著者らは、このプロジェクトの中核と技術サポートを提供するための獣医薬のVA-MDリージョナルカレッジに感謝します。この作品は、NIHのキャリア開発賞（K01DK092355）でサポートされています。

すべての研究は、バージニア工科大学のための制度的管理使用委員会（IACUC）の承認の下や実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った。 1。口腔咽頭の管理ページを使用してLPSの気管内（IT）の接種<ol><li>各動物を一意に耳パンチ、耳標、またはその他の制度的に承認する方法のいずれかを使用して識別されていることを確認します。 </li><li>各動物についてベースライン体重および体温を記録する。 </li><li> LPSの作業用ストックを準備します。各マウスは、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中1 mg / kgのLPSを50μl量を受けるであろう。モック処置した動物は、1×PBSを50μlの線量を受け取ります。 </li><li>次のドロップ法を用いたイソフルランの投与のために適切な容器を準備します。施設のガイドラインには、イソフルラン及びその他の麻酔薬と前initiatへの使用に関して異なる場合どんな研究をING、人が十分に満たされているすべてのガイドラインを確実にするために動物実験/福祉の彼らの機関の部門に連絡してください。ドロップ法イソフルランを選択できない場合、他の麻酔剤は、許容される代替物である。 <ol><li>適切な安全キャビネット内で、500ミリリットルのビーカーの底に折り畳まれた吸収性の紙タオルと場所にイソフルランの約3ミリリットルを適用します。 </li><li>ペーパータオルの上にアルミニウム箔の小片を配置し、透明な蓋付きビーカーを覆う。 </li></ol></li><li>その接種の際に利用されるツールおよび試薬を準備します。挿管スタンドに頭の動物を確保するゴムバンドを配置します。この手順では、ストレートピンセット、角度のついた又は湾曲したピンセット、とヒントとP200のピペットが必要になります。 </li><li>挿管スタンドの横に容易にアクセス可能な場所にピペットチップ、所定の位置に負荷のLPSを50μl。 </li><li>マウスを麻酔イソフルラン室に動物を配置し、透明な蓋で容器を覆うことにより。第一室に置かれたとき、迅速かつ浅くされる、動物の呼吸パターンを観察します。呼吸率は通常、チャンバー内に配置する30秒以内に達成されている1息/ 2秒、近づくと動物が十分に麻酔をします。滴下法イソフルランを使用して承認された動物プロトコルに記載されているように、マウスを麻酔しなければならない。 </li><li>室から麻酔をかけたマウスを取り外し、フロント切歯によって挿管スタンドに動物を一時停止する。動物が確実に抑制し、口や舌がアクセス可能であることを確認してください。 </li><li>優しくストレートピンセットで舌を固定します。角度のついた鉗子で舌をつかみ、若干の抵抗が感じられるまでゆっくりと口から引き出します。このアクションは、喉頭蓋をブロックし、気管へのアクセスを得るために十分である。 </li><li>に舌を押したまま延長された位置は、喉の奥にLPSを50μlの用量を投与し、すぐに手袋をはめた指で、動物の鼻の穴をカバーしています。マウスが吸入されるまでLPSは、喉の奥に表示されます。 </li><li>鼻の穴をカバーし、5月10日追加の呼吸のために拡張舌を押し続けます。 </li><li>挿管スタンドからマウスを取り外して、麻酔から回復するまで戻って新しいケージに動物を配置します。 </li><li>疾患の進行に関連する代理マーカーを監視します。体重および体温研究の期間毎に4-8時間を監視すべきである。同様に、行動特性の増加罹患率と関連する臨床症状を評価する。 </li><li> LPS暴露後の特定の時点で疾患の進行、収穫マウスを評価した。 LPS曝露後の収穫のための典型的な時点は0、6、12、18、24、および48時間が含まれています。回復および生存率を評価するために、7 DA用のマウスを評価YS接種後。 </li></ol> 2。血清および気管支肺胞洗浄液（BALF）コレクション<ol><li>制度的に承認された方法を使用して、マウスを生け贄に捧げる。 </li><li>その裏に動物を置き、高さ（1.27cm）の中で、理想的に0.5、剖検ボードに固定します。 </li><li> 70％エタノールでマウス全体を濡らす。 </li><li> 27 Gの針を有する1ミリリットルの注射器を使用して、前に任意の切開を行うに心臓穿刺を行っています。これは、単一のマウスから全血の500〜800μLを撤回することが可能なはずである。 </li><li>注射器から針を外し、前標識1.5ミリリットルの微量遠心管に全血を転送します。血清収集のために、全血を室温で少なくとも30分間凝固させることを可能にする。血清コレクションに加えて、この手順は、免疫細胞を研究するために、循環、全血を収集する前に、チューブ及びシリンジ内の抗凝固剤を組み込むことによって修飾することができる。 </li><li>横切開aを作るマウスの下顎に腹腔と腹膜腔からの垂直切開の長さを渡ります。 </li><li>鉗子を使用して、切開の両側をつかみ、静かに、基礎となる腹膜や胸腔から肌を引き出します。 </li><li>ダイアフラムを切らないように注意しながら、性器から胸骨に腹腔の長さに沿って大きな切開を加えます。穏やかに腎臓の一つへのアクセスを可能にする腹腔内に腸をシフトする。 </li><li>灌流のための排水ポイントとして機能する腎臓につながる腎静脈を切った。 </li><li>ニックは、振動板には、はさみを使って心臓の左側を露出させ、肺と心臓を避けるように注意しながら。 </li><li>手動で27 G針および1×PBS溶液で10mlの注射器を用いて心臓を灌流。生理食塩水が肺に強制されていないことを確実にするために灌流中、無理な力を加えないようにしてください。残血門脈切開から排出should。</li><li>慎重に心臓や肺を切らないように注意しながら、鈍/鈍ハサミを使用して胸骨に沿って胸郭を切った。誤ってこの手順の間に肺を切断して大幅に収集されたBALFの量を減らすことになり、適切に固定液で肺を膨らませることができないことになります。 </li><li>静かにピンセットを用いて胸郭から心臓や肺を分離します。慎重に、できるだけ背骨の近くに鈍/鈍ハサミを使用して胸郭の各セクションをカットし、完全に両方のセクションを削除します。 </li><li>ピンセットを用いて唾液腺を分離またはハサミで除去してください、気管を露出させる。 </li><li>慎重にハサミを使って気管をオーバーレイ筋肉を切る。これは、気管このプロセス中に切断されないことが必須である。 </li><li>はさみを使用して、気管の上にある鎖骨を分離。 </li><li>優しく鉗子を使用して、胸腺を把握し、心臓から組織を持ち上げます。に注意しながら、はさみを使用して、胸腺を削除心臓や肺を切断しないようにします。 </li><li>角度のついたはさみ（45〜90度の角度、シャープ/シャープ）を使用して、1〜2輪喉頭下の気管に小さな横切開する。切開はしっかりとカニューレを固定するのに十分な大きさでなければなりません。 </li><li>テーパ端部を切開下に2〜3気管輪を拡張するようにカニューレを挿入し、絹縫合糸を使用して所定の位置にカニューレを固定します。縫合糸が気管と食道の間を通過し、カニューレにきつく引っ張られていることを確認してください。 </li><li>ハンクス溶液（HBSS）1mlで1ミリリットルの注射器を記入し、ゆっくりとカニューレにそのルアーを挿入します。 </li><li>ゆっくりと、しかし一定の動きを使用して、肺を膨らませる、気管に〜900μLを注入し、すぐにHBSSを撤回。 15ミリリットルコニカルチューブに回収BALFを配置します。 </li><li>将来の分析のために、BALFの約3ミリリットルを収集するには、この洗浄を2回追加を繰り返します。使用するまで氷上で、または4℃でBALF保管してください。 </li></ol><ol><li>肺膨張スタンドに10ミリリットルの注射器を挿入します。シリンジにルアーにチューブ、ストップコックにルアー、およびストップコックを組み立てます。ストップコックが閉じた位置にあることを確認してください。 10mlシリンジは、重力流溜めとして機能する。リザーバは、動物の上に4.75スタンドとリザーバの上部が動物上で10.5を拡張する必要があり、インフレに添付する必要があります。 </li><li>中性緩衝ホルマリン溶液で注射器を埋める。注射器が完全に固定液で満たされていることを確認します。 </li><li>チューブの開放端部の下に吸収性タオルを置き、固定液は、チューブを埋めることができるようにストップコックを開いてください。固定液は、チューブから流れる始まると、すぐにストップコックを閉じて、固定剤でトップに注射器を補充します。それは、注射器が完全に肺のインフレ圧力の適切な量を提供するために満たされることが重要である。 </li><li&gt;静かに約1〜2気管輪カニューレの終わりの下に、気管の下に縫合糸の第二の一枚を渡す。 </li><li>縫合糸の単一緩い結び目を作る。しかし、結び目をしっかり引っ張らないでください。 </li><li>カニューレにマウスインフレスタンドからチューブを挿入します。 </li><li>ストップコックを開き、肺が重力インフレによって埋めることができます。 </li><li>肺は彼らの最大のインフレ水準に達すると、縫合糸がきつく引っ張り、二結び目を作る。 </li><li>ストップコックを閉じて、カニューレからチューブを取り外します。 </li><li>静かにピンセットで縫合糸をつかみ、指でカニューレを保持することによって気管からカニューレを取り外します。しっかりと胸腔とバックマウスの鼻に向けてカニューレに向けて縫合糸を引っ張る。 </li><li>優しく鉗子で気管または縫合糸をつかみ、首キャビティから気管に持ち上げます。 </li><li>鈍いはさみを使用して結ば縫合糸に気管尾を切断。 </li><li>一度trache離れてマウスの気管を引っ張って始め、基盤となる組織がない。優しく胸腔から肺を持ち上げます。 </li><li>慎重に胸腔内の肺を保持する結合組織をカット。根本的な接続を切断しながら、離れてマウスの体から気管を引っ張って継続し、着実に上向きの力を適用します。肺を切らないように注意してください。心臓が左に、この方法を使用して肺に接続する必要があることに注意してください。 </li><li>肺が削除された後は、緩衝ホルマリン10mlに配置します。 </li><li>ジェノタイピングのためのマウス尾の部分を削除します。 </li><li>適切な施設のガイドライン以下のマウス死体を処分。 </li></ol> 4。サイトカイン評価<ol><li>血清を単離するために5分間12,000×gで、ステップ2.5の下で採取した全血を、遠心分離する。 -80℃での前標識1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアに血清を転送</li><li>干せるを評価ELISAまたは他の同様のアッセイによるMのサイトカインレベル。製造指示に従って、アッセイに応じて、適切な希釈バッファーで1時20分 - 血清を1:5に希釈します。これらの希釈液は、経験的に前のサンプルの大部分を実行しているに判断すべきものである。 </li><li>採取した血清の低容量に起因して、半分にELISAプレート上にロードしたサンプルの体積を減少させる。たとえば、ほとんどの市販のELISAは、標準および試料100μlの容量を利用する。標本、負荷50規格のμLとウェルあたり希釈した血清を節約する。 </li><li>遠心分離機5分間200×gで冷蔵卓上遠心機でBALF。 2に、無細胞上清を移し-80℃で1.5 mlマイクロチューブや店舗を前標識</li><li>希釈することなく、ELISAまたは他の類似のアッセイにより、BALFのサイトカインを評価します。 </li><li> -80℃で保存し、未使用の血清およびBALF </li></ol> 5。染およびBAL細胞性評価<ol><li> BALFを遠心分離し、完全HBSSを除去した後、低張性食塩水を用いてペレット化した赤血球を溶解。蒸留水900μLで細胞を懸濁します。すぐに10倍のPBS 100μLを加える。 </li><li>個別に各サンプルを溶解。サンプルは、赤血球の過剰な量が含まれている場合、細胞は、5分および赤血球溶解プロトコル400×gでテーブルトップ遠心機でペレット化することができる繰り返すことができる。 </li><li>トリパンブルー染色で10倍または20倍の倍率の下で血球計を使用して、1ミリリットルの懸濁液中の総BALF細胞性を決定します。細胞/ mlとして、これらのデータを評価し、提示する。 </li><li>サイトスピンや染のための材料を準備します。鉛筆や耐溶剤性のペンを使用して標準的な顕微鏡用スライドにラベルを付けます。サイトスピンブラケットと漏斗にスライドを固定します。サイトスピンローターでスライドアセンブリを固定します。 </li><li> 5分間100×gでBALFのサイトスピン150μL。細胞密度を効果的に大きすぎると細胞形態を評価し、スライド上にスピンダウンし、ボリュームを下げる。スライドを一晩乾燥を放送することができます。 </li><li>差動製造プロトコル以下のスライドを染色する。スライドを一晩乾燥を放送することができます。パーマウントを使用してスライドをカバースリップし、20Xおよび40X目的を備えた顕微鏡を使用してスライドを評価します。 </li><li>例えば、FACS、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、遺伝子発現の評価のためのRNAの抽出、および/またはウェスタンブロットのためのタンパク質抽出などのその後の分析のために残りの細胞を、収穫。 </li></ol> 6。組織病理学的評価<ol><li>組織病理学的評価のための肺を準備します。ホルマリン固定の24〜48時間後に、腹全体の膨張した肺を配向し、パラフィンに包埋した。メイン誘導気道を露出させられたブロックをカット。 </li><li>採点の精度を向上させるために、同じ位置に肺を位置決めし、tの最大前後視覚化を得るために各ブロックをトリム彼はメインの軸方向の気道を肺内。この点から、5ミクロンの連続切片ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で染色を切った。追加の切片を切り出し、標準的なプロトコルを用いてin situハイブリダイゼーションのために調製することができる。 </li><li> 0（不在）及び3（重度）の間で採点され、以下の炎症性パラメータに基づいて半定量的スコアリングシステムを用いて組織病理を評価する：核及び多核細胞浸潤;上皮細胞過形成や傷害気道;溢出;血管周囲とperibroncheolarカフィング;および炎症に関与肺のパーセント。肺の組織病理は、経験豊富な病理学者で評価してください。 </li><li>総組織病理学スコアを生成したり、病気の進行の特定の側面を定量化するために個々のスコアを使用して、パラメータのスコアがすべて平均。遺伝子型と治療の両方を知らされていない査読者との、二重盲検法ですべてのスコアリングを行っています。このスコアリングシステムは、previouslされているYは、6,7,10を記述した。 </li></ol>

<ol>
	<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report:+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals.">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li><li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology.">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Revelli, D. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(NALP3,+Cryopyrin)+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation,+necrosis,+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways.">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li><li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide.">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li><li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice.">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

成功したマウスの肺における宿主免疫応答を評価するための最も重要なステップは次のとおりです。1）評価対象モデルに適したマウス系統、性別を選択する。 2）肺へのPAMPの配信を最適化する。 3）正しくBALFを収集し、処理する。そして4）適切に修正し、組織病理学的評価のための肺の準備。 マウス株の選択は、宿主の免疫応答を評価する上で重要な要因である。 C57BL...

病原性細菌種に関連する肺感染は、世界的な罹患率および死亡率の一般的な原因である。これらの病原体に対する宿主の免疫応答をドライブするメカニズムを決定することは、これらの感染症の影響を減衰させる新たな予防戦略と治療薬の開発を推進していきます。ここに記載されたプロトコルの全体的な目標は、生きた細菌の代用物としての病原体関連分子パターン（PAMP）を用いて病原体感染に対する宿主の先天性免疫応答を評価するために柔軟な方法をユーザに提供することである。細菌に対する宿主自然免疫応答を評価する以前の研究の大部分は、実行が比較的容易に腹膜モデルに焦点を当てている。これらのモデルは非常に有用であり、宿主 - 病原相互作用および全身性炎症分野で大きな進歩をもたらしましたが、これらのモデルから生成されたデータには、常に問題研究のための適切ではありませんinvolvi呼吸器系ngの。ここでは、急性肺炎症の肺モデルは、古典的な腹腔内（ip）注射モデルの実用的かつ臨床的に関連する拡張として提案されている。提案された技術は、器官特異的モデル系における先天性免疫応答の局所的評価を可能にする。 ここで説明する方法は、ユーザが共通のPAMPであるLPSに対する宿主の免疫応答を評価することを可能にするための簡単​​かつ堅牢な技術を提供するように設計されている。方法は、マウスおよび呼吸器感染症及び急性肺障害に罹患している1ヒト患者において観察される病態生理学的特徴の多くを模倣するの肺におけるロバストな先天性免疫応答を誘導するLPSの気管内（it）点滴に基づいている。この技術の主な利点は、ユーザがインビボ研究導通に関連付けられた交絡因子および安全性の懸念なしに宿主免疫応答を評価することを可能にすることである生菌を使用した。同様に、このプロトコルで説明した露光の口腔咽頭のIT投与経路は、行政（中）、鼻腔内、外科、IT管理など、他の一般的に利用された技術、上の重要な利点を持っています。例えば、口腔咽頭IT管理は、典型的に、鼻腔内のエージェントの損失に肺沈着の増加変動を患っており、2〜4洞管理、中に比べて比較的正確な投薬および肺沈着を可能にします。それの投与経路は、これらの空洞を回避し、気管や気道に直接アクセスすることができます。同様に、外科的なITアプローチは、かなり多くの病的な投与方法で、マスターに広範囲の訓練を必要とします。ここで説明するプロトコルも記述一般的な技術と炎症の進行を評価し、LUを調製するための適切な技術を記載したプロトコルで終了するために使用する代理マーカーが含まれる組織病理学的評価のためのNGS。これらのプロトコルは、各々の動物から生成されたデータを最大にすることによって、各試験に必要なマウスの数を最小化に焦点を当てている。 記載されたプロトコルは、非常に柔軟であり、容易に多様な範囲のPAMPのダメージ関連分子パターン（減衰）を評価するために修飾することができる。さらに、いくつかの追加の修飾と、これらのプロトコルはまた、アレルギー性気道疾患の進行または生細菌、ウイルスまたは真菌5-10有する宿主-病原体相互作用を評価する研究に適用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

病原体に対する宿主免疫応答は、複雑な生物学的プロセスである。 インビボ研究の大部分は、古典的宿主-病原体相互作用は、マウスにおけるセレクト細菌または病原体関連分子パターン（PAMP）の腹腔内注射を活用特徴付けるために用いられる。これらの技術は、感染症の病理生物学に関連した膨大なデータが得られているが、腹腔内注射モデルは常に、肺における宿主 - 病原体相互作用の研究には適していません。マウスにおける急性肺炎症モデルを利用し、それは先天性免疫応答は、リポ多糖（LPS）を利用してホストの高分解能解析を行うことができる。ここでは、非外科的口腔咽頭気管内投与を使用して、LPSを投与し、疾患の病因に関連する臨床パラメータをモニタし、宿主の免疫応答を評価するために気管支肺胞洗浄液を利用する方法を記載している。記載されている技術のPAMPおよび病原体の多様な範囲に対する宿主自然免疫応答を研究するために広く適用可能である。同様に、若干の変更を加え、これらの技術はまた、アレルギー性​​気道炎症を評価する研究および薬理学的用途に適用することができる。

グラム陰性菌の細胞壁は、環境において非常に豊富であるLPS、から構成されている。敏感なヒト集団におけるLPSの吸入は気道反応性を悪化させると、強い免疫response11をトリガすることができます。 LPSはまた、堅牢な先天性免疫応答を誘発するためにマウスモデルで使用される一般的なPAMPである。ここに記載されたプロトコルでは、マウスは、E.から単離されたLPSのそれの投与を受け?...

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The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K ビュー.  Virginia Polytechnic Institute and State University. 病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。 

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

免疫・感染学

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

の寄生蜂の紹介<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;と抗寄生虫免疫応答

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

接種<em&gt;ハマダラカ</emメラニン免疫応答を誘導し、測定するためにビーズと&gt;蚊

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.