この方法は、タンパク質アイソフォームの大規模かつ高解像度の特性評価と、細胞内のタンパク質の翻訳後修飾の向上に役立ちます。この技術の主な利点は、キャピラリーゾーン電気泳動質量分析法が、インタクトなタンパク質の高効率分離と高感度検出を提供できることです。キャピラリーを前処理するには、窒素ガスを10 psiで少なくとも12時間乾燥させます。
次に、シリンジポンプを使用してメタノール中の50%体積3-プロピルメタクリレートで毛細管を充填する。キャピラリーの両端をシリカゴムで密封します。少なくとも24時間室温でインキュベートした後、テキストプロトコルに記載されているように、分離毛細血管の内壁に線形ポリアクリルアミドコーティングを続ける。
毛細血管の一部を穏やかな炎で焼き、毛細血管の一端から約4センチメートル離れたポリアミド外側コーティングを取り除きます。ポリアミドコーティングを完全に除去するために拭くことによって毛細血管の焦げた部分を静かにきれいにします。200マイクロリットルチューブの端に毛細管外径と同じサイズの小さな穴を開け、この穴を通すとキャピラリーを十分に保持します。
焼けた部分がチューブ内に入るまで、焼けた部分に近いキャピラリーの端を穴を通して通します。次に、HF溶液がキャピラリーの焼けた部分の約半分になるように、約150マイクロリットルのHFを200マイクロリットルチューブに加えます。HF溶液中のキャピラリーを室温で90~100分間インキュベートします。
テキストプロトコルに記載されているように、標準的なタンパク質混合物と大腸菌サンプルを調製します。キャピラリーゾーン電気泳動(CZEシステム)を設定するには、サンプル、バックグラウンド電解質、および分離キャピラリーをCZEオートサンプラーにロードします。CZE 自動サンプラーの手動制御ページでサンプル荷重を選択します。
バックグラウンド電解質バイアルをオートサンプラーのバッファトレイにロードし、バッファトレイ内の位置を示します。次に、サンプルバイアルをオートサンプラーのサンプルトレイにロードし、サンプルトレイ内の位置を示します。手動制御を使用して、自動サンプラーを位置合わせ位置に配置します。
さて、キャピラリーの非エッチング端を使用してCZEオートサンプラーに分離毛細管をロードします。サンプルの体積が 50 マイクロリットル未満の場合は、キャピラリーの射出端の高さを調整します。手動制御を使用して、自動サンプラーをスタンバイに切り替えます。
システム内のサンプル位置を入力し、キャピラリーをサンプルに移動します。キャピラリーの射出端をさらに下に押し下げて、サンプルバイアルの底部に到達します。手動制御を使用し続け、20 psiの圧力を使用して20分間、背景電解質で毛細管を洗い流す。
さて、商業電気的にポンプされたシースフローインターフェースを質量分析計の前面に取り付ける。シースバッファーリザーバに、10%体積メタノールと0.2%体積のギ酸を含むバッファーを LCMS グレードの水で充填します。注射器で手動で圧力をかけ、シースバッファとのインターフェイスでTを洗い流します。
エレクトロスプレーエミッタの外径1ミリメートルの端部をスリーブチューブに通し、フィッティングを介してエミッタをTの1つのポートに接続します。単にシースバッファーでエミッタを充填するために注射器で再度Tをフラッシュします。エミッタのオリフィスと質量分析計の入り口の間の距離を、インターフェースに付属のカメラの助けを借りて約2ミリメートルに調整します。
シースバッファーバイアルに2~2.2キロボルトの電圧を適用してエレクトロスプレーを行います。次に、スプレー電圧を調整して安定したエレクトロスプレーに到達します。このプロセス中に毛細血管の射出端に低圧を適用して、毛細血管に気泡がないことを確認します。
スプレー電圧をオフにし、分離キャピラリーのエッチングされた端をTを通してエミッタにそっと通り込み、さらに押し込めません。毛細管の注入端で低圧を停止した後、シースバッファーでエミッタを少し洗い流します。再度、スプレー電圧を2~2キロボルトにして、スプレーをテストします。
メインのインストゥルメント画面のファイルドロップダウンメニューから新しい方法を選択します。そこでは、サンプルバイアルの開始として入口を選択し、サンプルバイアルを終了し、サンプルとしてトレイ、圧力を5 psi、キロボルトをゼロ、サンプル注入の場合は95秒として選択します。次いで、入口を入口バイアル、トレイを緩衝液、圧力をゼロpsi、キロボルトを30、持続時間を4,200秒として標準タンパク質混合物サンプルを分離する。
大腸菌プロテオーム試料の分離のために、入口を入口バイアル、トレイを緩衝器、圧力をゼロpsi、キロボルトを20、持続時間を6,600秒に設定する。最後に、入口を入口バイアルとして、トレイをバッファとして、圧力を10 psi、キロボルトを30、キャピラリーフラッシュの場合は600秒として選択します。今度は、4倍イオントラップマスク分光計を使用して、無傷のタンパク質分析のためのMSおよびMS/MSパラメータを設定します。
チューンファイルの設定を調整するには、インタクトプロテインモードをオンにして、0.2のトラップ圧力を使用します。イオン転写キャピラリー温度を摂氏320度、SレンズRFレベルを55度に設定します。CZE MS/MS実験を実行するには、まず実行シーケンスを選択して、質量分析計コンピュータでデータ取得方法を開始します。
次に、キャピラリー電気泳動自動サンプラーコンピュータ上でキャピラリー電気泳動シーケンスを開始します。TopPIC スイートと TopPIC グラフィカル ユーザ インターフェイスで、TopPIC を使用してデータベース検索を実行します。データベース ファイルをクリックし、検索する適切なデータベースを選択します。
スペクトルファイルをクリックし、生成されたms2を選択します。入力として生成された msalign ファイル。MS1 機能ファイルを選択し、生成された機能ファイルを選択します。
ヨウドアセトアミド処理による固定修飾としてシステインカルバミドメチルC57を設定する。おとりデータベース機能を選択し、カットオフ設定で、スペクトルレベルの横にあるドロップダウンメニューで偽検出率を選択します。スペクトル レベルで誤検出率を 0.01 に設定します。
生成機能を選択したまま、エラー許容値を100万分の15に設定します。プロテオフォームレベルで偽検出率を0.05に設定します。[詳細パラメータ]で、ドロップダウンメニューの質量シフトの最大数として2を選択します。
未知の変更の最大質量シフトを500ダルトンに設定します。その他のパラメータはすべてデフォルト値のままにして、グラフィカルユーザーインターフェースの右下にあるスタートボタンをクリックします。標準タンパク質混合物の代表的なエレクトロフェログラムが示されている。
標準タンパク質混合物は、通常、システムの分離効率および再現性を評価するために少なくとも重複して実行される。分離効率は、いくつかのタンパク質の理論プレートの数で評価することができます。再現性は、タンパク質強度と移動時間の相対標準偏差によって評価することができる。
CZE MS/MSプラットフォームは、様々な複雑なプロテオームにおけるプロテオフォームの大規模な特性評価に使用でき、高い信頼度を持って1回の実行で500以上のプロテオフォームと190個のタンパク質を同定することができます。ここで、エレクトロフェログラムの視野でズームして、システムの分離窓を評価するために使用することができる。非常に低いE値およびスペクトルFDRは、プロテオフォームIDの高い信頼度を示唆している。一致した断片イオンの数が多いほど、IDの高い信頼度をさらに示している。
安定同位体標識法またはラベルフリー法をCZE MS法に組み込むことで、様々な条件で細胞内のタンパク質細胞の存在量がどのように変化するかを決定することができます。この技術は、その開発後、トップダウンプロテオミクスの分野の研究者が細胞内の様々な生物学的プロセスを調節する際のプロテオフォームの役割を探求する道を開きました。フッ化水素酸の使用は非常に危険であり、適切な個人用保護具や緊急処置を実施するなどの予防措置は、常にこの手順を実行する際に行われるべきであることを忘れないでください。
