我々は彼らの専門家の魚のケアのためのメリッサ·グリフィンとジェナRozackyに感謝します。 PDMのおかげEGN支援、寛大さ、そして忍耐を書くため。この作品は、JKEにNIH / NIDCR R01DE020884によってサポートされていました。

1。畜産および変異対立<ol><li> 21が説明されているようにゼブラフィッシュを上げ、繁殖。 </li><li>本研究で用いたゼブラフィッシュ突然変異対立遺伝子は、16 b1059 Smad5をB1100 22、及びSMOのb577 23 PDGFRAた。これらのゼブラフィッシュの株のソースはZIRCが含まれています。 </li></ol> 2。ソリューションと実装の準備注：全ての溶液及び器具は、事前に行われ、将来の使用のために保存することができる。 <ol><li>以前に21を説明したように胚のメディア（EM）を作る。 </li><li> 4グラム/ LのMS-222（トリカイン）を作る。 450ミリリットルの無菌の水に4gのリン酸二ナトリウムせ（Na 2 HPO 4）に溶解する。この溶液に2グラムのMS-222を追加します。 7.0〜7.2以内のpHを調整する。 500ミリリットルの全容量に滅菌水を追加します。 </li><li>オプション：4グラム/ Lのクローブ油を作る。 50mlコニカルチューブに0.2グラムの純粋な丁子油を秤量する。 50ミリリットルの全容量にEMを追加します。 4℃で保存する</li><li> 3パーセントをするmethylcelluloSE。沸騰さのEM + 0.1のHEPESの50ミリリットルを持参してください。暑さから削除します。溶液が均質になるまで1.5グラムのメチルセルロースで撹拌する。 4℃で保存する</li><li> 0.2％アガロースを作る。 50ミリリットルのEMに0.1グラムアガロースを追加します。電子レンジやホットプレート上で沸騰にEMを持参し、アガロースが溶解していることを確認してください。 4℃のマイクロチューブや店舗での500μlのボリュームに分割量注：必要に応じてボリュームを調整することができる。 </li><li>キャピラリー火かき棒をする。 0.9ミリメートルのキャピ​​ラリ管内のスーパー接着剤の滴を配置します。ラインの約3〜4 mmは、管の端部を越えて延びるようにキャピラリーチューブの内側に6ポンドテストモノフィラメント釣り糸4-5センチの長さを挿入します。 </li><li>試料ごとに2つの橋かけカバースリップをする。スーパーグルー22 X 22から1のカバーガラス24×60から1、カバーガラスの各末端に真ん中の自由を残す。古い日未満の胚のためのシングル（エンドにつき1小さなカバーガラス）を作る、一から四Dは胚について（終了ごとに互いの上に2つの小さなカバーガラス）倍に胚5日またはそれ以上の年齢の古いAYS、またはトリプル（エンドにつき互いの上に3つの小さなカバーガラス）。 </li><li>高真空グリースで10ミリリットルの注射器を埋める。注：真空グリースは、長期間にわたって標本の脱水を防止するためのシール材として機能し、より揮発性のシーラントに比べて毒性の低い可能性を有する。 </li></ol> 3。共焦点顕微鏡用の取り付けゼブラフィッシュ胚（図1を参照してください） <ol><li>麻酔メディアを準備します。完全に液体になるまで20秒間隔で電子レンジで0.2％アガロースの一定量を溶かす。 0.2％アガロースの195μLに0.2％アガロースまたは4グラム/ Lのチョウジ油の5μlを192μLに、MS-222の8μLを混ぜる。 42℃の加熱ブロックに維持する。注意：MS-222への長時間露光が胚ゼブラフィッシュ24で行いチョウジ油よりも強い発達の遅れの原因となる。 </li><li>必要に応じて手動で孵化していないトランスジェニック胚は、直前に分析するために分析されるようにdechorionate。鉗子を用いて、ゆっくりテ胚が解放されるまで営業絨毛膜AR。 </li><li>ゼブラフィッシュ胚を麻酔。胚培地24 mlに、MS-222の4グラム/ Lの株式の1ミリリットルを追加します。代わりに、魚の水24の24ミリリットルに4グラム/ Lのチョウジ油の390μlを加える。注意：クローブ油が作用して、ゆっくりとそうタイムラプス顕微鏡検査前に、少なくとも15〜20分をこの手順を実行します。 </li><li>上向きの橋かけカバースリップの中心領域の周りに真空グリースのビードを配置します。ゆっくりと、そして橋やカバーガラスのエッジの内側に隣接しており、滑らかで連続的なビーズを作り、注射器の外に真空グリースを押してください。 </li><li>木製アプリケーターを用いて架橋したカバースリップの中央に4％のメチルセルロースの輪を広げた。 </li><li>画像化される胚を転送します。胚を麻酔されたときにガラスピペットにそれを作成する。胚がピペット内の液体の底に沈むことができるように垂直にピペットを保持する。アガロース溶液にピペットを移動し、胚がドロップすることができますアガロースに。液体を排出しないでください。 </li><li>試料を配置します。ピペットにいくつかのアガロース溶液および胚を描く。メチルセルロースの上にアガロース溶液の液滴で胚を追放。メチルセルロース上に下向きの胚を押して画像化のために必要に応じて胚を配向させる毛管ポーカーを使用してください。 </li><li>試料を密閉する。 <ol><li>下向きにし、取り付けられた1の上に1橋かけカバーガラスを配置します。ブリッジは、両方のカバーグラスに直接接触し、アガロースドロップシールを作るまでに挟まれたカバーガラスの両側に均等に力を加える。胚が適切に配向していることを確認してください。 </li><li>真空グリースビーズに亀裂や隙間を滑らかにガラスに沿って木製のアプリケーターをこする。エッジから余分なグリースを拭き取ってください。 </li></ol></li></ol> 4。トランスジェニックゼブラフィッシュ胚のタイムラプス共焦点イメージング （このプロトコルは、ツァイスLSM 710共焦点顕微鏡私たちのために最適化されていますZENイメージングソフトウェアをING、他のシステムで使用するために改変することができる。） <ol><li>機器をアクティブにします。共焦点顕微鏡と外部レーザー装置の電源をオンにします。共焦点顕微鏡に接続されたコンピュータの電源を入れます。オープンな共焦点イメージングソフトウェアおよび画像取得コントロールをアクティブにする &quot;スタートシステム」を選択します。 </li><li>加熱されたステージを準備します。共焦点顕微鏡のステージングプラットフォームを下げ、所定の位置からの対物レンズを移動させる。電子加熱段階で​​デフォルトのステージを交換してください。加熱された段階のためのコントローラの電源をオンにし、29.5℃で温度を設定</li><li>視野内の試験片を置きます。ステージ上に搭載試料を配置します。所定の位置に20倍の対物レンズを移動させ、ステージングプラットフォームを上げる。可視光発光体を活性化させ、接眼レンズに目を通す。視野内胚の頭を中央に配置します。 </li><li>実験の設定を定義します。 <ol><li>選択することにより、蛍光チャネルを活性化する検出されるべき蛍光波長チャネルごとにカラールックアップテーブル（LUT）を選択する。必要に応じて、必要なレーザ（RFP用など 561 nm）をオンにするソフトウェアで手動制御を使用しています。各蛍光チャネルに対して、600〜700の間に10.0レーザ強度​​と光電子増倍管電圧（HV又はゲイン）を設定する。 4に平均化し、16ビットのビット深度を設定します。 </li><li> zスタックおよび時系列のモジュールをアクティブにします。 5μm以下のZ分解能のためのピンホールを設定し、提案し、最適な距離に、Z間隔を設定します。 注意：一般的に、5〜Zの解像度は、個々の細胞の解決中に各zスタック画像は、特定の時点で胚の「スナップショット」のために十分迅速に収集することができます。平均値を下げると、画像あたりの時間の量を減少させる。 </li><li>画像間の所望の時間間隔（通常10〜20分）、実験の全体​​の長さを規定する。 </li></ol></li><li>位置設定情報。 <ol><li>ライブモードでカメラの電源を入れます。フォーカスを調整し、必要に応じて蛍光を見るためにレーザー強度を増加させる。必要に応じて、より広い視野のために0.6にデジタルズームを設定します。 </li><li>関心のあるすべての構造が表示され、前方に伸長背側とのための視野に余裕があるように、ステージの位置を決めます。蛍光の上限値と下限値の胚を通じて焦点を当てています。最初と最後のZ-スタックスライス位置、これらの制限を超えて少なくとも100μm以上に設定してください。 </li></ol></li><li>蛍光強度を最適化します。 <ol><li>インジケータを範囲に表示LUTを設定します。蛍光構造が今白く見えるべきであり、視野の残りの部分は、（無検出）青または黒である必要があります。 </li><li>ちょうど飽和場所の下のレベルにHV /ゲインを上げる（赤）の画素が表示されます。必要に応じて、バックグラウンドの大部分が（青色）が検出されないようにオフセットを調整。両方より小さいピンホール径の増加レーザー強度をDEFイメージを改善します。注initionが、レーザー強度は、生体組織を維持するために低く保たなければならない。 HV /ゲインとピンホール径を増加させた（&lt;5μm）を、一般的に増加し、レーザ強度​​よりも好ましい。 </li><li> 4にセットを平均化、タイムリーに画像を収集するのに十分な幅ピンホール径を保管してください。 Z-間隔は常にピンホール径の推奨最適な距離に設定する必要があります。異なる設定で、短いスキャン（平均= 1）を実行し、所望の解像度を実現する最小のレーザー強度を使用しています。 </li></ol></li><li>所望の時間のための実験を​​実施します。その後、加熱された段階から胚を削除して、徐々にカバースリップを分離する。 30ミリメートルペトリ皿に、EMでのカバーガラスや胚を沈める。ガラスピペットを使用すると、静かにカバーガラスの外胚を洗浄し、ペトリ皿からカバースリップを削除します。開発を継続するために28.5℃のインキュベーターに胚を置きます。 </li><li>成長を比較してください。実験の最後に、個々のZsがかかる同様に、実験の開始時に試料に上演されましたが、28.5℃のインキュベーター中で、EMで育ったアガロースマウント兄弟胚のタックイメージ。 </li><li>必要に応じて、咽頭のアーチを測定します。測定値は、いくつかの共焦点ソフトウェアスイートで行うことができる。ここに見出さ測定は、個々のフレームの。LSMファイルをインポートし、Z-投影することによってFiji25を用いて行った。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

タイムラプス共焦点顕微鏡は、開発の分析のための強力なツールです。ここでは、神経堤細胞を標識するトランスジェニックを用いて、重要なシグナル伝達経路のための変異体であるゼブラフィッシュにおける咽頭弓の形態形成を研究する方法の有用性を示す。組織レベルに加え分析では、時間経過の分析はまた、細胞スケール28で解析に適用可能である。多くの広く使用されている...

頭蓋顔面形態形成は、複数の細胞型の協調的相互作用を必要とする複雑な多段階プロセスである。頭蓋顔面骨格の大部分は神経堤細胞に由来し、その多くは、咽頭のアーチ1と呼ばれる一過性の構造に背側神経管から移行する必要があります。多くの組織と同様に、頭蓋顔面骨格の形態形成は、特定の発生時点での胚の静止画像によって理解することができるよりも複雑である。それは時間のかかる実行することであるが、in vivoでのタイムラプス顕微鏡は、発生中の胚の細胞や組織での連続に説明します。タイムラプスシリーズの各画像は他の人に文脈を貸すと、現象が発生する理由推測ではなく、その時点で何が起きているか推測に向けて研究者の動きを支援します。 in vivoイメージングではこのように実験的なアプローチのための強力な説明的なツールです形態形成を誘導する経路を分解。ゼブラフィッシュゼブラフィッシュは、脊椎動物の胚発生の人気遺伝モデルであり、形態形成のin vivoイメージングのために特に適しています。近代的な、遺伝子導入およびゲノム修飾のための便利な方法が急速にゼブラフィッシュ研究者に利用可能なツールの数を進めています。これらのツールは、遺伝子操作し、顕微鏡検査のため、既に堅牢な方法を強化します。ほぼすべての所望の遺伝的文脈で、ほぼすべての組織のin vivoイメージングはファンタジーより現実に近い。 咽頭のアーチの形態形成運動は、神経堤と隣接する上皮、外胚葉と内胚葉の両方の間の相互作用のシグナリングによって案内される。頭蓋顔面骨格要素の形態形成を推進するために必要である上皮で表現多数のシグナル伝達分子があります。これらのシグナル伝達分子の中では、ソニック·ザ·ヘッジホッグ（Shhは）は非常に重要であるFまたは頭蓋顔面の開発2-8。 SHHは、経口外胚葉および咽頭内胚葉2,6,9,10の両方で表される。内胚葉におけるShhの発現は、アーチ10、アーチ10内神経堤のパターニング、および頭蓋顔面骨格の11の成長の形態形成の動きを規制している。 BMPシグナル伝達は、頭蓋顔面の開発12のためにも極めて重要であると咽頭のアーチの形態形成を変更することがあります。 BMPシグナル伝達は、咽頭のアーチ13,14内堤の背/腹パターン形成を調節する。ゼブラフィッシュにおけるSmad5をの破壊は深刻な口蓋欠陥や正中線15に適切に融合するメッケル軟骨の障害が発生します。さらに、変異体はまた、正中線15で融合咽頭弓の要素番目の 2 番目、3番目 、時には4で、腹側軟骨要素の減少との融合を表示。これらの融合が強くBMPシグナル伝達は、これらの咽頭要素の形態形成を指示することを示唆している。 PDGFシグナル伝達は、頭蓋顔面の開発のために必要であるが、咽頭弓の形態形成における未知の役割を持っています。マウスやゼブラフィッシュPDGFRA変異体の両方が深いmidfacial分裂文形成16〜18を持っている。少なくともゼブラフィッシュでこのmidfacial分裂文形成は、適切な神経堤細胞の遊走16の故障が原因です。神経堤細胞は、咽頭のアーチを入力した後PDGFRAを発現し続ける。さらに、PDGFリガンドは、顔の上皮で発現され、咽頭のアーチ16,19,20内で、このようにPDGFシグナル伝達はまた移行後に咽頭弓の形態形成における役割を果たしている可能性があります。しかし、PDGFRA変異体におけるアーチが行われていない咽頭の形態形成の解析を行う。 ここでは、pharyngulのインビボ共焦点顕微鏡法で証明するステージトランスジェニックゼブラフィッシュとは、この期間内に咽頭のアーチの形態形成を説明します。我々はさらに、BMP、PDGF及びShhシグナル伝達経路を破壊する変異によって影響される組織の挙動を示す。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

タイムラプスイメージングは​​、形態形成の過程を直接観察を可能にした技術、あるいは形状の生成である。原因遺伝子操作への光学的透明度と従順に、ゼブラフィッシュ胚は生きている胚における形態形成の経時的分析を行うことで人気のモデル生物となっています。ライブゼブラフィッシュ胚の共焦点イメージングは​​、対象となる組織が持続的な導入遺伝子または注入された色素、蛍光マーカーで標識されている必要があります。プロセスは、胚が健全な発展が正常に進行するように麻酔し、所定の位置に保持されることを要求する。画像化のためのパラメータは、三次元成長を考慮して設定する必要があり、開発の迅速なスナップショットを取得している間に個々の細胞の解決の要求のバランスを取る。我々の結果は、蛍光標識されたゼブラフィッシュ胚のインビボイメージングにおける長期を実行し、多様な組織における行動を検出するための能力を実証頭蓋顔面異常を引き起こす頭蓋神経堤。麻酔および取り付けに起因する発達の遅れは最小限であり、胚はプロセスによって無傷である。タイムラプス画像化された胚を液体培地に戻され、その後、画像化や開発の後のポイントで固定することができる。トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の増加量および十分に特徴付けられた運命のマッピングや移植技術を用いて、任意の所望の組織を画像化することは可能です。このように、in vivoイメージングの経時は、変異型とマイクロインジェクションされた胚の分析を含めたゼブラフィッシュ遺伝的方法で強力に兼ね備えています。

吻側方向（ 動画1）に移動しながら、野生型胚において、神経堤人口以下、咽頭のアーチは、前方/後方背側/腹軸に沿って細長く。 30時間後に受精（HPF）において、第咽頭弓の前方/後方の長さは、1.8〜1.9倍の背側/腹側の高さの間である。背側/腹側伸びが速く36.5 HPFまで、前方/後方の拡張よりも、着実に進む。ここから、背側/腹側の高さの高原の周りに104程度48 HPFを通して。前方...

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Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

タイムラプス共焦点イメージングは​​、胚発生を特徴づけるための有用な強力な技術である。ここでは、方法論を記述し、野生型では頭蓋顔面形態形成を特徴づけるとともに、PDGFRA、Smad5を、そしてSMO変異胚。

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K ビュー.  The University of Texas at Austin. タイムラプス共焦点イメージングは​​、胚発生を特徴づけるための有用な強力な技術である。ここでは、方法論を記述し、野生型では頭蓋顔面形態形成を特徴づけるとともに、PDGFRA、Smad5を、そしてSMO変異胚。 

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

顔面間葉のエレクトロポレーション

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

酵母の4D顕微鏡検査

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...