Os autores agradecem ao Dr. Kent Seeley, diretor do Center for Drug Discovery e Inovação (CDDI) Proteômica Núcleo Facilidade na Universidade do Sul da Flórida para o uso desta facilidade. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC004295 a BHAS

Declaração de Ética Experimentos utilizando tecido camundongos foram aprovados pela University of South Florida Animal Care Institucional e Comitê de Uso (Protocolos 3931R, 3482R), conforme estabelecido sob as diretrizes do National Institutes of Health. 1. Extração de Proteína <ol><li> Isolar epitélio sensorial da cóclea de 16 em 30 dias de idade (P30) camundongos CBA / J e armazenar a -80 ° C. </li><li> No dia da experiência, lavar o tecido com 500 ul de 1x tampão de fosfatos salino (PBS). Centrifugar durante 3 min a 1000 xg, e remover o sobrenadante. Repetir para um total de três lavagens. </li><li> Tecido Sonicar durante 30 segundos sobre gelo em 100 ul de tampão de lise contendo 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 120 mM, NaF 50 mM, 5 mM de EDTA, 500 ug / mL de AEBSF, 10 ug / ml de leupeptina, 100 ug / mL de pepstatina, 2 ug / ml de aprotinina, e 0,5 ug / ml usando um microcistina Dismembrator sónico (Modelo 100; Thermo Fisher). Lisado fresco no gelodurante 1 minuto entre cada sonicação. Sonicar um total de 3x. </li><li> Centrifuga-se o extracto a 750 xg, a 4 ° C durante 2 min e remove-se o sobrenadante para um novo microtubo. Extrai-se a pelete em 50 ul de tampão de lise por sonicação durante 30 segundos em gelo. Centrifuga-se o extracto a 750 xg, a 4 ° C durante 2 min. Combinar os dois lisados ​​e centrifugar a 28.600 xg, a 4 ° C durante 60 min. Retirar o sobrenadante para um novo microtubo e adicionar 20 ul de tampão de lise contendo 0,1% de ASB-14 para o pelete. Vortex durante 1 minuto e incuba-se durante 60 min a 4 ° C. </li><li> Aquece-se a amostra a 95 ° C durante 5 min, depois arrefece-se a 4 ° C durante 60 min. Seguir à centrifugação a 16.000 x g a 25 ° C durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo novo. </li><li> Centrifugar a suspensão a 16.000 xg, a 4 ° C durante 5 minutos e manter-se o sobrenadante para a digestão. </li></ol> 2. Duplo digestão de proteínas tríptico de Whole Lysate Usando FASP <ol><li> Adicionar a 30 μl alíquota (≤ 400 ug) de extracto de proteína coclear, contendo dodecilsulfato de sódio 4% (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M ditiotreitol (DTT) directamente para um filtro de centrifugação 30K e misturar-se com 200 ul de 8 ureia M em Tris-HCl. Centrifugar a 14.000 xg por 15 min. </li><li> Dilui-se o concentrado com 200 ml de solução de ureia 8 M e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Adicionar 10 ml de 10x iodoacetamida (IAA) 8 em solução M de ureia ao concentrado no filtro e vortex durante 1 min. Incubar o filtro de centrifugação durante 20 min à temperatura ambiente (TA) no escuro, seguido por centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de ureia 8 M para o concentrado na unidade de filtragem e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min. Repita este passo 2x. Adicionar 100 ul de 50 mM de solução de bicarbonato de amónio (ABC) para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 2x. </li><li> Adicionar 0,4 ug / uL de tripsina de 1:100 (w / w) da enzima-deProporção entre proteína e incubar durante a noite (O / N) a 37 ° C. </li><li> Após a incubação, adicionar 40 ul de solução 50 mM de ABC unidade para filtrar e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para o filtro de centrifugação e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos para um microtubo de fresco e acidifica-se com ácido fórmico (FA) a 1,0% para parar a digestão. </li><li> Lava-se a unidade de filtração com 40 mL de 8 M de ureia, e em seguida lavar 2x com 40 ul de 18 mohms água. </li><li> Lava-se a unidade de filtro com 3 x 100 mL de solução 50 mM de ABC. Após a lavagem final, adicionar 0,4 ug / uL de tripsina em 1:100 (w / w) proporção de enzima para proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos a partir da segunda digestão através da adição de 40 ul de solução de ABC 50 mM para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para aunidade de filtragem e de centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos para um microtubo de fresco e acidifica-se com FA a 1,0%. </li><li> As amostras podem ser quantificadas utilizando o ensaio colorimétrico de microplacas usando BSA como padrão. </li></ol> 3. Endoproteinase LysC e Tryptic digestão de proteínas de Whole Lysate Usando FASP <ol><li> Adicionar uma parte alíquota de 30 ul (≤ 400 ug) de extracto de proteína coclear contendo 4% de SDS, Tris-HCl a 100, pH 7,6 e 0,1 M de DTT directamente para um filtro de centrifugação 30K e misturar-se com 200 mL de 8 M de ureia em Tris-HCl . Centrifugar a 14.000 xg por 15 min. </li><li> Dilui-se o concentrado com 200 ml de solução de ureia 8 M e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Adicionar 10 ml de 10x IAA em 8 M de ureia solução ao concentrado no filtro e vortex durante 1 min. Incubar o filtro de rotação, durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro, depois centrifugar a 14000 xg durante 10 min. </li><li> Adicionar 100 ul de ureia 8M sollução para o concentrado na unidade de filtro e centrifugar a 14000 xg durante 15 min. Repita este passo 2x. Adicionar 100 ul de solução 100 mM de ABC para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 2x. </li><li> Adicionar 0,1 ug / uL de endoproteinase LysC em 1:50 (w / w) proporção de enzima para proteína e incubar O / N a 30 ° C. </li><li> Após a incubação, adicionar 40 ul de uma solução 100 mM de ABC para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para o filtro de centrifugação e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os péptidos LysC para um microtubo de fresco e acidifica-se com FA a 1,0% para parar a digestão. </li><li> Lava-se a unidade de filtração com 40 mL de 8 M de ureia, e em seguida lavar 2x com 40 ul de 18 mohms água. </li><li> Lava-se a unidade de filtro com 3 x 100 mL de solução 50 mM de ABC. Após a lavagem final, adicionar 0,4 ug / uL de tripsina em 1:100 enzima-a-proproporção tein e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos por adição de 40 ul de solução de ABC 50 mM para a unidade de filtro e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para a unidade de filtro e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos para um novo microtubo e acidificar com 1,0% FA. </li><li> A amostra pode ser quantificada utilizando o ensaio colorimétrico de microplacas com BSA como padrão. </li></ol> 4. Peptídeos dessalinização Usando Colunas spin <ol><li> Activar uma coluna MacroSpin C 18 pela adição de 500 mL de acetonitrilo (ACN) e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Descarte o flow-through após a centrifugação. </li><li> Equilibrar a coluna com 500 mL de 0,1% de FA e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Descarte o flow-through e repita este passo 1x. </li><li> Adicione-se 500 ul de péptido a digerir a uma colunad centrifugar a 1.100 g durante 1 min. Se o volume da amostra é maior do que 500 mL, em seguida, repita este passo. </li><li> Lava-se a coluna com 500 mL de 0,1% de FA e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Descartar o escoamento. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 250 ul de uma relação de 90:10 ACN-água para a coluna e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Coletar o eluente contendo os peptídeos dessalinizada e transferir para um novo microtubo. Repita este passo 1x. </li><li> Seca-se a amostra de péptido dessalinizada numa centrífuga de vácuo e evitar que a amostra seque completamente. </li></ol> 5. Cromatografia de troca iônica <ol><li> Injectar 50-100 mg de amostra de proteína digerida para um 200 x 2.1 mm, 5 mM de coluna SCX (Polysulfoethyl A) para separar péptidos. </li><li> Usar um gradiente de 2-40% de B ao longo de 50 min, com uma taxa de fluxo de 250 mL / min. O solvente A é formato de amónio 5 mM, pH 3,0 em 25% de acetonitrilo e 75% de DDH 2 O. Solvente B é formato de amónio 500 mM, pH6,0 em 25% ACN e 75% DDH 2 O. </li><li> Monitorar as frações peptídicas a 280 nm e recolher as frações em intervalos de 2 minutos usando um coletor de fração. </li><li> Fracções secas em um concentrador de vácuo e ressuspender em 500 ul de acetonitrilo a 50% em ddH2O contendo 5% de FA para auxiliar a remoção de sal. </li><li> Frações Redry e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para usar para análise nano LC-MS/MS. </li></ol> 6. Acetona Precipitation Antes da separação GELFrEE o sobrenadante proteína coclear tem de ser dessalinizada. Precipitação por acetona pode ser usado para dessalinizar e concentrar proteínas. <ol><li> Adicionar três volumes de acetona gelada para o sobrenadante da cóclea. Suavemente vortex e incubar a 20 ° CO / N. </li><li> Centrifugar a mistura de amostra a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante. </li><li> Lava-se a pelete 3x proteína com acetona gelada e centrifugar a 14000 xg durante 5 min a 4° C. </li><li> Secar o pellet e dissolver em 112 mL de 18 mohms água. </li><li> Determinar a concentração de proteína utilizando o ensaio colorimétrico de microplacas. </li></ol> 7. GELFrEE Fracionamento de Coclear Sensorial Epithelium <ol><li> Adicionar 30 ul de tampão de amostra de 5x (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) de SDS, 50% glicerol, 0,5% (w / v) de azul de bromofenol) para a proteína dessalinizada suspenso em 112 ul de 18 mohms água. </li><li> Adicionar 8 mL de 1 M DTT e aquece-se a 95 ° C durante 5 minutos para reduzir ligações de dissulfureto da proteína. Depois de aquecer permitir o arrefecimento até à temperatura ambiente. </li><li> Adicione 8 ml de tampão de corrida para ânodo reservatório, 150 mL de tampão de corrida para provar câmara de coleta e 6 ml de tampão de corrida para o catodo reservatório. </li><li> Remova qualquer buffer que pode ter corrido para a câmara de amostra-loading com uma pipeta. </li><li> Carga de 150 ul (≤ 1 mg) da mistura de proteínas coclear, para dentro da câmara de carregamento de amostra utilizando uma Tr 8%é-acetato de cartucho com um intervalo de massa de 3,5-150 kDa. </li><li> Menores eletrodos e fim instrumento tampa para começar a corrida. </li><li> Na primeira vez em pausa no instrumento adicionar 2 ml de tampão de corrida para o reservatório cátodo e retomar prazo. </li><li> A cada intervalo de uma pausa no instrumento, recolher a amostra da câmara de recolha de amostra, utilizando uma pipeta e adicionar a um microtubo de fresco rotulado. Lave os 2x câmara coleção com 150 mL de tampão de corrida e descarte. </li><li> Adicionar 150 mL de tampão de corrida fresco para a câmara de coleta de amostras e retomar a corrida. Recolher as fracções de proteína ao longo de um período de tempo de 2,6 horas, num volume total de 150 ul / fracção. </li></ol> 8. 1E Eletroforese em Gel de GELFrEE Frações Electroforese em gel 1D pode ser usado para visualizar os resultados de GELFrEE fraccionamento antes da digestão enzimática e análise MS. Fracções de proteínas GELFrEE pode ser separado num gel de 4-15% de Tris-HCl. </p&gt; <ol><li> Mistura-se uma alíquota de 5 ul de cada fracção GELFrEE com 5 mL de tampão de diluição da amostra (DTT 350 mM em tampão de amostra). </li><li> Aquecer as amostras a 95 ° C durante 3 min. </li><li> Amostras legal para RT. </li><li> Coloque 10 ml de cada fração GELFrEE em pistas de gel individuais e carga de 5 mL de padrão de peso molecular na última faixa não utilizada. </li><li> Submeter o gel a 125 V durante 1,5 horas ou até a frente do corante atingir o fundo do gel. </li><li> Retire cuidadosamente o gel e manchar com a Silver Stain Plus para visualizar a separação de proteínas. </li></ol> 9. Digestão de proteínas de frações GELFrEE Usando FASP Um procedimento FASP modificado é usado para a remoção do detergente e digestão das fracções GELFrEE. <ol><li> Adicionar a cada fracção indivíduo directamente para uma unidade de filtro de 30K e misturar com 200 mL de 8 M de ureia em Tris-HCl e centrifuga-se a 14.000 xg durante 25 min. </li><li> Dilui-se o concentrado com 200 ml de solução de ureiae centrifuga-se a 14.000 xg durante 12 min. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 10 ml de 10x IAA em solução de ureia ao concentrado em cada unidade de filtro, vortex durante 1 min, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de ureia para o concentrado sobre as unidades de filtragem e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min. Repita este passo 2x. Adicionar 100 ul de solução 100 mM de ABC para as unidades de filtro e de centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 2x. </li><li> Adicionar 0,1 ug / uL de LysC de 1:50 (w / w) proporção de enzima para proteína para as unidades de filtro e incubar O / N a 30 ° C. </li><li> Após a incubação, adicionar 40 ul de uma solução 100 mM de ABC para os filtros de spin e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para os filtros de spin e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos IysC de cada filtro de giro para um novo microtubo e acidificar com trifluoroacácido etic (TFA). </li><li> Lave os filtros de spin com 40 l de 8 M de uréia, em seguida, lavar 2x com 40 mL 18 mohms água. </li><li> Lave os filtros de spin 3x com 100 ul de solução 50 mM de ABC. Após a lavagem final, adicionar 0,4 ug / uL de tripsina em um 1:100 (w / w) proporção de enzima para proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos a partir de cada unidade de filtro através da adição de 40 ul de solução 50 mM de ABC e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para as unidades de filtro e de centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos de cada unidade de filtro para uma nova microtubo e acidifica-se com TFA. </li><li> Seque todas as digere em um concentrador de vácuo. </li></ol> 10. Preparação de Amostras para LC-MS/MS <ol><li> Reconstituir seca LysC e péptido tríptico digere fracções em 20 ul de 0,1% de FA e vortex. </li><li> Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 10min e remover a parte superior de 95% da amostra para um novo frasco de amostra. </li><li> Injectar 5 ul de cada fracção de péptidos numa armadilha 100 mm x 25 mm da amostra para remover sais e contaminantes e realizar a separação cromatográfica sobre uma coluna de 18 mM 75 cm por 10 cm C. </li><li> Usar um gradiente de 2-40% de B ao longo de 100 minutos, com um caudal de 200 nl / min. O solvente A é de 95% ddH2O e 5% de acetonitrilo contendo 0,1% de FA. Solvente B é 80% de ACN e 20% ddH2O contendo 0,1% de FA. </li><li> Colete dez espectros de massa em tandem para cada MS varredura em um espectrômetro de massa de alta resolução. Um espectrômetro de massa LTQ Orbitrap foi utilizado neste experimento. </li></ol> 11. Identificação de Proteínas <ol><li> Identificar proteínas usando o banco de dados do mouse UniProt contendo ambos frente e verso seqüências de proteínas e contaminantes comuns. Software MaxQuant com MASCOTE motor de busca é usado para pesquisar o banco de dados de proteínas. </li><li> Os parâmetros de pesquisa que podem ser utilizados incluem; modific fixadoção de carbamidomethyl de cisteína, modificações variáveis ​​de oxidação da metionina, proteínas acetilação N-terminal, no máximo, 2 perdeu clivagem. O comprimento mínimo do péptido a considerar para a identificação é de 6 aminoácidos. Introduzir um erro de concentração da massa dos péptidos de ± 8 ppm e uma tolerância de massa fragmento de 1,2 Da (massa de erro é dependente do espectrómetro de massa que é utilizado). </li><li> No software MaxQuant, utilizar uma taxa de detecção falso 1% (FDR) para o péptido e proteína de identificação. Identificação de proteínas é listado com o número de peptídeos combinados, a cobertura seqüência por cento de proteína, e as sequências de peptídeos. </li></ol>

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R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

<html> Os principais passos para maximizar a identificação de proteínas do epitélio sensorial da cóclea são: 1) uso de múltiplos endoproteinases para a digestão, 2) utilização de múltiplas técnicas de separação, e 3) a utilização de um espectrômetro de massa de alta resolução. A aplicação de enzimas múltiplas aumenta o número de péptidos e melhora a cobertura da sequência de proteína, portanto, melhorar o número de proteínas identificadas a partir do tecido da cóclea. Tripsina, a protease mais utilizada fornece clivagem eficiente e específica de proteínas, a gerar péptidos que são bons para a MS de ionização e fragmentação. No entanto, utilizando uma outra enzima antes de tripsina, tal como LysC, que também cliva no resíduo de lisina, fornece mais eficiente de clivagem do péptido. Observou-se que a cobertura da sequência das proteínas geradas a partir da digestão LysC / tripsina apresentaram um aumento na proteína de cobertura de sequência em relação à sequência da proteína de cobertura de tripsina / tripsina digest. ove_content &quot;&gt; A aplicação de separação multidimensional antes MS reduzida a complexidade elevada amostra coclear na abordagem proteómica espingarda. Isto permitiu a identificação de mais proteínas, incluindo proteínas de membrana, que são normalmente difíceis de identificar. Foi identificado um grande número de proteínas de membrana usando a abordagem de espingarda, em oposição à abordagem de baixo para cima. No entanto, a abordagem de baixo para cima utilizando GELFrEE permitido para a identificação de proteínas abundantes mais baixas. Isto deve-se ao isolamento de proteínas de maior abundantes, tais como Cochlin da cóclea, em indivíduo frações. Os dados de alta qualidade alcançados no presente protocolo por um espectrómetro de massa de alta resolução, tal como um LTQ-Orbitrap, melhora e aumenta o número de proteínas que podem ser identificadas na cóclea. O LTQ-Orbitrap oferece alta resolução, precisão de massa de alta e de alta sensibilidade para a análise de péptidos. Assim, a aplicação deste instrumento enables identificação de proteínas a partir de amostras biológicas complexas, tal como o epitélio sensorial da cóclea e aumenta a identificação de peptídeos de baixo abundantes. A utilização dessas abordagens experimentais combinados com a poderosa ferramenta da MS ajuda a aumentar significativamente o conjunto de dados de proteínas coclear, melhorando a oportunidade de identificar novos biomarcadores de proteínas envolvidas na audição e surdez.

Proteomics é o estudo dos sistemas biológicos complexos, analisando a expressão da proteína, função, modificações, e interacções 1. Vários métodos têm sido utilizados para a análise do proteoma do ouvido interno, incluindo o anticorpo microarray 2, electroforese em gel bidimensional, 3-5, e DIGE 6. No entanto, apenas um número limitado de proteínas foram identificadas e caracterizadas 2,7-10, em comparação com os 10.000 e os genes marcadores de sequências expressas (ESTs) identificados no ouvido interno, 11,12, MS é a técnica mais utilizada abrangente e em proteômica para a caracterização de proteínas. A análise de amostras de proteômica complexas, como a cóclea, pode ser um desafio. No entanto, a combinação de várias técnicas de separação com MS permite a identificação de um maior número de peptídeos e proteínas, devido a um aumento da gama de concentração e capacidade dinâmica de pico 13. Cromatog Multidimensionalphy reduz misturas de proteínas altamente complexas, permitindo o uso de diferentes mecanismos de adsorção. Há duas abordagens de análise do proteoma MS comumente utilizados, espingarda e proteômica bottom-up. Em proteómica espingarda, uma mistura de proteínas intactas é enzimaticamente digeridas e separados utilizando cromatografia multidimensional com cromatografia de troca catiónica forte (SCX), seguido por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) 14,15. Os péptidos separados são submetidos a MS em tandem e base de dados em busca 15. Uma importante vantagem desta técnica é que milhares de proteínas podem ser identificadas em uma única análise e a técnica é mais adequada para as proteínas da membrana. Na abordagem de baixo para cima, a mistura de proteína é separada, normalmente por um ou electroforese bidimensional, e as bandas de proteínas individuais ou manchas cortadas e digeridas com uma enzima tal como a tripsina, geralmente resultando em péptidos múltiplos. No entanto, outra mais recentely desenvolvido abordagem eletroforética, usado em proteômica bottom-up, é GELFrEE. Esta técnica fracciona amostras de proteína em fase líquida e os torna menos complexo antes da análise. Esta técnica é reprodutível, oferece a recuperação da proteína, e diminui a distribuição de proteínas abundantes elevadas em amostras de complexos de proteínas 16. Peptídeos resultantes de proteínas separadas, são analisadas por MS, por meio de impressão digital em massa peptídeo ou conjunto MS (MS / MS), para criar etiquetas de seqüências do banco de dados em busca 17-19. Algumas das principais vantagens de se utilizar a abordagem bottom-up são a capacidade de obter separações de alta resolução e cobertura de proteína completa. Proteômica bottom-up é a técnica mais utilizada em proteômica 20, por isso, várias ferramentas de bioinformática estão disponíveis. Além disso, as proteínas podem ser separadas em uma complexa mistura, antes da digestão, para que haja uma maior chance de identificação. Um dos maiores desafiosno uso do ouvido interno para análise proteômica é seu pequeno tamanho, a acessibilidade restrita, e tipo de célula diversidade 21. Além disso, as proteínas principais que distinguem a sua funcionalidade, como os canais de iões, os transportadores e os receptores, são proteínas de membrana, as quais podem ser difíceis de isolar 22. Assim, a preparação da amostra auxiliado por filtro (FASP) é vantajoso para análises proteômicas de tecidos que são limitados para a extração de proteínas e que necessitam de detergentes para solubilizar as membranas 23. Esta filtragem permite a análise MS da membrana e as proteínas solúveis e para a capacidade de isolar péptidos a partir de contaminantes de baixo peso molecular 23,24. O presente protocolo descreve abordagens proteomic comumente utilizados que são combinadas e modificados para análise de proteínas, tanto solúveis e de membrana e para maximizar o número de IDs de proteína a partir do epitélio sensorial da cóclea. Vamos descrever usando proteômica shotgun com FASP multi-digeririônica, cromatografia de troca iônica, alta resolução MS, e análise de dados. Além disso, vamos descrever proteômica bottom-up com GELFrEE, FASP multi-digestão, alta resolução MS, e análise de dados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

Proteômica é uma abordagem comumente utilizado, que pode fornecer insights sobre sistemas biológicos complexos. O epitélio sensorial da cóclea contém receptores que transduzem a energia mecânica do som para uma energia electro-química processada pelos sistemas nervosos periférico e central. Diversas técnicas têm sido desenvolvidas proteomic para estudar o ouvido interno da cóclea, tais como electroforese bidimensional em gel de diferença (2D-DIGE), anticorpo do microarray, e espectrometria de massa (MS). MS é a ferramenta mais abrangente e versátil em proteômica e em conjunto com métodos de separação pode fornecer um proteoma em profundidade de amostras biológicas. Os métodos de separação combinadas com MS tem capacidade para enriquecer amostras de proteína, detectar baixo peso molecular e as proteínas hidrofóbicas, e identificar proteínas abundantes baixas, reduzindo a gama dinâmica do proteoma. Estratégias diferentes de digestão pode ser aplicado a todo o lisado ou lisado de proteína fraccionada para aumentar peptídeo e proteínacobertura seqüência. Utilização de técnicas de separação diferentes, incluindo permuta catiónica forte (SCX), em fase inversa (RP), e electroforese fracção aprisionamento líquido eluído-gel (GELFrEE) podem ser aplicadas para reduzir a complexidade da amostra antes da análise por MS para a identificação das proteínas.

Para obter o proteoma mais abrangente do epitélio sensorial da cóclea, a dissecção do tecido rápida é necessária antes da extração de proteínas e de preparação da amostra. Duas técnicas proteômicas pode ser usado, de espingarda e bottom-up proteômica. Para preparar amostras para proteómica espingarda, procedimento de digestão FASP foi utilizado como ilustrado na Figura 1. O método permite que FASP para concentração de proteínas, a remoção de detergentes, e a digestão de proteínas, utilizando várias enzimas. Havia dois processos de digestão dupla utilizadas, a primeira foi uma digestão tríptica seguido por uma segunda digestão com tripsina, que foram reunidas, fraccionadas numa coluna de SCX-se em 18 fracções e analisadas por nano CL-EM/EM. Um total de 1.485 proteínas foram identificadas com um FDR de 1% ao executar um único prazo LC-MS/MS usando essa abordagem experimental. Entre as proteínas identificadas, 329 e 258 proteínas foram categorizados em mitocôndria e membrana de plasma, respectivamente (Figura2A). O segundo procedimento de dupla digestão consistiu de digestão LysC seguido por digestão com tripsina. Cada digest foi carregado individualmente e separada na coluna de SCX em 18 fracções e analisadas por nano CL-EM/EM. Os resultados da digestão de tripsina e LysC produzido um total de 3503 proteínas com um 1% FDR. Figura 2B mostra que 605 e 617 proteínas foram categorizados em mitocôndria e membrana de plasma, respectivamente. Esta abordagem forneceu o maior número de identificações de proteína associada à membrana. Análise em duplicado do LysC e frações de tripsina mostrou que mais de 65% das proteínas identificadas foram compartilhados entre os experimentos. No entanto, havia também as proteínas recém-identificadas na análise replicar. Os péptidos e as proteínas adicionais foram identificados devido a pequenas alterações na cromatografia, por conseguinte, levando a diferentes péptidos para fragmentação 25. Proteômica bottom-up foi aplicado utilizando GELFrEE fracionamentoantes de LC-MS/MS como ilustrado na Figura 3. Havia 12 frações GELFrEE coletados. Antes da digestão e análise de CL-EM/EM, de um gel corado com prata foi preparada para visualizar os resultados do fraccionamento GELFrEE como ilustrado na Figura 4. O gel mostrou a separação de proteínas, aumentando o peso molecular de cada fracção consecutivo. Portanto, as 12 fracções líquidas GELFrEE foram digeridos utilizando duas abordagens diferentes de digestão várias FASP e analisadas por LC-MS/MS. A primeira abordagem digestão foi realizada utilizando uma digestão com tripsina dupla, que levou à identificação de 2.165 proteínas com um FDR de 1% ao executar uma LC-MS/MS prazo único. Figura 5A mostra que houve 516 e 399 proteínas categorizados em mitocôndria e membrana de plasma, respectivamente. A segunda abordagem foi realizada utilizando digestão com endoproteinase LysC seguido por digestão com tripsina. Análise LC-MS/MS Único prazo identificados 2.211 proteínas com um FDR de 1%. Esteabordagem mostrou um número semelhante de proteínas associadas a membranas, como quando se utiliza a abordagem de tripsina / tripsina (Figura 5B). Os dados de proteômica de espectrometria de massa foram depositados na ProteomeXchange Consortium 26 com o identificador de conjunto de dados PXD000231 25. Combinando os resultados das diferentes técnicas resultou em um grande número de membrana e de proteínas solúveis a partir do epitélio sensorial da cóclea do rato (Figura 6). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de uma espingarda experimento proteômica usando FASP, cromatografia de troca iônica e de alta resolução MS. Proteínas são extraídos, solubilizado, e digerido usando FASP com LysC e endoproteinases tripsina. O LysC (tubo verde) e peptídeos trípticos (roxo<html> tubo) são separadas em fracções menos complexas utilizando cromatografia SCX e analisados ​​usando nano CL-EM/EM. O motor de busca MASCOTE foi usado para processar os dados de MS para identificação de proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51186/51186fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig2.jpg" /> Figura 2. GO componentes celulares perfil de IDs de proteína quando se realiza uma (A), primeiro e segundo a digestão com tripsina seguida por separação de SCX e (B) primeiro a digestão com LysC seguido por uma segunda digestão com tripsina seguida por separação de SCX. Todas as categorias são contados nonexclusively, quando uma proteína tem mais de uma categoria de componentes celulares.&quot;target =&quot; _blank es.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig3.jpg" /> Proteínas Figura 3. Esquema de um bottom-up experimento proteômica usando GELFrEE, FASP, e de alta resolução MS. Extraídos são dissolvidos e proteínas são precipitadas com acetona (tubo azul) para remover os sais e contaminantes indesejados do lisado. O pelete de proteína é solubilizado e as proteínas fraccionadas utilizando GELFrEE. Cada fracção foi digerido usando FASP com LysC e tripsina endoproteinases. O LysC (tubos verdes) e peptídeos trípticos (tubos de roxo) de cada fração são analisados ​​utilizando LC-MS/MS nano e proteínas identificadas através de pesquisa de dados MS usando MASCOTE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51186/51186fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver grande</a><html> imagem r. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig4.jpg" /> Figura 4. Gel corado com prata das fracções GELFrEE epitélio sensorial da cóclea, para visualizar a separação de proteínas em cada fracção antes da análise por MS. (M) marcador de proteína, (1) A fracção 1, (3) a fracção 2, (5) Fracção 5, (7) A fracção 7, (8) Fracção 8, (9) Percentagem de 9, (10) A fracção 10, (11) A fracção 11, (12) A fracção 12. Reproduzido (adaptado) com permissão da Darville e Sokolowski 24. Direitos de autor 2013 pela American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51186/51186fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. GO componentes celulares perfil de IDs de proteína quando se realiza uma (A), primeiro e segundo digestão com tripsina após separação GELFrEE e (B) primeiro a digestão com LysC seguido por uma segunda digestão com tripsina após separação GELFrEE. Todas as categorias são contados de forma não exclusiva, quando a proteína tem mais de uma categoria para os componentes celulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51186/51186fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig6.jpg" /> Figura 6. GO perfil de componentes celulares para todas as proteínas identificadas usando SCX, cera, ou separação GELFrEE. Quando uma proteína tinham mais do que uma categoria de componentes celulares, toda a sua categories foram contados nonexclusively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51186/51186fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Análise do proteoma do epitélio sensorial da cóclea pode ser um desafio, devido ao seu pequeno tamanho e porque as proteínas da membrana são difíceis de isolar e identificar. Tanto a membrana e proteínas solúveis podem ser identificados através da combinação de vários métodos de preparação e de técnicas de separação junto com espectrometria de massa de alta resolução.

Bottom-up e espingarda Proteômica para Identificar um Comprehensive Coclear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K visualizações.  University of South Florida.  Análise do proteoma do epitélio sensorial da cóclea pode ser um desafio, devido ao seu pequeno tamanho e porque as proteínas da membrana são difíceis de isolar e identificar. Tanto a membrana e proteínas solúveis podem ser identificados através da combinação de vários métodos de preparação e de técnicas de separação junto com espectrometria de massa de alta resolução. 

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologia

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produção de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrai identificar RNAs associada aos microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Bottom-up e espingarda Proteômica para Identificar um Comprehensive Coclear Proteome

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