私たちは、博士に感謝します。 Erezさんエリヤフ、ダニエル·メラメド、Ophry松やドロンラパポートこのプロトコルの確立中助けとコメント。この作品は、ISF（承認番号が1193年から1109年）によって資金を供給される。

1。ミトコンドリア精製細胞のペレットを計量。おおよそ0.6グラムを100mlの細胞から得られる。 <ol><li> 30で600 = 1-1.5にOD酵母細胞100〜150ミリリットルの成長 ミトコンドリアを濃縮するために、このようなガラクトースベースの成長培地として非発酵増殖培地上℃、、。 </li><li>室温で5分間3000×gで遠心分離細胞、上清を捨てる。 </li><li>再び蒸留水と遠心でペレットを洗浄。上清を捨てる。 </li><li>細胞の0.5グラム当たり1ミリリットルのDTTバッファーでペレットを再懸濁します。それにより、加水分解性を向上させる、細胞壁内のジスルフィド結合を破壊するために、還元剤で細胞を処理することが重要である。 </li><li> 30℃で10分間、細胞をインキュベート 穏やかに振盪しながら℃で。一方、細胞の1グラム当たり6ミリグラムザイモリアーゼを比較検討し、ザイモリアーゼバッファに一時停止。 </li><li> 5分A用3000×gで遠心分離細胞Tの室温、上清を捨てる。 </li><li>細胞の0.15グラム当たり1ミリリットルザイモリアーゼバッファーでペレットを再懸濁します。ボルテックスを行います。 </li><li>水990μLでの細胞の10μlアリコートのOD 600を測定します。 </li><li> β-1、3 - グルカン結合のグルコースポリマーを加水分解し、フェロプラストを生成する細胞にザイモリアーゼ（ステップ1.5）を追加します。この工程から、スフェロプラストは、溶解を避けるために等張溶液中に維持されるべきである。 </li><li>穏やかに振とうしながら30℃（ザイモリアーゼの最適活性のための）で15分間細胞をインキュベートします。細胞壁の加水分解およびフェロプラストの発生を確認するには、水を990μlの細胞を10μlを混ぜる。スフェロプラストは、浸透圧の差に溶解するために期待され、OD 600は、少なくとも、ステップ1.9で決定された値未満の10倍されるべきである。そうでない場合は、さらに15分間ザイモリアーゼとのインキュベーションを続ける。 </li><li>室温で5分間、3,000×gで遠心分離細胞。慎重にDISカード上清を、ペレットとして不安定になることがあります。 </li><li>ザイモリアーゼBufferでフェロプラストを洗浄し、上清を捨てる。 </li><li> 100ミリリットルの回復培地でフェロプラストを懸濁します。三角フラスコにフェロプラストを移し、30℃で1時間インキュベート 振とうしながら、Cを°。ザイモリアーゼ治療翻訳中に逮捕され、mRNAの局在が（ 図1B）破壊されたため、この回復手順が必要です。 </li><li>予備冷却50ミリリットルコニカルチューブに0.1 mg / mlのCHXおよび転送フェロプラストを追加します。 CHXの添加は、mRNAとリボソーム協会を凍結することが重要です。このように、ミトコンドリアとリボソーム依存mRNAの関連付けが維持されている。 </li><li>遠心機は、4℃で5分間3000×gでフェロプラスト、上清を捨てる。 </li><li>冷たいマンニトール緩衝液で2回洗浄します。 </li><li> 4ミリリットル冷たいマンニトールBufferでフェロプラストを再懸濁し、タイトなフィットを搭載した15ミリリットルの容量のダウンスホモジナイザーに転送乳棒。優しく15ストロークでフェロプラストを破り、13ミリリットルチューブに溶解液を移す。 </li><li>核および破壊されていない細胞をペレット化し、4℃で6分間1500×gで溶解液を遠心分離する。 </li><li>慎重に新しいチューブに上清を移す。未分画サンプル（「合計」サンプル）として確保サンプルの1ミリリットル（25％）を設定します。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「合計」のサンプルの残りからの沈殿物のRNA（プロトコル3、RNAの沈殿を参照してください）​​。 </li><li> 4時10分、10,000×gで上清を遠心分離 ミトコンドリアをペレット化°C。 </li><li>新しいチューブに上清（〜3ミリリットル）を転送し、氷の上に保管してください。これは、「細胞質」画分である。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「細胞質」は、試料の残りからの沈殿物のRNA（Protのを参照してください。ocol 3、RNA沈殿）。 </li><li> 4℃で10分間万×gで再び3ミリリットルマンニトールバッファと遠心でペレットを洗浄</li><li> 3ミリリットルマンニトールバッファーでペレットを再懸濁します。このサンプルでは、ミトコンドリアが含まれ、「ミトコンドリア」画分と呼ぶ。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 </li></ol> 2。 RNA抽出<ol><li> 8 MグアニジンHClおよび100％エタノールの2容積の各サンプル1ボリュームに追加。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、 </li><li> 4で20分間万×gで遠心分離サンプル ℃、上清を捨てる。ペレットが不安定になる可能性があるため注意が必要です。 </li><li> 70％エタノールでペレットを洗浄。 </li><li> RNaseフリー水400mlでペレットを再懸濁し、新しいエッペンドルフチュー​​ブに試料を移す。 </li><li> 3 Mナトリウムacetatの0.1容量を追加することで、再びRNAを沈殿E pHは5.2〜100％エタノール2容量の。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、 </li><li> 4℃で20分間、20,000×gで遠心分離サンプル上清を捨て、70％エタノールで洗浄する。 </li><li>空気がペレットを乾燥し、RNaseフリー水で懸濁します。 -80で保存RNAサンプル ℃、試料は、ノーザン分析19またはマイクロアレイ分析18（プロトコル3を参照）のために使用することができる。 </li></ol> 3。マイクロアレイ解析のためのRNAの準備<ol><li> RNaseフリー水650ミリリットルと歩調2.2からmRNAを懸濁します。 </li><li>積極的にクロロホルム（5:1、pHは4.7）とボルテックス：残留DNAまたはタンパク質を除去するために、等しい酸性フェノールの量（650ミリリットル）を追加します。 2分間最大速度で遠心分離する。 </li><li>新しいチューブに上相（水相）の500ミリリットルを転送します。それは、DNAが含まれているように、相間を取ることは避けてください。また、逆転写反応を阻害することができるフェノール、服用に注意してください。&lt;/李&gt; <li> RNAサンプルは、逆転写酵素の強力な阻害剤であるヘパリンの有意な量を含有する。このように、RT-PCRまたはマイクロアレイ標識のためにそれを除去する必要がある。塩化リチウム沈殿によりヘパリンを除去します。2 Mの最終濃度に塩化リチウムを追加し、-20℃で一晩サンプルをインキュベート ℃、 </li><li> 4でサンプルを解凍 ℃〜4℃で20分間、20,000×gで遠心</li><li>慎重に上清を廃棄し、80％エタノールでペレットを洗浄。ステップ3.5で説明したように再び遠心します。 </li><li>上清を捨て、空気乾燥およびRNaseフリー水150ミリリットル中にペレットを再懸濁します。 </li><li>任意の残留のLiClを除去するために、3 M酢酸ナトリウムpHが5.3体積の0.1〜100％エタノールを3倍量で再び沈殿させる。 -20でインキュベートする 少なくとも2時間、Cと°。 </li><li> 4で20分間最高速度で遠心 ℃、 80％エタノール、空気乾燥で慎重に透明なペレットを洗浄。 </li><li>再懸濁を25mlのRNaseフリー水を用いてペレット化し、-80℃で試料を維持 ℃、 </li><li> 18,20で説明したRNA標識およびハイブリダイゼーションのための手順に従ってください。 </li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

画像内の科学技術の進歩は、mRNAの局在を研究するため、高解像度のツールが得られていた。今日、人はミリ秒時間スケール23-26においても単一のmRNA分子の動きを測定することができる。しかし、上述のものなどの従来の生化学的アプローチもまた、有益であり、いくつかの場合に好適である。生化学的隔離はmRNAおよびタンパク質の大きなレパートリーの精製を可能にし、従って、ゲ...

真核細胞は、特定の機能を有する個別のコンパートメントで構成されています。その機能を実現するためには、各区画には、その活性に必須であるタンパク質の固有のセットが含まれています。これらのタンパク質は、そのコンパートメントにアプローチを通して可能なメカニズムは、ローカライズ、翻訳、1,2である。このプロセスにおいて、タンパク質は、そこに配置されるリボソームおよびmRNAにより目的地に合成される。ローカライズされた翻訳の可能性の利点の中で、タンパク質のターゲティングの効率を増加したタンパク質シャペロンの必要性が減少し、サイト固有の制御機構を可能にしています。また、ローカライズされたmRNAおよびリボソームは、一般的な翻訳が阻害される細胞ストレス、例に翻訳機構の人里離れた貯水池することができます。 ミトコンドリアは、近年ではローカライズされた翻訳を研究するための中心的なモデルとなりました。ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、核内に符号化された細胞質ゾルに翻訳され、および細胞小器官にインポート。証拠の様々な線は、これらのタンパク質の多くは局所変換プロセスを介して産生されることを示している。最初に、電子顕微鏡および生化学的分画研究は、ミトコンドリア3-5に関連したリボソームを検出しました。その後、共翻訳的に6,7にのみインポートすることが判明した特定のmRNA上の仕事によってin vivoで裏付けられ、これらの研究。ミトコンドリアでのmRNAの関連のゲノムワイドな研究では、mRNAのかなりの部分がミトコンドリア近傍8月10日に局在していることを明らかにした。これらのmRNAの一部はさらに、FISH又はMタグ9,11などのインビボ蛍光法によって特徴付けした。この関連の直接的な解釈は、これらのmRNAは、ローカライズされた翻訳のための鋳型として作用するということです。 これらのmRNAは、ミトコンドリアに接近するメカニズムは不明である。非コード領域（最もsignificantlyの3 &#39;のUTR）はミトコンドリア12 mRNAの会合に関与することが示された。これらのドメインは、それらの輸送​​を媒介するRNA結合タンパク質に対する結合部位として機能する可能性がある。酵母での研究では、タンパク質のPUMファミリーのメンバー（Puf3）はミトコンドリア8,13とmRNAの関連付けをサポートしていることを明らかにした。他の家族の機能に基づいておりPuf3、もっともらしい役割は、mRNAは、ルート 14 途中である間の翻訳を抑制することである。従って、mRNAは、非コード領域と相互作用するRNA結合タンパク質によって、非翻訳状態で輸送することができる。あるいは、作業の大きな体は、タンパク質が合成されている間輸送が生じることを示唆している。特に、翻訳阻害剤は、mRNAの会合8,13に影響を与えることが示された。さらに、このようなAUGをミトコンドリア標的化配列（MTS）またはORF領域として翻訳された特徴は、局在8,11,15を補助することが示された。 HSP70ファミリータンパク質のCHミトコンドリア外膜上aperoneおよびタンパク質受容体はさらに符号化されたタンパク質の機能は、mRNAの局在16にとって重要であることを示唆し、mRNAの関連付けをサポートすることが示された。これは、リボソームタンパク質はミトコンドリア新興17へのmRNA-リボソーム-タンパク質複合体を標的化するための認識要素として機能するモデルと一致する。 ミトコンドリアの近くの局在化、翻訳電子顕微鏡（リボソームを可視化するため）3、FISH 9、（特定のmRNAを検出するための）緑色RNA 11と、生化学的分画（RNAおよびリボソームの両方を検出する）10,18を含む様々な方法によって研究された。前者の方法は、インビボでの局在を検出し、トランスポート·ダイナミクスの可視化を可能にすることができるが、後者は単一の実験で多数の異なるmRNAの検出を可能にする。さらに、生化学的分画コードまたは非コードドメインの文献である必要はありませんteredは、したがって、それらの特定の役割を評価することができる。生化学的分画は正常に多くの異なる細胞区画の単離のために、長年にわたって使用されている。そのプリンシパルと制限は十分に確立され、人は簡単に様々な目的のために既存のプロトコルを変更することができます。必要な器具類は、したがって、それは通常、細胞内局在を研究するための選択の第一の方法で、多くのラボで標準です。私たちは、リボソームがミトコンドリアに関連しているながら、mRNAの単離のために最適化されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、したがって、ミトコンドリアの近くに局在し、翻訳に関与する因子を研究するために最適である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BactoPeptone</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Do not autoclave Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Growth medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 M TrisHCl pH9.4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mM TrisHCl pH7.6</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 mM DTT Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.2 M Sorbitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">4 mM KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">16 mM K2HPO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;m filter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Zymolyase Buffer&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this&#160; buffer (0.2&#956;m) and keep at room temperature for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Zymolyase 20T&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">20,000 U/gr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recovery medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.6 M Mannitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM MgAc</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM KCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5 mg/mL Heparin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mannitol Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8M Guanidinium-HCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;3 M Sodium Acetate pH5.2</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 M LiCl stock solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 mM Tris HCl pH 6.8</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Glycerol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenolblue</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;4xLSB</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% &#946;-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mrnas associated with yeast mitochondria to study mechanisms of localized translation

ミトコンドリアタンパク質の大部分は核内にエンコードされ、細胞小器官にインポートされる必要がある。タンパク質はミトコンドリアの近くに合成されている間、輸入が発生することがあります。この可能性のサポートは、ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAは、多くのミトコンドリア付近に局在することが示された最近の研究に由来する。一緒に外膜とのリボソーム協会の以前のデモで、これらの結果は、局所的な翻訳プロセスを示唆している。このような局所的な変換は、輸入の効率を向上させる独自の規制部位を提供し、異所性発現の例を最小にすることができる。多様な方法には​​、局所的な翻訳を媒介する因子および要素を特徴付けるために使用されてきた。これらの中で標準差動遠心分離によって細胞下分画である。このプロトコルは、単一の手順でのmRNA、リボソームとタンパク質の単離できるという利点がある。これらは、次いで、種々の分子と両性によって特徴付けることができるochemical方法。さらに、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス法は、それによってゲノムワイドな洞察を可能にし、得られた材料に適用することができる。そのような研究のためのモデル生物としての酵母の使用は、速度、費用および単純性の利点を有する。さらに、高度な遺伝学的ツールおよび使用可能な削除株が候補因子の検証を容易にします。

このプロトコルは、細胞質ゾルの構成要素からミトコンドリアを含む画分を分離することができます。その成功をテストする最良の方法は、別の単離段階からサ ​​ンプルにノーザン分析およびウエスタン分析（ 図1）を実行することです。アイソレーション特性のための3つのパラメータは、これらの分析に由来する。まず、サンプル中のRNAまたはタンパク質が無傷であるかど?...

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Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細胞に適用することができる。

ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K ビュー.  Technion - Israel Institute of Technology. ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細?...

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

酵母細胞からミトコンドリアの精製

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

の単離と精製ショウジョウバエ</em磁気ビーズソート別>末梢ニューロン

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージング<em&gt;インビボ</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

用いた無細胞アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚は、核サイズの規制のメカニズムを研究するために抽出します

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

ミトコンドリアの熱発生能力を研究するためのパッチクランプ技術の使用

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

げっ歯類の頭部に定義された加速度を生成するための受動的頭部運動の適用

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...