私たちは、最大効率や歩留まりのためのプロトコルを最適化する助けたロスラボの前にメンバーを承認したいと思います。

インフルエンザH3N2 VLPの生成1.哺乳動物発現系<ol><li>サブクローン例えば前述のpTR600のような真核生物発現ベクター内へのウイルス構造糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）のGag P55 7 </li><li>化学的にコンピテントな大腸菌（ 例えば 、DH5α）でDNAを増幅し当たり、製造業者の指示としてプラスミド精製キットを用いてトランスフェクショングレードのプラスミドを単離します。 DNAの量は、収率及びユーザのニーズに依存しています。 </li><li>加湿インキュベーター中5％CO 2で37℃で10％胎児ウシ血清（FBS）を含む増殖培地中で、哺乳動物細胞株、293Tを維持します。 </li><li> T-150組織培養フラスコは、フラスコには、次の日までに完全な細胞接着と百分の85から95までの細胞集密度を取得するように、フラスコ当たり45から75×10 6個の細胞を含むように細胞を増殖させます。希望conflu用顕微鏡下で細胞を検査ency。 注：高細胞密度は、典型的には、しかしながら過剰コンフルエント副産物細胞廃棄物の蓄積をもたらし、細胞生存率を減少させることができる商業的なトランスフェクション試薬を使用した場合、最小限の細胞毒性で最適なタンパク質の発現を得るために推奨されます。 </li><li>トランスフェクションの日に、製造業者の推奨に従ってリポソームとDNAの混合物を準備し、1のDNA組成物とDNA細胞をトランスフェクション：HAの2：1 NA：T-150フラスコあたり40μgの総DNA量とギャグ。各フラスコに20〜30 mlで全容積を含むように、抗生物質を含まない無血清トランスフェクション培地中でDNAとリポソーム溶液を希釈します。 注：遺伝子構築物の比率は、ユーザーの最適化を必要とし得ます。 1比：ここで実証されていないが、同様のトランスフェクション手順は、1で呼吸器合胞体ウイルス（RSV）FとHIV GAGと行われています。 DENVとCHIKV単一の発現プラスミドを、T-150フラスコあたりのDNAの20μgの合計に最適な電子のために使用されていますXPRESSION。 DNA：トランスフェクション試薬の比をユーザに最適化されています。使用はすなわち 、トランスフェクション法に基づくトランスフェクション培地を推奨、ポリカチオン性脂質トランスフェクションは、メディアが成長ホルモンを補充し、血清の非存在下での成長をサポートするために、微量元素することができるこのようにウシ胎児血清の減少または不在をお勧めします。 </li><li> 5％CO 2インキュベーターで37℃にフラスコを返します。 200ミリリットルの容量については、9 T-150フラスコを使用しています。細胞は、VLPの収穫日までトランスフェクション培地中で維持されています。 </li><li>収穫培養抗原に応じて72〜96時間後、トランスフェクション後の細胞からの上清、またはときに、顕微鏡検査によって推定されるように、細胞生存率は70〜80％に減少しました。転送50mlコニカルチューブに上清とは、細胞破片をペレット化し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。 注：付着細胞への新鮮予め温め、無血清トランスフェクション培地で3日間の上澄み液の交換はyielます類似またはわずかに低下し収率でVLPのダ第2のロットは、ユーザーが最適化されるべきです。 </li><li>超遠心分離を介して、沈降前に0.22μmの細孔膜を通じたプール上清およびフィルタ。 </li><li> 0.8％の七面鳥または哺乳動物の赤血球を使用して、標準的な血球凝集アッセイ14によるHA発現VLPの赤血球凝集活性を試験または抗原特異的ELISAを進めます。代表的な結果については、 図2を参照してください。 </li></ol>バキュロウイルス/昆虫細胞系を用いて2 CHIK VLP式<ol><li>商業バキュロウイルス発現系を用いて、S-27株からチクングニアウイルスのカプシドおよびエンベロープタンパク質（C-E3-E2-6K-E1）を発現する組換えバキュロウイルスを生成します。 </li><li> 28℃で100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを有する無血清Sf9細胞増殖培地中で培養スポドプテラ・フルギペルダ Sf9細胞。 suspens用スピナーフラスコ培養を開始するために3-5×10 5 C / mlで使用しイオンの細胞増殖。日常の通路彼らは2-4×10 6 C / mlの（3〜4日毎）の細胞密度に達します。 </li><li>スピナーフラスコ中の懸濁液中の培養Sf9細胞マルチスターラープレートシステム上で130rpmで撹拌しながら。適切な通気のために、スピナーフラスコの半分以下音量で培養容量を維持します。 </li><li> CHIK VLPの発現のために、1の感染多重度で組換えバキュロウイルスで、2×10 6細胞/ mlの密度で、Sf9細胞を感染し、28℃のインキュベーターに戻します。典型的には250mlのSf9細胞を含む1つまたは2つのスピナーフラスコを感染させます。 注：私たちは、このメソッドを使用していないが、Sf9細胞をシェーカープラットフォームを使用して28℃で振盪フラスコ中で培養することができます。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってトリパンブルー排除によって決定されるように細胞生存率が70〜80％に減少した72〜96時間の感染後、または後に収穫培養。 注：細胞は、感染しながら増殖し続けるとがあります3日、感染後に組換えCHIK VLPをバキュロウイルスに感染したSf9培養における〜80％の生存率（解像度）。バキュロウイルス感染細胞は、外観が大きくなっています。形態はまた、長楕円形をラウンドから変更されることがあります。バキュロウイルス感染の後期段階では、細胞が溶解し始めました。 </li><li>円錐管50ミリリットルに懸濁培養から直接文化を移し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>上清を収集し、超遠心分離を介して沈降する前に、0.22μmの細孔膜でろ過します。 </li></ol> VLP /のSVPの3沈降/精製<ol><li>バイオセーフティーフード内で70％エタノール、25ミリメートル×89ミリメートルオープントップの超遠心管を滅菌します。エタノールを使用する前にオフに乾燥していることを確認します。 </li><li>きれいなチューブに上清の32ミリリットルまでロードします。 25ミリリットルの最小容量は崩壊し、不十分満たされた超遠心管の損傷を防止することをお勧めします。 </li><li>慎重下敷き上清ウィットPBS中のH無菌3 mlの20％グリセロール（v / v）です。チューブがバランスしていることを確認してください。 </li><li> 4℃で4時間、135,000×gでスピン。 </li><li>ペレットがチューブから外れるません確実に上清を吸引し、。 </li><li>再懸濁を激しくピペッティングにより滅菌PBSでチューブの底にVLPのを沈降させました。 PBSの量は、VLPは、VLP総タンパク質収量と下流のアプリケーションに依存して再懸濁する必要がありました。一般的に、少なくとも100μlの各VLPペレットを再懸濁します。 </li><li>短期記憶および長期保存のために-80℃で貯蔵のためにストアサンプル4°C。 </li></ol> 4.タンパク質収率および特異抗原の収量を決定します<ol><li>製造業者のプロトコルに従って、このようなBCAアッセイなどの市販のタンパク質定量法を用いて、総タンパク質含有量を決定します。 </li><li>特定の抗原含量を評価するために、標準的な抗原及び2-5の連続希釈液を塗布して直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行います1; ELISA 96ウェル平底プレートへの総タンパク質試料のG。 <ol><li>プレート上の抗原の存在を探索し、マイクロプレートリーダーのための検出可能な吸光度を産生するために、従来のELISAの開発の基板を使用する抗原特異的な抗体を用いて、次のとおり。 VLPを、HAを発現するサンプルのHAおよびELISAアッセイの代表的な結果については、 図2を参照してください。 HAとNAの多くの組み合わせは、おそらくですが、収量はHA-NAの互換性15時に異なる場合があります。 注：抗原特異的抗体は、可変の親和性を持って、抗体の終点希釈滴定は、VLPの定量化を行う前に決定されることが推奨されます。市販の抗体は、濃度または希釈範囲ELISAで使用するための、ならびに提案したプロトコルを提案しているでしょう。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice.">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li><li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy.">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li><li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A/goose/Guangdong/1/96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+:+Morbidity+and+mortality+weekly+report.">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は成功し、様々な病原体のための複数の構造タンパク質で構成のSVPとのVLPを発現し、精製するために、上述の技術を使用しています。一般的に、我々は我々のVLPを生成するために、哺乳動物発現系を使用しています。しかし、私たちの手で、哺乳動物細胞は、CHIKのVLPの収量が低かった派生しました。組換えバキュロウイルス - 昆虫細胞系を使用する場合CHIKのVLP収率はより堅牢でした。?...

ウイルス様粒子（VLP）は、ヒトのワクチン接種のために承認された技術です。実際には、ヒトパピローマウイルス（HPV）を含む多くの現代的なライセンスワクチンの一部及び肝炎Β（HepΒ）ワクチンは、このアプローチを採用します。 VLPは自己集合することが可能な構造タンパク質から形成されます。組み立てられた粒子は、ウイルスの形態を模倣するが、彼らはウイルスゲノムを欠くので感染または複製することはできません。 VLPは、発現され、原核生物および真核生物系の数から精製することができます。 - 28％、酵母- 20％、植物- 9％、昆虫- 28％、および哺乳動物- 15％1細菌：文献のレビューは、異なった発現系は、以下のレートで使用されていることを明らかにしました。注目すべきは、L1カプシドタンパク質に基づくHPVワクチンは、酵母（ガーダシル）または昆虫細胞システム（サーバリックス）2で製造されます。 HepΒワクチン、RecombivaxとENGERIX-Βは、また、酵母で生産されており、HepΒ表面抗原3で構成されています、4。 我々は、アセンブリのための複数の構造タンパク質の同時発現を必要とするのVLPを産生する哺乳動物および昆虫細胞発現系を使用します。インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、デング熱ウイルス（DENV）、およびチクングニアウイルス（CHIKV）：私たちの仕事は、人間の病原体に対する設計、生産、および精製VLPに基づくワクチンに焦点を当てています。我々の方法は、複数の発現プラスミドからの複数の構造タンパク質、または単一の発現プラスミド（ 図1）の共発現を可能にするために十分に柔軟です。以前、我々は、製造および精製H5N1 VLPは、インフルエンザ赤血球凝集素（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、及びヒト胚性腎臓293T細胞におけるマトリックス（M1）5,6をコードするプラスミドとの共発現から組み立て。遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化さpTR600、transcを開始するためのサイトメガロウイルス初期プロモータープラスイントロンAを含む真核細胞発現ベクターにクローニングしました。真核生物の挿入と転写7の終結のためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのription。 HA、NA（ 図1A）および代替ウイルスマトリックスタンパク質、HIVのGag P55、の三プラスミドの同時発現を用いて同様のアプローチがこの研究にヒト季節性インフルエンザ亜型H3N2 VLPの生成に使用し、生成することが示されていますインフルエンザ粒子8と同様のサイズのVLPを。インフルエンザワクチンは、主に抗HA抗体を誘発するが、インフルエンザノイラミニダーゼの添加は、トランスフェクトされた細胞9も存在する追加の免疫原性標的から出芽VLPを可能にするためにシアリダーゼ活性を媒介します。 RSVのVLPを生成するために、我々はまた、先に説明し、電子顕微鏡6,10によって特徴付けられるように、さらに、HIVギャグを使用して、VLP形成の柔軟性を実証するために排他的にRSV表面糖タンパク質を提示原型ワクチンを設計するHIVのGagの無関係なコアを選択しました。他人以前それはRSV糖タンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）11、およびインフルエンザマトリックス12から種々のウイルス成分を用いて組み立てることができる提示するVLPを示しています。全長表面糖タンパク質配列は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を介して機能的受容体結合および抗体認識のアッセイのために必要とすることができる天然のコンホメーションを維持するために、この研究において使用しました。 粒子を生成するために単一のプラスミド発現系を使用するための私達の例としては、DENVおよびCHIKVあります。 DENVのケースでは、我々は、PRM / E構造遺伝子発現カセット13を含む単一プラスミドからの293T細胞における無カプシドとサブウイルス粒子（のSVP）を生成することができます。用語SVPは、ウイルス構造タンパク質のアセンブリにおいて、コアまたはカプシドタンパク質の欠如を示すために使用されます。 CHIK VLPはまた、カプシドおよびエンベロープタンパク質をコードする、またはIで、CHIKV構造遺伝子カセットを含む単一プラスミドを用いて製造することができます昆虫細胞発現（ - C 図1B）のために最適化された同じ構造遺伝子カセットをコードする組換えバキュロウイルスに感染させることによってnsect細胞。 上述の式アプローチの最終結果は、その後、20％のグリセロールクッションを介して超遠心によって精製することができる細胞培養培地中にVLPを放出します。本稿では、哺乳動物および昆虫細胞系からこれらのVLPを発現し、精製する方法を提示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:167px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12163</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DMEM</td>
			<td style="width:167px;">Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>L3000075</td>
			<td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyclear ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Seton</td>
			<td style="width:119px;">7025</td>
			<td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate citrate buffer</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">o-phenylenediamine dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.22 &#956;m vacuum filter top (500 mL)</td>
			<td style="width:167px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">H2SO4</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">339741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

ウイルス様粒子（VLP）およびサブウイルス粒子（のSVP）は、ライブ病原体の使用よりも増加した生物学的安全性と安定性の利点を提供するウイルスワクチン設計の代替的なアプローチです。非感染性および自己集合、VLPは、ライブの病原体または抗原の送達のための組換えウイルスベクターの必要性を迂回し、免疫原としての構造タンパク質を提示​​するために使用されます。この記事では、前臨床動物試験で将来のアプリケーションのためのVLPの設計と開発のさまざまな段階を示しています。抗原の選択、選択、VLPを/のSVPの精製、および抗原投与のための定量化の細胞株における抗原の発現：手順は、以下の段階を含んでいます。私たちは、抗原の発現のための両方の哺乳動物および昆虫細胞株の使用を実証し、方法論は収量が異なる方法を示しています。提示された方法論は、様々な病原体に適用することができるし、免疫原性STRで抗原を置換することによって達成することができます興味のあるユーザーの微生物のucturalタンパク質。 VLPおよびのSVPは最高のワクチン候補の抗原の特徴付けおよび選択を支援します。

VLPの収量は、ウイルス抗原構造物の設計によってばらつきがありました。このプロトコルでは、我々は、超遠心分離によって上清中のSVPまたはVLPの産生および精製のための昆虫および哺乳動物細胞を使用することを実証しました。 DENVのprM / E構造遺伝子発現カセットの4つのサブタイプは、 表1の（1-4として画定）DENVのSVPのバージョンを構築する0.6 mlの体...

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Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

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JoVE Journal

Biology

21.8K ビュー.  University of Georgia. ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。 

ビデオ: Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

要約

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