これは、ニコチアナ・ベンタミアナ植物に関連するタバコでGFPに融合した組換えヒトIgGの発現、抽出、精製のための簡単な方法のデモンストレーションである。このプロトコルは、植物産生抗体、抗体融合、およびカラムクロマトグラフィーを通じて精製できるほとんどのタンパク質の精製と可視化に利用できます。このプロトコルは、大学の研究ラボの研究者や学生がタンパク質の生産プロセスのほとんどのステップでGFPタグ付きタンパク質を視覚化することを可能にします。
トレイに土壌泥炭ペレットを置き、完全に拡張するために泥炭ペレットの上に沸騰した、まだお湯を注ぎます。ペレットは完全に拡大するのに数分かかります。パレットを完全に拡張した後、ピンセットを使用して各泥炭ペレットに2〜3ニコチアナベンタミアナシードを置きます。
これが完了したら、トレイの底部を覆うために約0.5インチの水を注ぐ必要があります。シーディング日にトレイにラベルを付けることを忘れないでください。適切な量の肥料で毎日苗に水を与え続けます。
トレイはフミドームの上で覆われ、成長室に置く必要があります。シード泥炭ペレットは、16時間の写真期間と60%の相対湿度で23〜25°Cの成長室に保管する必要があります。1週間後、1つの苗だけで各ピートパレットを残してペレットから余分な植物を取り除きます。
植物が2〜3週間生きている場合は、各泥炭ペレットを水分制御土壌を含む個々のポットに移します。1リットルの肥料で毎日水の苗を続け、完全に乾燥した土壌を残すことはありません。植物は生後5~6週間で浸潤する準備ができています。
次の手順は、ブンゼンバーナーの隣に行う必要があり、基本的な無菌技術は、汚染を避けるために適用する必要があります。Lb カナマイシン プレートが必要です。1ミリリットルカナマイシン濃度あたり1マイクログラム。
あなたの望むカナマイシン耐性構造を収容し、一晩成長する2つの突然変異EHA105と厳格。EHA105は、アグロバクテリウム2突然変異の最も一般的に使用される株の1つである。培養を開始するには、10ミリリットルのlb培地で円錐管を充填し、次に、1ミリリットルカナマイシンあたり100マイクログラムの10マイクロリットルで、リファンピシン1ミリリットル当たり10マイクロリットルの10マイクロリットルを加えて大腸菌汚染を防ぐこともできます。
プレートから、PCR によって検証された単一の分離コロニーを使用して、新しい文化を成長させます。あなたの孤立したコロニーを選択し、lbにそれを接種します。シェーカーに接種を置きます。
摂氏30度、120~150RPMで一晩インキュベートする。翌日、アグロバクテリウム培養物が0.6〜0.9に等しいOD600に引き寄せられた場合、浸潤に使用することができる。それは1〜2ミリリットル以上の成長したOD600は、抗生物質で新鮮なlbに移され、必要なOD600に成長する必要があります。
適切なOD600に一度遠心分離機に培養物を配置し、遠心分離機のバランスを取っていることを確認します。4,500Gで常温で20分間遠心分離して菌をペルトする。彼らは両方のサンプルから上華することはできません。
次に、各ペレットと 1 つの X 浸潤バッファーを再中断して、最終 OD を 0.4 にします。各IgG融合構造の等しい体積を軽鎖構造と組み合わせて、各チューブ内の構築ごとに0.2の最終ODを得る。ステップ1からペーパークリップと生後5〜6週間とベンタミアナ植物を取ります。
クリップの鋭いエッジを展開して、葉の最初の表皮層に小さな穿刺を行います。葉をずっと穿刺しないようにしてください。ステップ2から調製されたアグロバクテリウム溶液で取り付けられた針なしで1ミリリットルの注射器を充填する。
前のステップで作成した穴を、スポイトの端で覆います。そして、葉の後ろから穏やかなカウンター圧力を加えながら、葉に細菌を注入するためにゆっくりとプッシュします。葉の大部分に浸透し、葉を最大3〜4回突くようにすると、余分な葉の損傷がタンパク質の収率を妨げる可能性があります。
注射器にあまり圧力をかけることなく溶液を注入するので、葉が暗くなります。浸潤した植物の葉は、下のビューからほとんど暗く表示されます。この細菌溶液は、1つの構成体につき少なくとも3〜4つの植物に十分であるべきであることに注意してください。
廃棄する前に残りの細菌溶液をオートクレーブする。針なしの浸潤を終えた後、植物を成長室に戻し、毎日水を続けます。クロロシス、壊死、GFP蛍光、冬の長く短波UVランプの葉を観察しました。
通常、4日目と5日目に出発すると、最高のGFP蛍光を示します。浸潤後4~5日で全ての葉を収穫し、葉材の総量を量る。葉材は、下流の処理にすぐに使用することも、浸入した植物を成長室に戻して毎日水を続ける準備ができるまで、マイナス80°Cで凍結することもできます。
浸潤領域でクロロシス、壊死、色や葉組織死の変化のための葉を観察しました。GFP蛍光の観察植物。GFPが長くて短い波のUVランプの下に存在する場合。
タンパク質発現は時間の経過とともに増加し、両方のGFP構築物の蛍光が最も高く、一般的に4日目から5日目の間に起こる。浸潤後4~5日ですべての葉を収穫し、葉材の総重量を量る。下流のプロセスにすぐに使用するか、使用する準備ができるまでマイナス80°Cで凍結します。
ブレンドプロセス中は、使用前にバッファーとブレンダーカップを氷の上または摂氏4度に保つようにしてください。ステップ4から植物組織を公判前ブレンダーカップに入れる。各PMSF及びアスコルビン酸ナトリウムを含む冷蔵抽出緩衝液をブレンダーカップに含む。
ブレンダーカップをブレンダーに置き、パラフィルムのプレカットシートを取り、ブレンダーカップの上に伸ばします。葉の組織を抽出バッファーとブレンドして、80 を 22 区間で想像します。必要に応じてブレンドサイクルの間によくかき混ぜる必要があります。
混合物は、葉材料の塊なしで均質に見えるはずです。ブレンドされた材料をビーカーに移します。攪拌バーで、タンパク質の溶解性を高め、固体の沈殿を可能にするために30分間摂氏4度をかき混ぜます。
氷の上のきれいなビーカーの上に裸の布の2つの層を置き、大きな葉の破片を取り除くためにそれを通して抽出物を注ぎます。すべての抽出物をミラークロスに流し込んだ後、ミラークロスを折り畳んで残りの葉エキスを絞ります。抽出は、目に見える微粒子なしで濃い緑色に表示されるはずです。
抽出物を遠心管に移します。16,000Gsで摂氏4度で20分間遠心分離します。これは、任意の残りの不溶性材料をペレットします。
両方のチューブがバランスが取れていることを確認し、ローターの蓋がしっかりと締め付けられるようにします。遠心分離後、ペレットは、上清と言って、ペレットを捨てる、目に見える必要があります。50ミリリットルのシリンジとガラス繊維フィルターを使用して上清をフィルター処理します。
サンプルを50マイクロリットル回収し、後で分析するために粗抽出物をラベル付けします。20ミリリットルのサンプルを保持するポリプロピレンカラムを設置します。ターゲット免疫グロブリンの種類と樹脂に対する親和性に応じて必要なスラリーの量を推定します。
このデモでは、3ミリリットルのスラリーを使用します。一般に、1.5ミリリットルのベッド体積を有する総スラリーの3ミリリットルは、数ミリグラムの抗体の精製に有効である。キャップされたカラムに必要な量の再懸濁ススラリーを慎重にピペットします。
列の下部から列の出口を開き、バッファーの大部分がなくなるまでドレインできるようにします。すぐに10ミリリットルの洗浄バッファーを1回PBS上に注ぎます。水気を切り、この洗浄ステップを2回繰り返します。
ステップ 5 からフィルター処理されたサンプルを列に適用し、フロースルーを収集します。後で分析するためのフロースルーのアリコート50マイクロリットル。抗体が樹脂に結合しなかった場合に備えて、残りのフロースルーを保存します。
樹脂を10ミリリットルのPBSで2回洗浄し、非特異的結合を低減します。所望ならば、アリコート50マイクロリットルの洗浄は、バッファーがカラムを通って流出し、標的抗体が洗浄緩衝液でほのめかされないことを確認する。洗浄バッファーが樹脂を通って実行されている間に、セットアップし、溶出バッファーを中和するためにpH 8で1モルトリスHCL、無菌の125マイクロリットルで5マイクロ遠心管を設定し、ラベルを付けます。
あるいは、より濃縮された溶出物を得るために2つの臼歯のベースの30マイクロリットルを加える。溶出の間、UVライトは視覚化のために使用されるかもしれない。これは溶出の間行われる必要はない。
UVを使用している場合は、目や皮膚への損傷を避けるために適切な個人用保護具を着用してください。UV ライトは溶出工程で使用する必要はありません。5ミリリットルの溶出バッファーをカラムに塗布し、1ミリリットル分の分を収集して、前のステップから各指定チューブに抗体を溶出させる。
すぐに20ミリリットルを塗布し、続いて10ミリリットルの洗浄バッファーを適用することによってカラムを再生します。樹脂が酸性環境に長期間放置されていないことを確認します。溶出は蛍光を現すはずです。
蛍光が最も高いのは第2溶出で見られるが、抽出から抽出まで変化する。貯蔵のために、20%エタノールおよびPBSの10ミリリットルで樹脂を洗浄し、途中で水切りさせます。上部を要約し、次にカラムの底部を要約し、4度C.280ナノメートルで吸光度を測定することによって、フォト分光計を使用して抗体濃度を決定します。
溶出液をマイナス80°Cで保存し、各分画の50マイクロリットルを別々のチューブにアリコートして、さらなる分析を行います。一般的にタンパク質の持続時間は、効率の大幅な損失なしに10回まで再利用することができます。280ナノメートルでの吸光度を測定して分光光度計を使用して、特定の詳細については、メーカーのガイドラインを参照してください。
溶出液をマイナス80°Cで保存し、各分画の50マイクロリットルを別々のチューブにアリコートして、さらなる分析を行います。Zsページによる精製タンパク質の分析は、標準プロトコルに従うことによって行うことができます。GFPを含む構築物のクローニング、浸潤および発現の成功を示す結果として蛍光を観察した。
数日の間に、蛍光は4日目と5日目に高い蛍光とともに徐々に増加するはずです。タンパク質Gが使用される場合、カラムからの蛍光タンパク質結合およびそれに続く溶出は、安定なGFPとして含有するIgG融合の精製を示す。UV露出ゲルと、ラダーの25KDaと75KDaのバンドのみを見ることができます。
また、非溶出2サンプルも見ることができる。非減少溶出は、その安定したGFP融合として無傷のIgGから期待される相対的なサイズとして、その蛍光を保持します。クマシー染色ゲルでは、還元されたサンプルと非還元サンプルの両方が可視化される。
すべてのラダー成分が目に見え、天然タンパク質とIgG融合は、サンプルを通して総抽出物上清および流れで見ることができます。洗浄には少量のIgG融合が含まれています。溶出1および4は、ほとんどのタンパク質が一般的に第2および第3の溶出ステップから排除されるように、予想されるように、より少ない濃縮タンパク質を含んでいた。
溶出2非還元は、全ての還元溶出サンプルに複数のバンドが存在することもわかる。75KDaは、GFPに重鎖ヒューズを示す。50KDaは単独で重鎖を示し、25KDaは軽鎖単独を示し、10KDAはプロテアーゼ阻害剤の添加によって防止できる劣化を示す可能性が高い。
このプロトコルは、任意の所望の標的タンパク質に融合した任意の抗体の精製に使用することができる。このプロセスは、さまざまな量の葉材料に対応するように編集することができ、また、タンパク質抽出および精製プロセスの前、中、および終了後にタンパク質存在の視覚的決定を可能にする。これらの方法は、コントロールとして有用であり、技術を教えるための目的となり得る。
