Gli autori ringraziano il Dr. Kent Seeley, direttore del Centro per la Drug Discovery e l&#39;innovazione (CDDI) Proteomica Nucleo Strutture presso University of South Florida, per l&#39;uso di questo strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCD concessione R01 DC004295 a BHAS

Dichiarazione Etica Esperimenti con topi di tessuto sono stati approvati dalla University of South Florida Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (protocolli 3931R, 3482R), come previsto in base alle direttive del National Institutes of Health. 1. Estrazione Protein <ol><li> Isolare cocleare epitelio sensoriale da 16 a 30 giorni di età (P30) CBA / J topi e conservare a -80 ° C. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, lavare tessuti con 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Centrifugare per 3 minuti a 1000 xg, e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di tre lavaggi. </li><li> Tessuto ultrasuoni per 30 secondi su ghiaccio in 100 ml di tampone di lisi contenente 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / AEBSF ml, 10 mg / ml leupeptina, 100 pg / ml pepstatina, 2 mg / ml aprotinina, e 0,5 mg / ml microcistina utilizzando un dismembrator sonico (Modello 100, Thermo Fisher). Raffreddare lisato su ghiaccioper 1 min tra ogni sonicazione. Sonicare un totale di 3x. </li><li> Centrifugare l&#39;estratto a 750 xga 4 ° C per 2 minuti e rimuovere il surnatante in una nuova provetta. Estrarre il pellet in 50 ml di tampone di lisi per sonicazione per 30 secondi su ghiaccio. Centrifugare l&#39;estratto a 750 xga 4 ° C per 2 min. Combinare entrambi i lisati e centrifugare a 28.600 xg a 4 ° C per 60 min. Rimuovere il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 20 microlitri di tampone di lisi contenente 0,1% ASB-14 al pellet. Vortex per 1 min e incubare per 60 min a 4 ° C. </li><li> Riscaldare il campione a 95 ° C per 5 minuti, poi raffreddare a 4 ° C per 60 min. Seguire con centrifugazione a 16.000 xg a 25 ° C per 10 min. Raccogliere il surnatante e trasferire in un nuovo tubo. </li><li> Centrifugare la sospensione a 16.000 xga 4 ° C per 5 min e conservare il surnatante per la digestione. </li></ol> 2. Doppia Trittico digestione delle proteine ​​di Whole lisato Uso FASP <ol><li> Aggiungere a 30 μl aliquota (≤ 400 mg) di estratto proteico cocleare, contenente 4% di sodio dodecil solfato (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M ditiotreitolo (DTT) direttamente ad un filtro rotativo 30K e mescolare con 200 ml di 8 M urea in Tris-HCl. Centrifugare a 14000 g per 15 min. </li><li> Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione 8 M urea e centrifugare a 14000 xg per 15 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di 10x iodoacetamide (IAA) in soluzione 8 M urea al concentrato nel filtro e vortex per 1 min. Incubare il filtro rotativo per 20 min a temperatura ambiente (RT) al buio seguita da centrifugazione a 14.000 xg per 10 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione 8 M urea al concentrato sul gruppo filtro e centrifugare a 14000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 pl di 50 mM di bicarbonato di ammonio soluzione (ABC) per l&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x. </li><li> Aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina a 1:100 (w / w), enzima-to-Proteina rapporto e incubare una notte (O / N) a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 50 mM ABC filtrare unità e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl al filtro rotativo e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con acido formico (FA) 1,0% per fermare la digestione. </li><li> Lavare il filtro con 40 ml di 8 M urea, e poi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua. </li><li> Lavare 3x l&#39;unità filtro con 100 ml di soluzione 50 mM ABC. Dopo l&#39;ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina a 1:100 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Eluire peptidi triptici dal secondo digest aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl alunità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con FA 1,0%. </li><li> I campioni possono essere quantificati utilizzando il saggio colorimetrico per micropiastre con BSA come standard. </li></ol> 3. Endoproteinase lysC e Trittico digestione delle proteine ​​di Whole lisato Uso FASP <ol><li> Aggiungere una aliquota di 30 microlitri (≤ 400 mg) di estratto proteico cocleare contenente 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M DTT direttamente ad un filtro rotativo 30K e mescolare con 200 ml di urea 8 M in Tris-HCl . Centrifugare a 14000 g per 15 min. </li><li> Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione 8 M urea e centrifugare a 14000 xg per 15 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di 10x IAA in soluzione 8 M urea al concentrato nel filtro e vortex per 1 min. Incubare il filtro rotativo per 20 min a temperatura ambiente al buio quindi si centrifuga a 14000 xg per 10 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di 8 M urea solution al concentrato sul gruppo filtro e centrifugare a 14000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 ml di soluzione 100 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x. </li><li> Aggiungere 0,1 mg / mL di endoproteinase lysC in 1:50 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 30 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 100 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl al filtro rotativo e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi lysC di una nuova provetta e acidificare con FA 1,0% per fermare la digestione. </li><li> Lavare il filtro con 40 ml di 8 M urea, e poi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua. </li><li> Lavare 3x l&#39;unità filtro con 100 ml di soluzione 50 mM ABC. Dopo l&#39;ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina in 1:100 enzima-to-prorapporto proteina e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Eluire peptidi triptici aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl per l&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con il 1,0% FA. </li><li> Il campione può essere quantificato utilizzando la micropiastra saggio colorimetrico con BSA come standard. </li></ol> 4. Peptidi dissalazione Utilizzo Colonne Spin <ol><li> Attiva una colonna MacroSpin C 18 aggiungendo 500 ml di acetonitrile (ACN) e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through dopo la centrifugazione. </li><li> Equilibrare la colonna con 500 ml di 0,1% FA e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through e ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere fino a 500 ml di peptide digerire alla una colonnad centrifugare a 1100 xg per 1 min. Se il volume del campione è superiore a 500 microlitri quindi ripetere questo passaggio. </li><li> Lavare la colonna con 500 ml di 0,1% FA e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 250 pl di un rapporto di 90:10 ACN-acqua alla colonna e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Raccogliere l&#39;eluente contenente i peptidi dissalati e trasferire ad una nuova provetta. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Essiccare il campione peptide dissalato in una centrifuga a vuoto ed evitare di lasciare completamente il campione secco. </li></ol> 5. Scambio ionico Cromatografia <ol><li> Iniettare 50-100 mg di campione proteico digerito su un 200 x 2,1 mm, 5 micron colonna SCX (Polysulfoethyl A) per separare peptidi. </li><li> Utilizzare un gradiente di 2-40% B per 50 min con una portata di 250 ml / min. Solvente A è formiato di ammonio 5 mM, pH 3,0 a 25% di acetonitrile e 75% DDH 2 O. Solvent B è formiato di ammonio 500 mM, pH6,0 nel 25% ACN e il 75% DDH 2 O. </li><li> Monitorare le frazioni peptidiche a 280 nm e raccogliere le frazioni in 2 intervalli di minimo con un collettore di frazioni. </li><li> Frazioni secche in un concentratore di vuoto e risospendere in 500 ml di 50% acetonitrile in DDH 2 O contenente il 5% di FA per aiutare con la rimozione sale. </li><li> Frazioni Redry e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso per l&#39;analisi nano LC-MS/MS. </li></ol> 6. Acetone Precipitazioni Prima della separazione GELFrEE proteina supernatante cocleare deve essere dissalato. Acetone precipitazione può essere usato per desalinizzare e concentrare proteine. <ol><li> Aggiungere tre volumi di acetone ghiacciato al supernatante cocleare. Vortice delicatamente e incubare a -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugare la miscela campione a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare la proteina pellet 3x con acetone freddo e centrifugare a 14000 xg per 5 minuti a 4° C. </li><li> Aria asciugare il pellet e sciogliere in 112 ml di acqua 18 mW. </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​utilizzando la micropiastra saggio colorimetrico. </li></ol> 7. GELFrEE Frazionamento di Cochlear sensoriale Epitelio <ol><li> Aggiungere 30 ml di tampone campione 5x (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) di SDS, 50% glicerolo, 0,5% (w / v) di blu di bromofenolo) alla proteina dissalato sospesa in 112 ml di 18 mW acqua. </li><li> Aggiungere 8 ml di 1M DTT e scaldare a 95 ° C per 5 minuti per ridurre legami disolfuro proteici. Dopo il riscaldamento consentire il raffreddamento a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 8 ml di tampone di corsa al serbatoio anodo, 150 ml di tampone di corsa per assaggiare camera di raccolta, e 6 ml di tampone di corsa al serbatoio catodo. </li><li> Rimuovere eventuali buffer che può essere fluito nella camera del campione di caricamento con una pipetta. </li><li> Carico 150 ml (≤ 1 mg) della miscela proteica cocleare, nella camera del campione-carico con un 8% Trè-acetato cartuccia con un intervallo di massa di 3,5-150 kDa. </li><li> Elettrodi inferiori e chiudere il coperchio dello strumento per iniziare la corsa. </li><li> Alla prima pausa sullo strumento aggiungere 2 ml di tampone di corsa al serbatoio catodo e riprendere la corsa. </li><li> Ad ogni intervallo di pausa sullo strumento, raccogliere il campione dalla camera di raccolta del campione con una pipetta e aggiungere a una provetta appena marcato. Lavare i 2x camera di raccolta con 150 ml di tampone di corsa e scartare. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di corsa fresca alla camera di raccolta del campione e riprendere la corsa. Raccogliere le frazioni proteiche per un periodo di 2,6 ore in un volume totale di 150 microlitri / frazione. </li></ol> 8. 1D elettroforesi su gel di GELFrEE Frazioni Elettroforesi su gel 1D può essere utilizzato per visualizzare i risultati di GELFrEE frazionamento prima digestione enzimatica e analisi MS. GELFrEE frazioni proteiche possono essere separati su un gel Tris-HCl 4-15%. </p&gt; <ol><li> Mescolare un&#39;aliquota di 5 ml di ogni frazione GELFrEE con 5 ml di campione di tampone di diluizione (DTT 350 mM in tampone campione). </li><li> Riscaldare i campioni a 95 ° C per 3 min. </li><li> Campioni Raffreddare a RT. </li><li> Caricare 10 ml di ogni frazione GELFrEE nelle singole corsie del gel e carico di 5 ml di molecolare standard di peso nell&#39;ultimo corsia inutilizzato. </li><li> Attivare il gel a 125 V per 1,5 ore o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. </li><li> Rimuovere accuratamente il gel e macchiare con Silver Stain Plus per visualizzare la separazione delle proteine. </li></ol> 9. Digestione delle proteine ​​di frazioni GELFrEE Uso FASP Una procedura FASP modificato viene utilizzato per la rimozione del detersivo e la digestione delle frazioni GELFrEE. <ol><li> Aggiungere le singole frazioni direttamente ad un&#39;unità filtro 30K, mescolare con 200 ml di urea 8 M in Tris-HCl e centrifugare a 14000 xg per 25 min. </li><li> Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione di ureae centrifugare a 14.000 xg per 12 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 10 ml di 10x IAA in soluzione di urea al concentrato in ciascuna unità filtro, vortex per 1 min, e incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di soluzione di urea al concentrato sulle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 ml di soluzione 100 mM ABC alle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x. </li><li> Aggiungere 0,1 mg / mL di lysC per 1:50 (w / w) rapporto enzima-to-proteina alle unità filtra e incubare O / N a 30 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 100 mM ABC ai filtri spin e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M NaCl ai filtri spin e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi lysC da ogni filtro di selezione per una nuova provetta e acidificare con trifluoroacL&#39;acido ETIC (TFA). </li><li> Lavare i filtri di spin con 40 ml di 8 M urea, quindi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua. </li><li> Lavare i filtri di spin 3x con 100 ml di soluzione di ABC 50 mm. Dopo l&#39;ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina in un 1:100 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Eluire peptidi triptici da ciascuna unità filtro aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M NaCl alle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici da ciascuna unità filtro a una nuova provetta e acidificare con TFA. </li><li> Asciugare tutte le digerisce in un concentratore sotto vuoto. </li></ol> 10. Preparazione del campione per LC-MS/MS <ol><li> LysC Ricostituire secca e peptide trittico digerisce frazioni in 20 microlitri di 0.1% FA e vortex. </li><li> Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 10min e rimuovere la parte superiore 95% del campione in un flaconcino campione. </li><li> Iniettare 5 ml di ogni frazione peptidica su una trappola 100 um x 25 mm campione per rimuovere i sali e contaminanti ed eseguire la separazione cromatografica su 75 micron × 10 cm C 18 colonna. </li><li> Utilizzare un gradiente di 2-40% B per 100 min con una portata di 200 Nl / min. Solvente A è 95% ddH2O e 5% acetonitrile contenente 0,1% FA. Solvent B è 80% ACN e 20% ddH2O contenente 0,1% di FA. </li><li> Raccogliere dieci spettri di massa tandem per ogni MS scansione su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Uno spettrometro di massa LTQ Orbitrap è stato utilizzato in questo esperimento. </li></ol> 11. Protein Identification <ol><li> Identificare le proteine ​​che utilizza il database del mouse UniProt contenente sia avanti e indietro sequenze proteiche e contaminanti comuni. Software MaxQuant con motore di ricerca MASCOT viene utilizzato per effettuare ricerche nel database proteina. </li><li> I parametri di ricerca che possono essere utilizzati comprendono; modific fissozione di carbamidomethyl di cisteina, modifiche variabili di ossidazione della metionina, proteina N-terminale acetilazione, massimo 2 mancati scissione. La lunghezza minima peptide da considerare per l&#39;identificazione a 6 aminoacidi. Inserire una massa errore concentrazione del peptide di ± 8 ppm e una tolleranza massa frammento di 1.2 Da (errore di massa dipende dalla spettrometro di massa utilizzato). </li><li> Nel software MaxQuant, utilizzare un falso tasso di scoperta 1% (FDR) per peptidi e proteine ​​identificazione. Identificazione delle proteine ​​è elencato con il numero di peptidi corrispondenti, la copertura della sequenza cento di proteine, e le sequenze peptidiche. </li></ol>

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Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

<html> I passaggi chiave per massimizzare l&#39;identificazione delle proteine ​​dalla epitelio sensoriale cocleare sono: 1) utilizzo di più endoproteinases per la digestione, 2) utilizzo di più tecniche di separazione, e 3) l&#39;utilizzo di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. L&#39;applicazione di più enzimi aumenta il numero di peptidi e migliora la copertura sequenza proteica, consentendo così di migliorare il numero di proteine ​​identificate dal tessuto cocleare. Tripsina, la proteasi più ut...

Proteomica è lo studio di sistemi biologici complessi analizzando l&#39;espressione della proteina, la funzione, modifiche e interazioni 1. Diversi metodi sono stati utilizzati per l&#39;analisi del proteoma dell&#39;orecchio interno, compresi anticorpo microarray 2, gel elettroforesi bidimensionale 3-5, e DIGE 6. Tuttavia, solo un numero limitato di proteine ​​sono state identificate e caratterizzate 2,7-10, rispetto agli oltre 10.000 geni e tag di sequenze espresse (EST) identificati nell&#39;orecchio interno 11,12, MS è la tecnica più utilizzata completo e in proteomica per la caratterizzazione delle proteine. Analisi di campioni di proteomica complesse, come la coclea, può essere difficile. Tuttavia, la combinazione di più tecniche di separazione con MS consente l&#39;identificazione di un maggior numero di peptidi e proteine, a causa di una gamma dinamica aumentata concentrazione e capacità di punta 13. Cromatografia multidimensionalePHY riduce miscele di proteine ​​altamente complesse, consentendo l&#39;uso di differenti meccanismi di adsorbimento. Ci sono due approcci comunemente usati MS analisi del proteoma, fucile e proteomica bottom-up. In proteomica fucile, una miscela di proteine ​​intatte viene digerito enzimaticamente e separati mediante cromatografia multidimensionale con forte cromatografia a scambio cationico (SCX) seguita da cromatografia liquida a fase inversa (RPLC) 14,15. I peptidi separati sono sottoposti a tandem MS e database di ricerca 15. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che migliaia di proteine ​​possono essere identificati in una singola analisi e la tecnica è più adatto a proteine ​​di membrana. Nell&#39;approccio bottom-up, miscela proteica è separato, di solito da una o elettroforesi bidimensionale, e le singole bande proteiche o macchie, ritagliare e digerito con un enzima come la tripsina, solitamente con conseguente più peptidi. Tuttavia, un altro più recentely ha sviluppato l&#39;approccio elettroforetico, utilizzato in proteomica bottom-up, è GELFrEE. Questa tecnica fraziona campioni di proteine ​​in fase liquida e li rende meno complessa prima dell&#39;analisi. Questa tecnica è riproducibile, offre elevato recupero di proteine, e riduce la distribuzione delle alte proteine ​​abbondanti in campioni di proteine ​​complesse 16. Peptidi, derivanti da proteine ​​separate, sono analizzati da MS, utilizzando peptide mass fingerprinting o tandem MS (MS / MS), di creare tag di sequenza per database di ricerca 17-19. Alcuni dei principali vantaggi di utilizzare un approccio bottom-up sono la capacità di ottenere separazioni ad alta risoluzione e la copertura completa di proteine. Proteomica bottom-up è la tecnica più utilizzata in proteomica 20, quindi, diversi strumenti di bioinformatica sono disponibili. Inoltre, le proteine ​​possono essere separate in una miscela complessa prima di digestione, per cui vi è una maggiore possibilità di identificazione. Una delle principali sfideutilizzando l&#39;orecchio interno per l&#39;analisi proteomica è la sua piccola dimensione, accessibilità limitato e tipo di cellula diversità 21. Inoltre, le proteine ​​chiave che contraddistinguono la sua funzionalità, come i canali ionici, trasportatori e recettori sono proteine ​​di membrana, che possono essere difficili da isolare 22. Così, la preparazione del campione filtro assistita (FASP) è vantaggioso per le analisi proteomica di tessuti che sono limitati per l&#39;estrazione di proteine ​​e che richiedono detergenti per solubilizzare le membrane 23. Questo filtro permette l&#39;analisi MS di membrana e proteine ​​solubili e per la capacità di isolare peptidi da contaminanti a basso peso molecolare 23,24. Il presente protocollo descrive approcci di proteomica comunemente usati che vengono combinati e modificati per analizzare le proteine ​​solubili e di membrana e per massimizzare il numero di ID della proteina dall&#39;epitelio sensoriale cocleare. Descriveremo utilizzando la proteomica fucile con FASP multi-digestione, cromatografia a scambio ionico, alta risoluzione MS, e l&#39;analisi dei dati. Inoltre, descriveremo proteomica bottom-up con GELFrEE, FASP multi-digestione, alta risoluzione MS, e l&#39;analisi dei dati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

La proteomica è un approccio comunemente usato che può fornire intuizioni in sistemi biologici complessi. L&#39;epitelio sensoriale cocleare contiene recettori che trasducono l&#39;energia meccanica del suono in energia elettrochimica elaborati dal sistema nervoso centrale e periferico. Diverse tecniche di proteomica sono stati sviluppati per studiare l&#39;orecchio interno cocleare, quali l&#39;elettroforesi bidimensionale differenza gel (2D-DIGE), anticorpo microarray e spettrometria di massa (MS). MS è lo strumento più completo e versatile in proteomica e in concomitanza con metodi di separazione può fornire un proteoma approfondita dei campioni biologici. Metodi di separazione in combinazione con MS ha la capacità di arricchire campioni di proteine, di rilevare a basso peso molecolare e proteine ​​idrofobiche, e identificare le proteine ​​abbondanti bassi riducendo la gamma dinamica proteoma. Diverse strategie di digestione possono essere applicate a tutta lisato o frazionata lisato proteico che permettono di migliorare peptide e proteinacopertura della sequenza. Utilizzazione di diverse tecniche di separazione, comprese forte scambio cationico (SCX), a fase inversa (RP), e elettroforesi frazione intrappolamento liquido gel-eluito (GELFrEE) può essere applicato per ridurre la complessità del campione prima dell&#39;analisi MS per l&#39;identificazione delle proteine.

Per ottenere il proteoma più completa dell&#39;epitelio sensoriale cocleare, dissezione dei tessuti pratica è necessario prima di estrazione di proteine ​​e di preparazione del campione. Due tecniche di proteomica può essere utilizzato, fucile e bottom-up proteomica. Per preparare campioni per proteomica fucile, procedura digestione FASP stato utilizzato come illustrato nella Figura 1. Il metodo FASP consente concentrazione di proteine, rimozione di detergenti, e la digestione delle proteine ​?...

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Analisi del proteoma dell&#39;epitelio sensoriale cocleare può essere difficile a causa della sua piccola dimensione e perché le proteine ​​di membrana sono difficili da isolare e identificare. Sia membrana e proteine ​​solubili possono essere identificati dalla combinazione di più metodi di preparazione e le tecniche di separazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione.

Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  University of South Florida.  Analisi del proteoma dell'epitelio sensoriale cocleare può essere difficile a causa della sua piccola dimensione e perché le proteine ​​di membrana sono difficili da isolare e identificare. Sia membrana e proteine ​​solubili possono essere identificati dalla combinazione di più metodi di preparazione e le tecniche di separazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione. 