し、同じ量のウイルスを追加します。
3日間の5%の二酸化炭素で38.5度の細胞をインキュベートします。ソートの前日には、各ウェルに20,000個の細胞を播種して2つの96ウェルプレートを準備します。感染後3日は、感染および感染したCefsを含む6つのウェルプレートを取り出す。
各ウェルから培地を吸引し、PBSで細胞シートをすすいだ。各ウェルに0.05%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを加え、約5分間5%の二酸化炭素で摂氏38.5度で細胞をインキュベートします。その後、FBSの50マイクロリットルで細胞を再懸濁し、この懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。
5分間の重力の200倍の遠心分離機。1%FBSを含むPBSの1ミリリットルの細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、細胞密度を1ミリリットル当たり100万個の細胞に調整します。
次に、ストレーナーキャップを通してポリスチレン選別チューブに細胞を移します。細胞ソーターを使用して、GFPを発現する単一細胞を、前播した96ウェルプレートに並べ替える。5日間5%の二酸化炭素で摂氏38.5度で選別された細胞でプレートをインキュベートします。
5日後、蛍光顕微鏡を使用して96のウェルプレートをチェックし、単一のGFP陽性プラークを含む井戸をマークします。トリプシン-EDTAの50マイクロリットルを3分間、各GFP陽性を十分にトリプシン化します。その後、50マイクロリットルの培養培地を加えて細胞を再懸濁し、この懸濁液をCefsを備えた6つのウェルプレートの1つのウェルに移します。
3日後、凍結培地中の組換えウイルスの第1世代の各バイアルを1つのバイアルを凍結した。これらの収穫されたウイルスを液体窒素に保管してください。ウイルスの第一世代のそれぞれから100,000細胞を収集します。
2,000rpmで細胞を5分間遠心し、上清を捨てる。DNA抽出を行う準備ができるまで、細胞を20°Cの負の20度で保存します。DNA抽出を行う準備ができたら、50マイクロリットルのスクシッシングバッファーを使用して細胞ペレットを解凍し、再懸濁します。
サンプルを摂氏65度で30分間、摂氏95度で2分間lyseしてプロテアーゼK.を不活性化し、テキストプロトコルに概説されているように、各DNAサンプルの1マイクロリットルを使用して3つの素因性接合プライマーでPCR反応を行います。2マイクロリットルの増幅産物をゲル電気泳動用の1%アガロースゲルの1ウェルにロードします。組換えウイルスからGFP遺伝子を除去するために、トランスフェクション試薬を用いて、CEF細胞を前もって6つのウェルプレートに2マイクロリットルのクレリコンビナーゼ発現プラスミドをトランスフェクトする。
トランスフェクション後12時間、液体窒素から組換えウイルスのバイアルを1バイアを解凍する。ウイルスを穏やかに再懸濁し、50マイクロリットルをトランスフェクションされた細胞の各ウェルに再懸濁し、同じ量のウイルスで1つの陰性対照を設定する。3日間摂氏38.5度でインキュベートします。
感染後72時間は、先に述べたように細胞を選別する準備をする。単一の非蛍光細胞を、CEFsを前にした96のウェルプレートに分類します。次に、選択したプラークをトリプシン化し、テキストプロトコルで概説されているように、対応するセルを再中断します。
細胞の半分を第2世代としてCefsで前播した96のウェルプレートの各ウェルに渡します。各クローンの残りの細胞を重力200倍で5分間遠心分離する。上清を捨て、DNA抽出のために50マイクロリットルのスクッシュングバッファーで細胞を再懸濁します。
次に、テキストプロトコルで概説されているように、1マイクロリットルのDNAテンプレートを用いて5つの素接合プライマーを用いてPCRを行う。PCRの結果に基づいて、さらなる通過および検証のために組換えHVTの3〜5個の陽性クローンを選択する。第一に、第2世代の組換えHVTを前播した24ウェルプレートにCefsに感染させる。
感染後48時間で培養培地を除去し、500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドをPBSに添加して細胞を固定する。室温で30分間インキュベートします。次に、固定剤を取り除き、PBSで細胞層を3回洗浄する。
PBSを取り除き、0.1%トリトンX-100の500マイクロリットルを加え、細胞を透過させます。15分後に細胞層をPBSで3回洗浄した。非特定のバインドをブロックするには、1 時間のブロッキング バッファーを追加します。
次いで、一次抗体抗体の抗体を希釈して抗体抗体をモノクローナル抗体HH7またはHVT感染鶏血清1〜200でブロッキング緩衝液で。希釈した一次抗体を200マイクロリットルずつ各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。細胞層をPBSで3回洗浄する。
二次抗体ヤギ抗マウスIgG Alexa 568またはヤギの抗鶏IgG Alexa 488をブロッキングバッファーで1~200で希釈します。希釈した二次抗体を200マイクロリットルずつ各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。次いで、細胞をPBSで3回洗浄する。
蛍光顕微鏡を使用して、タンパク質の発現を確認します。ウイルス拡張の前日に、各T25フラスコに260万個のCEF細胞が播種される。少なくとも3つの陽性クローンを解凍し、各フラスコに細胞またはウイルスのバイアルを1つ加える。
50%の細胞パシー効果が観察されるまで、5%の二酸化炭素で38.5度でフラスコをインキュベートする。次に、培養培地の2ミリリットルで細胞を収穫する。次世代のためにCEF細胞を前もって播種した新しいT25フラスコに50マイクロリットルを感染させる。
組換えウイルスを少なくとも15世代通過し続ける。PCRを使用して、VP2シーケンスの存在に対するウイルスの各生成を分析します。間接免疫蛍光アッセイを用いて、VP2発現の各生成ウイルスを分析する。
単一細胞選別後、得られた精製ウイルスを3つの素接合PCRにより分析し、予想されるサイズのPCR産物を示す。クレリコンビナーゼによるGFPレポーターの切除後、50%以上のプラークがGFP発現を失った。GFP切除後の精製プラークは、単一細胞選別により得られ、さらに、期待されるサイズの産物を示す5つの素因性接合PCRによって確認される。
次いで、VP2特異的モノクローナル抗体および抗HVT鶏血清による間接免疫蛍光アッセイによりタンパク質発現が確認されます。予想通り、親のHVTに感染した細胞は抗HVT血清によってのみ染色することができる。組換えHVT感染細胞は、VP2遺伝子の発現を明確に示す一方で。
組換えウイルスを生成するために高トランスフェクション率は、ウイルスと挿入物が同じセル内で会う可能性を最大限に高めるために行われる編集が行われる必要があります。この手順に従って動物実験を行い、組換えワクチンの免疫原性および有効性を評価することができる。ここで説明するCRISPR/Cas9システムプラットフォームを用いた新しい多価ベクターワクチンの開発は、家禽産業が複数の家禽疾患から保護するために非常に有益です。
