著者は、博士ケントシーリー、この機能を使用するための南フロリダ大学の創薬イノベーションセンター（CDDI）プロテオミクス基盤施設のディレクターに感謝します。この作品は、BHASにNIH / NIDCD助成R01 DC004295によってサポートされていました

倫理に関する声明国立衛生研究所のガイドラインの下で記載されたマウスの組織を用いた実験は、南フロリダ大学施設内動物管理使用委員会（プロトコル3931R、3482R）により承認された。 1。タンパク質抽出<ol><li> -80℃で16〜30日齢（P30）CBA / Jマウスとストアから蝸牛感覚上皮を分離</li><li>実験の日に、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）500μlで組織を洗浄する。千×gで3分間遠心し、上清を除去します。合計3回の洗浄のために繰り返します。 </li><li> 50mMのトリス-HCl、pH8.0、120mMのNaClを、50mMのNaFを、5mMのEDTA、500μg/ mlのAEBSF、10μg/ mlのロイペプチン、100μgのを/含有する溶解緩衝液100μlで、氷上で30秒間超音波処理した組織ソニックディスメン（;サーモフィッシャーモデル100）を使用してペプスタチンミリリットル、2μg/ mlのアプロチニン、および0.5μg/ mlのミクロシスチン。氷の上でクールな溶解液各超音波処理との間に1分間。 3Xの合計を超音波処理。 </li><li> 2分間、4℃で750×gでの抽出物を遠心分離し、新しいマイクロチューブに上清を除去します。氷上で30秒間超音波処理することによって、溶解緩衝液50μlにペレットを抽出します。 2分間、4℃で750×gでの抽出物を遠心分離する。 60分間、4℃で28,600×gで溶解物および遠心分離機の両方を兼ね備えています。新しいマイクロチューブに上清を除去し、ペレットに0.1％ASB-14を含む20μlの溶解バッファーを追加します。ボルテックスで1分間、4℃で60分間インキュベートする</li><li> 60分間4℃でクール、次いで、5分間、95℃で試料を加熱する。 10分間、25℃で16,000×gで遠心分離して従ってください。上清を回収し、新しいチューブに移す。 </li><li> 5分間、4℃で16,000×gで懸濁物を遠心分離し、消化のために、上清を保持します。 </li></ol> 2。 FASPを使用して全溶解液の二重トリプシンタンパク質消化<ol><li> 30μを追加4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む蝸牛のタンパク質抽出物（400μgの≤）リットルのアリコートを、100mMのトリス-HCl、pHが7.6および0.1 Mジチオスレイトール（DTT）を直接30Kスピンフィルター及び8200μlの混合トリス-HCl中のM尿素。 15分間14,000×gで遠心分離する。 </li><li> 15分間14,000×gで8 M尿素水溶液遠心200μLの濃縮物を希釈する。 </li><li> 1分間のフィルターと渦に集中する8 M尿素溶液中で10倍ヨードアセトアミド（IAA）の10を添加する。 10分間、14,000×gの遠心分離に続いて暗所で室温（RT）で20分間スピンフィルターをインキュベートする。 </li><li> 15分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に集中する8 M尿素溶液100μlを加える。このステップの2倍を繰り返します。 50 mM重炭酸アンモニウム（ABC）10分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に溶液100μlを加える。このステップの2倍を繰り返します。 </li><li> 1:100トリプシン0.4μgの/μLを追加します（w / w）の酵素へタンパク質比は、37℃で一晩（O / N）をインキュベートする</li><li>インキュベーションに続いて、10分間14,000×gで遠心分離器をフィルタするために50 mMのABC溶液40μlを加える。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li> 10分間14,000×gでスピンフィルターと遠心分離機に0.5MのNaCl溶液50μlを追加します。新鮮なマイクロチューブにトリプシンペプチドを含む濾液を転送し、消化を停止するために1.0％ギ酸（FA）で酸性化する。 </li><li> 8 M尿素40μlのフィルターユニットを洗浄し、次に40μlの18MΩ水で2回洗う。 </li><li> 50 mMのABC溶液100μlをフィルタユニット3回洗浄します。最後の洗浄は、1:100（w / w）の酵素対タンパク質比でトリプシン0.4μgの/μLを加え、37℃でO / Nインキュベートした後に</li><li>第10分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に50 mMのABC溶液40μlを添加することにより、消化物からのトリプシンペプチドを溶出させる。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li>に0.5MのNaCl溶液50μlを追加10分間14,000×gで、フィルタ部と遠心。新鮮なマイクロチューブにトリプシンペプチドを含む濾液を転送し、1.0％のFAで酸性化する。 </li><li>試料は、標準としてBSAを用いてマイクロプレート比色アッセイを用いて定量することができる。 </li></ol> 3。 FASPを使用して全溶解液のエンドプロテアーゼのLysCとトリプシンタンパク質消化<ol><li>直接30Kスピンフィルターに4％のSDS、100mMのトリス-HCl、pHが7.6および0.1M DTTを含む蝸牛タンパク質抽出物30μlのアリコート（400μgの≤）を追加し、トリス塩酸8 M尿素を200μlと混合。 15分間14,000×gで遠心分離する。 </li><li> 15分間14,000×gで8 M尿素水溶液遠心200μLの濃縮物を希釈する。 </li><li> 1分間のフィルターと渦に集中する8 M尿素溶液中で10倍IAAの10μlを加える。暗闇の中で室温で20分間スピンフィルターをインキュベートし、10分間14,000×gで遠心する。 </li><li> 8 M尿素ゾルの100μLを追加15分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に集中するution。このステップの2倍を繰り返します。 10分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に100 mMの、ABC溶液100μlを加える。このステップの2倍を繰り返します。 </li><li> 1時50分（w / w）の酵素対タンパク質比でエンドプロテアーゼのLysC0.1μgの/μLを加え、30℃でO / Nインキュベート</li><li>インキュベーションに続いて、10分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に100 mMの、ABC溶液40μlを加える。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li> 10分間14,000×gでスピンフィルターと遠心分離機に0.5MのNaCl溶液50μlを追加します。新鮮なマイクロチューブにするlysCペプチドを含むろ液を移し、消化を停止するために1.0％のFAで酸性化する。 </li><li> 8 M尿素40μlのフィルターユニットを洗浄し、次に40μlの18MΩ水で2回洗う。 </li><li> 50 mMのABC溶液100μlをフィルタユニット3回洗浄します。最後の洗浄の後1:100酵素·ツー·プロトリプシン0.4μgの/μLを追加テイン比と37​​℃でO / Nインキュベート</li><li> 10分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に50 mMのABC溶液40μlを添加することにより、トリプシンペプチドを溶出。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li> 10分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に0.5MのNaCl溶液50μlを追加します。新鮮なマイクロチューブにトリプシンペプチドを含む濾液を転送し、1.0％のFAで酸性化する。 </li><li>試料は、標準としてBSAを有するマイクロプレート比色アッセイを用いて定量することができる。 </li></ol> 4。スピンカラムを用いて脱塩ペプチド<ol><li> 1分間1100×gでアセトニトリル（ACN）と遠心分離機を500μlを加えることにより、C 18 MacroSpin欄をアクティブにします。遠心分離後、フロースルーを捨てる。 </li><li> 1分間1100×gで0.1％のFA遠心500μlでカラムを平衡化。フロースルーを捨て、このステップ1Xを繰り返します。 </li><li>ペプチドを500μlまで追加の列ANにダイジェスト1分間1100×gで遠心分離dは。サンプル量が500μL以上である場合は、この手順を繰り返します。 </li><li> 1分間1100×gで0.1％のFA遠心500μlでカラムを洗浄。フロースルーを捨てる。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li> 1分間1100×gで列遠心90:10 ACN対水の比率を250μlを加える。脱塩したペプチドを含む溶離液を収集し、新鮮なマイクロチューブに移す。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li>真空遠心分離機で脱塩ペプチド試料を乾燥させ、完全にサンプルの乾燥をさせることは避けてください。 </li></ol> 5。イオン交換クロマトグラフィー<ol><li>ペプチドを分離するために200×2.1ミリメートル、5ミクロンのSCXカラム（ポリスルホエチルA）に消化されたタンパク質試料の50〜100μgのを注入する。 </li><li>を250μl/分の流速で50分間にわたって2〜40％Bの勾配を使用する。溶媒Aは5 mMのギ酸アンモニウム、25％アセトニトリル中のpHが3.0と75％のddH 2 Oである。溶媒Bは、500 mMのギ酸アンモニウム、pHは25％ACNおよび75％のddH 2 O中に6.0 </li><li> 280nmでのペプチド画分を監視し、フラクションコレクターを使用して、2分間隔での画分を収集します。 </li><li>塩除去を支 ​​援するために、5％のFAを含むのddH 2 O中の50％アセトニトリル500μlの真空濃縮器および再懸濁の乾燥画分。 </li><li>ナノLC-MS/MS分析のために使用する準備まで-80℃でRedry画分と店舗。 </li></ol> 6。アセトン沈殿前にGELFrEE分離に蝸牛タンパク質上清を脱塩しなければなりません。アセトン沈殿、タンパク質を脱塩し、濃縮するために用いることができる。 <ol><li>蝸牛上清に氷冷アセトンの3ボリュームを追加します。優しくボルテックスし、-20°、CO / Nでインキュベート</li><li>遠心4℃で15分間15,000 xgでのサンプル混合物および上清を除去する。 </li><li> 4で5分間14,000×gで冷やしたアセトンと遠心分離機を用いたタンパク質ペレット3回洗う℃、 </li><li>ペレットを空気乾燥させ、18MΩの水を112μlに溶解する。 </li><li>マイクロプレート比色アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。 </li></ol> 7。蝸牛感覚上皮のGELFrEE分別<ol><li> 5×試料緩衝液30μlを追加し（0.25 Mトリス-HCl、pH6.8、10％（w / v）のSDS、50％グリセロール、0.5％（w / v）のブロモフェノールブルー）18MΩの112μlに懸濁し、脱塩したタンパク質に水。 </li><li>タンパク質ジスルフィド結合を還元するために95℃で5分間、1M DTTおよび熱の8μlを加える。加熱後、室温まで冷却可能にします。 </li><li>アノードリザーバーにランニングバッファーを8mlの、収集チャンバをサンプリングするためにランニング緩衝液を150μl、及びカソードリザーバーにランニング緩衝液を6mlを加える。 </li><li>ピペットを用いてサンプルローディングチャンバ内に流入した可能性のあるバッファを削除します。 </li><li>蝸牛タンパク質混合物の負荷150μL（≤1 mg）を、サンプルローディング室に8％Trのを使用して3.5から150 kDaの質量範囲を有するカートリッジアセテートである。 </li><li>実行を開始するために下部電極と近い楽器蓋。 </li><li>最初は陰極リザーバにランニング緩衝液2 mlを追加し、ファイル名を指定して実行を再開し、機器に時間を一時停止しました。 </li><li>計器上の各一時停止間隔で、ピペットを用いて、サンプル収集チャンバーからサンプルを収集し、新たにラベルされたマイクロチューブに加える。ランニング緩衝液150μlで収集チャンバ2Xを洗って捨てる。 </li><li>サンプル収集室に新鮮なランニングバッファーを150μlを追加し、ファイル名を指定して実行を再開します。を150μl/画分の総体積の2.6時間の時間をかけてタンパク質画分を集める。 </li></ol> 8。 GELFrEE分画の1Dゲル電気泳動 1Dゲル電気泳動は、従来の酵素消化およびMS分析にGELFrEE分画からの結果を可視化するために使用することができる。 GELFrEEタンパク質画分は、4〜15％トリス-HClゲル上で分離することができる。 </p&gt; <ol><li> （試料緩衝液中で350のDTT）サンプル希釈バッファー5μlの各GELFrEE画分の5μlのアリコートを混ぜる。 </li><li> 3分間95℃で試料を加熱する。 </li><li>室温に冷却サンプル。 </li><li>個々のゲルのレーン内GELFrEE分、最後の未使用レーンの分子量標準の負荷5μLの負荷10μL。 </li><li>色素の先端がゲルの底に到達するまで1.5時間、125Vでゲルを実行するか。 </li><li>慎重にゲルを除去し、タンパク質の分離を視覚化するために銀染色プラスで染色。 </li></ol> 9。 FASPを使用しGELFrEE画分のタンパク質消化修飾FASP手順はGELFrEE画分の界面活性剤の除去、消化のために使用される。 <ol><li> 8 Mトリス - 塩酸中の尿素および25分間14,000×gで遠心分離器を200μlと混合、直接30Kフィルタユニットに個々​​の部分を追加します。 </li><li>尿素溶液200μlで濃縮液を希釈そして12分、14,000×gで遠心分離します。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li>各フィルタ·ユニット、1分間ボルテックスに集中する尿素溶液中で10倍IAAの10μl加え、暗所で室温で30分間インキュベートする。 </li><li> 15分間14,000×gでフィルタユニットや遠心分離機に集中する尿素溶液100μlを加える。このステップの2倍を繰り返します。フィルタユニット10分間14,000 xgで遠心分離器に100 mMの、ABC溶液100μlを加える。このステップの2倍を繰り返します。 </li><li>フィルターユニット1:50（w / w）の酵素対タンパク質比のためのLysC0.1μgの/μLを加え、30℃でO / Nインキュベート</li><li>インキュベーションに続いて、10分間14,000×gでスピンフィルターと遠心分離機に100 mMの、ABC溶液40μlを加える。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li> 10分間14,000×gでスピンフィルターと遠心分離機に0.5MのNaCl溶液50μlを追加します。新鮮なマイクロチューブに各スピンフィルターからのlysCペプチドを含むろ液を移し、trifluoroacで酸性ポナルレスタット酢酸（TFA）。 </li><li> 40μlの18MΩ水で2回洗った後、8 M尿素40μlのスピンフィルターを洗ってください。 </li><li>スピンフィルターを50mMのABC溶液100μlで3回洗浄します。最後の洗浄の後1:100（w / w）の酵素対タンパク質比でトリプシン0.4μgの/μLを加え、37℃でO / Nインキュベート</li><li> 10分間14,000×gで50 mMのABCソリューションや遠心分離機の40μLを追加することにより、各フィルタユニットからトリプシンペプチドを溶出させる。このステップ1Xを繰り返します。 </li><li>フィルタユニット10分間14,000×gで遠心分離機に0.5MのNaCl溶液50μlを加える。新鮮なマイクロチューブに各フィルタ·ユニットからのトリプシンペプチドを含む濾液を転送し、TFAで酸性化する。 </li><li>真空濃縮器内のすべてのダイジェストを乾燥させます。 </li></ol> 10。 LC-MS/MS用サンプルの調製<ol><li>乾燥したのLysCおよびトリプシンペプチドを再構成すると、0.1％のFAと渦の20μlの画分を消化。 </li><li> 10 20,000×gで遠心分離サンプル分とは、新しいサンプルバイアルにサンプルの上部95％を削除します。 </li><li>塩および汚染物質を除去し、75ミクロン×10cmのC 18カラムクロマトグラフ分離を実行するためには100μmのX 25ミリメートルのサンプル·トラップ上に各々のペプチド画分の5μLを注入する。 </li><li> 200リットル/分の流量で100分かけて2〜40％Bの勾配を使用する。溶媒Aは95％のddH 2 Oおよび0.1％FAを含む5％のアセトニトリルである。溶媒Bは80％ACNおよび0.1％FAを含有する20％のddH 2 Oである。 </li><li>各MSは、高分解能質量分析計で走査するための10のタンデム質量スペクトルを収集する。 LTQオービトラップ質量分析計は、この実験で使用した。 </li></ol> 11。タンパク質同定<ol><li>フォワードおよびタンパク質配列と共通の汚染物質を逆の両方を含むUniProtのマウスデータベースを使用してタンパク質を同定する。 MASCOT検索エンジンとMaxQuantソフトウェアは、タンパク質データベースを検索するために使用される。 </li><li>使用可能な検索パラメータには、固定modificシステインのカルバミドメチルのATION、メチオニンの酸化の変数の変更は、タンパク質のN末端アセチル化、2の最大値は切断を逃した。識別のために考慮すべき最小のペプチドの長さが6アミノ酸である。 ±8 ppmおよび1.2 DA（質量誤差は、質量分析計を使用しているに依存します）のフラグメント質量許容のペプチド質量濃度誤差を入力してください。 </li><li> MaxQuantソフトウェアでは、ペプチドおよびタンパク質同定のために1％の偽発見率（FDR）を使用する。タンパク質同定は、一致したペプチドの数、パーセントタンパク質配列カバー率、およびペプチド配列でリストアップされている。 </li></ol>

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R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

著者らは、競合する利害を宣言していません。

<html>蝸牛感覚上皮からタンパク質同定を最大化するための鍵な手順は次のとおりです。消化、複数の分離技術の2）を使用し、高分解能質量分析計の3）利用のために複数のエンドプロテイナーゼの1）を使用します。複数の酵素の適用は、ペプチドの数を増加させ、タンパク質配列カバー率を向上させ、ひいては蝸牛組織から同定されたタンパク質の数を向上させることができる。トリプシン?...

プロテオミクスは、タンパク質の発現、機能、変更、および1の相互作用を解析することにより、複雑な生物系の研究である。いくつかの方法は、抗体マイクロアレイ2、二次元ゲル電気泳動3-5、およびDIGE 6を含む内耳のプロテオーム解析のために利用されてきた。しかし、タンパク質の限られた数が同定されており、内耳11,12において同定10,000以上の遺伝子および発現配列タグ（EST）と比較して、2,7-10を特徴とする、MSは、最も一般的に使用され、包括的技術であるタンパク質特性のためのプロテオミクス。このような蝸牛のような複雑なプロテオミクスサンプルの分析は、挑戦することができます。しかしながら、MSを有する複数の分離技術の組み合わせは、増大したダイナミックな濃度範囲およびピーク容量13に、ペプチドおよびタンパク質のより多くの同定を可能にする。多次元chromatogra物理ポートは、異なる吸着機構の使用を可能にすることによって、非常に複雑なタンパク質混合物を減少させる。 2一般的に使用されるMSのプロテオーム解析アプローチ、ショットガンとボトムアッププロテオミクスがあります。ショットガンプロテオミクスでは、インタクトなタンパク質の混合物を酵素的に消化し ​​、逆相液体クロマトグラフィー（RPLC）14,15、続いて強力な陽イオン交換クロマトグラフィー（SCX）を用いて、多次元クロマトグラフィーを用いて分離される。分離されたペプチドは、タンデムMSとデータベース15を検索にかける。この技術の主な利点は、何千ものタンパク質が単一の分析で同定することができ、技術は膜タン​​パク質に適していることである。 ボトムアップアプローチにおいて、タンパク質混合物は、通常、1次元または2次元電気泳動によって分離し、個々のタンパク質バンドまたはスポットを切り出し、トリプシンなどの酵素で消化し、通常は複数のペプチドが得られる。しかし、別のより最近のLYは、ボトムアッププロテオミクスで使用、電気泳動の手法を開発し、GELFrEEです。この技術は、液相中のタンパク質サンプルを分別し、分析前にそれらをあまり複雑にする。この手法は、再現性が高いタンパク質回収を提供し、複雑なタンパク質サンプル16内の高濃度タンパク質の分布を低減します。分離されたタンパク質から生じるペプチドを、データベース17〜19を検索するための配列タグを作成するために、ペプチドマスフィンガープリンティングまたはタンデムMS（MS / MS）を用いて、MSによって分析される。ボトムアップアプローチを使用する主な利点のいくつかは、高分解能の分離と包括的なタンパク質カバレッジを得る能力である。ボトムアッププロテオミクスプロテオミクス20で最も広く使用される技術である、したがって、いくつかのバイオインフォマティクス·ツールの提供。加えて、タンパク質消化の前に複雑な混合物中で分離することができるので、識別のより大きな可能性がある。 大きな課題の一つプロテオーム解析のための内耳を使用してその小さなサイズ、制限されたアクセス可能性、および細胞型の多様性21である。また、このようなイオンチャネル、輸送体および受容体としての機能を区別する重要なタンパク質は、22を単離することが困難であることができる膜タンパク質である。従って、フィルタ支援試料調製（FASP）をタンパク質抽出のために制限されている組織のプロテオーム解析のために有利で ​​あり、膜23を可溶化するために界面活性剤を必要とする。このフィルタリングは、膜および可溶性タンパク質のMS分析のために、低分子量混入物23,24からペプチドを単離する能力を可能にする。 本プロトコルは、合わせて、両方の可溶性タンパク質および膜タンパク質を分析し、蝸牛感覚上皮からのタンパク質IDの数を最大化するために修正される一般的に使用されるプロテオミクスのアプローチを記載する。私たちは、FASPマルチダイジェストでショットガンプロテオミクスを使用して説明しますイオンは、イオン交換クロマトグラフィー、高分解能MS、およびデータ分析。加えて、我々はGELFrEE、FASPマルチ消化、高分解能MS、およびデータ分析とボトムアッププロテオミクスについて説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

プロテオミクスは、複雑な生物システムへの洞察を提供することができ、一般的に使用されるアプローチである。蝸牛感覚上皮は、末梢神経系および中枢神経系で処理された電気化学的エネルギーに音の機械的エネルギーを伝達する受容体が含まれています。いくつかのプロテオミクス技術は、二次元の差ゲル電気泳動（2D-DIGE）、抗体マイクロアレイ、および質量分析（MS）などの内耳蝸牛を研究するために開発されてきた。 MSは、プロテオミクスにおける最も包括的かつ汎用性の高いツールであり、分離方法と組み合わせて、生物学的サンプルの詳細なプロテオームを提供することができます。 MSと組み合わせた分離方法は、タンパク質サンプルを濃縮する低分子量および疎水性タンパク質を検出し、プロテオームダイナミックレンジを低減することにより、低濃度タンパク質を同定する能力を有する。異なる消化戦略は、ペプチドおよびタンパク質を向上させ、全体溶解物または分画タンパク質溶解物に適用することができる配列カバー。強カチオン交換（SCX）、逆相（RP）、およびゲル溶出液画分の閉じ込め電気泳動（GELFrEE）を含む様々な分離技術の利用は、タンパク質同定のためのMS分析前に試料の複雑さを低減するために適用することができる。

蝸牛感覚上皮の最も包括的なプロテオームを得るためには、迅速な組織切開前タンパク質抽出およびサンプル調製に必要とされている。二つのプロテオミクス技術は、ショットガンとボトムアッププロテオミクスを使用することができる。 図1に示すように、ショットガンプロテオミクスのための試料を調製し、FASP消化手順を使用した。 FASP法は、タンパク質の濃度?...

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

人工内耳感覚上皮のプロテオーム解析は、その小さなサイズのために、膜タンパク質が単離および同定することが困難であるため、挑戦的であることができる。膜および可溶性タンパク質の両方は、高分解能質量分析と一緒に複数の調製方法及び分離技術を組み合わせることによって同定することができる。

総合蝸牛プロテオームを識別するために、ボトムアップとショットガンプロテオミクス

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K ビュー.  University of South Florida. 人工内耳感覚上皮のプロテオーム解析は、その小さなサイズのために、膜タンパク質が単離および同定することが困難であるため、挑戦的であることができる。膜および可溶性タンパク質の両方は、高分解能質量分析と一緒に複数の調製方法及び分離技術を組み合わせることによって同定することができる。 

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

生物学

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

の生産<em&gt;アフリカツメガエルトロピカ</em微小管関連RNAを識別するために、&gt;卵抽出

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

変換にマトリックス支援レーザー脱離/イオンイメージングのためのマトリックスとしてジスラノールはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計をフーリエ

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.