この方法では、酵母細胞の構造を何分間かかまた3次元で追跡し、細胞内小器官やコンパートメントの動態を研究することができます。4Dイメージングは、特に一過性の構造やマーカーに関する細胞内ダイナミクスに関する信頼できる結論を導き出すことができることを保証します。手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるナタリー・ジョンソンです。
23°Cで、定義された非蛍光合成の5ミリリットル、またはNSD、培地、良好な高揚質を有する15ミリリットルのバッフルフラスコに関心のある酵母株の一晩培養を成長させることから始める。分析の3〜4時間前に、新しいNSD培地で対数相酵母培養を希釈し、600ナノメートル(OD600)で最終的な光学密度がイメージング時に0.5〜0.8になるようにします。培養の準備が整う少なくとも1時間前に、遠心分離機は、全速力で5分間、コンカナバリンA溶液あたり2ミリグラムのアリコートを全速力でペレットし、250マイクロリットルの上清をきれいな35ミリメートルガラス底顕微鏡皿に加える。
15分後、1回の蒸留水を2ミリリットルで2~3回洗浄し、乾燥後にコンカナリンAコーティング皿に250マイクロリットルの酵母培養液を加える。細胞が付着するまで10分間待ち、新鮮なNSD培地を2ミリリットルで皿をさらに2〜3回静かに洗います。その後、新鮮なNSDの2ミリリットルで細胞をカバー.
酵母細胞を画像化するには、共焦点光顕微鏡上で少なくとも1.4の開口を持つ63X油浸漬レンズを選択します。ここでは、63X対物レンズの代わりに100X対物レンズを使用することもできます。次に、液浸油で見つけた物を対物レンズの上に置きます。
取得モードタブのドロップダウンメニューから、xyztを選択します。[XY] タブで、フレーム サイズを高さ 256 x 128 にフォーマットします。最大スキャン速度は、通常は 8 キロヘルツの順序で使用します。
双方向の X スキャンが使用可能な場合はオンにし、ズーム倍率を 9 に調整すると、ピクセル サイズは約 80 ナノメートルになります。100Xの目標を使用する場合は、ズーム倍率を調整して、約80ナノメートルのピクセルサイズを維持します。次に、行の累積を 4 つまたは 6 に設定します。
ピンホールを 1.2 風通しユニットに設定し、可能であれば白色光レーザーをオンにします。次に、励起波長とパーセントレーザーパワーを各蛍光チャネルに設定します。使用可能な場合は、最大統合時間の選択を解除して、設定タブでフォトンカウントモードの使用を有効にします。
各蛍光チャネルに対して、高感度検出器を割り当て、発光波長範囲を設定し、光子カウントモードをオンにします(可能な場合)。ガラス皿から反射光を取り込まないように、各蛍光チャネルの時間計数を0.6~10ナノ秒に設定します。次に、明視野イメージングをオンにし、データ収集用に低感度検出器を選択します。
ライブイメージングモードをオンにし、セルがはっきりと見えるまで明るいフィールドチャンネルのゲインを上げます。フォトンカウントモードの場合は、グレー値の範囲を手動から自動に変更して、蛍光信号を表示します。Zスタックを設定して酵母細胞の全容を画像化し、下がカバースリップに向かって移動するようにイメージングの方向性を指定します。
Z-スタックあたり約20~25の光セクションを得るために、Zステップ間隔を0.25~0.35マイクロメートルに設定し、使用可能であればガルボフローをオンにします。一般的なムービーでは、Z スタック間の時間間隔を 2 秒に設定し、ムービーの再生時間を 5 ~ 10 分に設定します。その後、ムービーを LIF ファイルとして保存します。
映画のデコンボリューションの場合は、古典的な最尤推定アルゴリズムを使用する適切なデコンボリューションソフトウェアプログラムを起動し、データシリーズを開きます。デコンボリューション ウィザードとパラメータ エディタを選択して、イメージング パラメータが検出され、正しく表示されていることを確認します。埋め込み培地屈折率の値を1.4に変更して、酵母細胞質に近似します。
次に、エディタを使用してカバースリップ位置を推定します。[検証済みをすべて設定] を選択して[承諾]をクリックし、[入力ウィザード]を選択します。次の矢印をクリックして、ポイントスプレッド関数の選択とトリミング前処理ステージをバイパスし、各蛍光チャネルのデコンボリューションウィザードを進みます。
計算対数垂直マッピング関数を選択し、生データ蛍光強度プロファイルを検査します。手動をバックグラウンド推定のモードとして設定し、バックグラウンド値を入力して[承認]をクリックします。最大反復回数の値を 40 のままにして、推定信号対ノイズ比を入力します。
次に、漂白剤補正をオフにして、[デコンボルブ]をクリックします。ノイズが薄暗い構造から本物の蛍光を除去せずに十分に除去された場合、デコンボリューション結果ウィンドウで次のチャネルに受け入れるを選択します。すべての蛍光チャネルが十分にデコンボルブされたら、[すべて完了]をクリックし、最初に赤チャンネルを配置し、次に緑、青、明るいフィールドチャネルを配置して、ImageJでのその後の編集を行います。
その後、イメージ シーケンスを 8 ビット TIF ファイルとして保存し、チャンネルごとに 1 つのファイルを選択し、変換モードとしてストレッチをコントラストします。漂白剤補正の場合は、デコンボルブされたイメージシーケンスを ImageJ にインポートし、[イメージ]、[ハイパースタック]、[スタックからハイパースタック] の順にクリックして、イメージをハイパースタックに変換します。ドロップダウンメニューからxyzctを選択し、チャンネル数、Zスタックスライス、および時間枠を入力します。
写真の漂白のための蛍光チャネルを補正するには、画像、色、スプリットチャンネル、および蛍光チャンネルを選択し、プラグイン、EMBLツール、漂白剤補正、および指数フィットを選択します。次に、[画像]、[カラー]、[チャンネルの結合] を選択して、明るいフィールドと漂白補正された蛍光チャンネルをハイパースタックにマージし、その後のムービー生成と編集のためにデコンボルブと漂白補正されたハイパースタックを 8 ビット TIF ファイルとして保存します。デコンボルブおよび漂白補正されたデータセットをスケールされたモンタージュに変換するには、[プラグイン]、[IJ_Plugins]、[モンタージュシリーズを作成]を選択し、関連する8ビットハイパースタックを選択します。
[開く] をクリックし、[OK] をクリックしてすべてのスライスを使用してモンタージュを作成し、もう一度 [OK] をクリックして推奨される尺度係数の値を受け入れます。8ビットTIFファイルとして元のモンタージュを保存し、プラグイン、IJ_Plugins、ハイパースタックとOKにモンタージュシリーズを選択し、すべての時間枠を含む元のモンタージュから4Dハイパースタックを作成します。元の平均投影ムービーを生成するには、まずプラグイン、IJ_Plugins、プロジェクトハイパースタック、およびOKを選択して ZProjection のデフォルトパラメータを受け入れます。
平均投影ムービーを 8 ビットの TIF ファイルとして保存し、ムービーを検査して、ラベリング期間内に追跡できる個々の構造を特定します。ムービーの再生中に確実に追跡できる構造を特定し、その構造を分析用に分離することは、この手順の最も重要なステップです。次に、プラグインのユーザーガイドの指示に従って、モンタージュを編集して目的の構造を分離します。
対象の構造を含む期間の編集されたモンタージュから4Dハイパースタックを作成し、編集したハイパースタックを保存します。編集した4Dハイパースタック内の孤立した構造の蛍光強度を時間の経過とともに定量化するには、「プラグイン、IJ_Plugins、編集済みムービーの分析」を選択し、Zスタック間の時間間隔を入力して、「OK」をクリックします。分離構造の最終的なムービーを作成するには、[プラグイン]、[IJ_Plugins]、[プロジェクトハイパースタック] を選択し、含める Z スタック スライスを指定し、[投影タイプ] として [平均強度] を選択して、[OK] をクリックします。編集したデータに対して元のデータを含む4Dハイパースタックを作成するには、プラグイン、IJ_Plugins、2つのハイパースタックをマージし、最初に2つ上に配置します。編集したデータに対してオリジナルデータを含む4Dハイパースタックからムービーを生成するには、「プラグイン」「IJ_Plugins」「プロジェクトハイパースタック」を選択し、含めるZスタックスライスを指定し、投影タイプとして「平均強度」を選択して、「OK」をクリックします。ここで、生データのZスタック投影の第1フレームを、同じデコンボルブおよび漂白補正データと比較することができる。
同じデコンボルブおよび漂白剤補正されたムービーからのこれらのフレームは、分析された2つのシスタンナを示し、最初に緑色のバナデート耐性グリコシル化タンパク質4またはVrg4マーカーで標識し、後に赤い分泌7またはSec7遺伝子輸送タンパク質マーカーを用いた。このモンタージュは、デコンボルブと漂白剤補正されたハイパースタックから作成され、編集前と編集後の単一の時点ですべての光学セクションを表示し、選択されたシステルナエのいずれかから信号を分離できるようにします。この図では、投影された Z スタックの最終ムービーのフレームが、図の上部にオリジナルの投影と下部に編集された投影で表示されます。
選択されたゴルジ・シスタンネからの緑色および赤色蛍光シグナルの定量化により、緑色のVrg4マーカーが到着し、約80秒間持続し、その後、赤いSec7マーカーが到着し、約60秒間持続し、2つのマーカー間に短い重なりが生じます。この手順を実行する場合は、有効期間を通じて明確に追跡できる構造を特定することが重要です。同じタイプの分析は、突然変異または他のタイプの特異的摂動を行った後に行うことができる。
この技術は、酵母をモデルシステムとして使用して、ゴルジシステルネおよび小胞子出口部位の動的挙動を研究する道を開いた。
