Bragonziの研究室での研究は、イタリアの嚢胞性線維症財団（CFaCore）とEU-F7-2009から223670によって資金を供給されています。この研究の一部は、アレンビック、高度な顕微鏡実験室で行った、マウス組織病理は病理解剖学（サンラファエルバッグ研究所）の単位で行った。

1。慢性感染の準備菌（前マウスの挑戦への3つの二日） <ol><li>適切なPを切り替える緑膿菌の菌株は試験される。 </li><li> Pの白金耳を接種トリプチケースソイ寒天（TSA）プレートに-80℃で保存培養から緑膿菌とは、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>シングルコロニーを採取し、15ミリリットルスナップキャップ付きチューブに5ミリリットルトリプチケースソイブロス（TSB）に接種し、200 rpmで振とう培養器で37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 2。慢性感染症のために寒天ビーズ中の細菌を埋め込む（感染前に一日） <ol><li> 、細菌の一晩培養物の少量のアリコートを取り、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で1:50に希釈し、600nmでの光学密度（OD）を測定する。 </li><li>新鮮なTSBの20ミリリットルを含む新しいスナップインキャップのチューブに2 ODを追加することで、一晩細菌培養を希釈します。 </li><li>約3 37℃で培養する -10月15日ODの合計に達するまで、200 rpmで振とう培養器で期まで4時間。 </li><li>一方、TSAを調製、1.5％寒天、オートクレーブTSB製の水浴中で50℃で平衡化。水浴中で50℃で三角フラスコにpreautoclaved重質鉱油150mlの平衡化。 </li><li> P.回緑膿菌は対数期に到達し、4℃で15分間、2,700×gでの遠心分離により菌体を回収し、上清を捨てる。 </li><li>完全にペレットを再懸濁するために徹底的に細菌の滅菌PBS 1ミリリットル中のペレットと渦を懸濁します。 </li><li>液体TSAの9ミリリットル、50℃で予め平衡と混合1ミリリットル細菌懸濁液</li><li> 10ミリリットルTSA-Pを追加緑膿菌 （50℃で温めておいた）重質鉱油と混合し、直ちに、室温で6分間撹拌する。攪拌は、油で目に見える渦を生成しなければならない。 </li><li>最小種で撹拌し、4℃に混合物を冷却35分（ 図1）のためのEED。 </li><li>さらに20分間氷中の寒天ビーズ - オイル混合物を置き。 </li><li> 4℃で15分間2700×gで50ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機に寒天ビーズを転送</li><li>正確に鉱油を除去し、ステップ2.11に記載のように、滅菌PBSで6回洗浄する。 3回洗浄後、ビーズを代わりに遠心分離機を使用する重力によってペレット化することができる。最後の洗浄の後に20〜30 mlのPBSで寒天ビーズを懸濁します。 </li><li>ビーズ（約0.5ミリリットル）の一定量を取り、無菌的に均質化する。 </li><li>均質化されたビーズを100μlを取り、滅菌PBS900μlの中に希釈する。シリアルに10 -6まで1:10希釈する。 </li><li> 10 -6まで希釈されていないサンプルを含むTSAプレート上にプレート段階希釈し、37℃でプレートをインキュベート</li><li>いくつかの分野での倒立光学顕微鏡を用いてビーズ径を測定します。ビーズ直径は、（100〜200ミクロンの間である必要があります<strオング&gt;図1）。 </li><li> 4℃で一晩ビーズを保存</li></ol><img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> 図1。寒天ビーズの準備と、マウスの感染の概要。P. 緑膿菌細胞を1mlのPBSに再懸濁し、液体TSA（50°C）を9mlに添加する。この混合物をフラスコ中で50℃での重質鉱油150mlに加え、室温で6分間、高速で撹拌する。フラスコを35分間ゆっくり撹拌しながら4℃に冷却されると、寒天が固化ビーズを作成し、この混合物中に存在する細菌を寒天ビーズ内に埋め込まれている。細菌細胞を含有する寒天ビーズの詳細については（A）に示されている。滅菌PBSを用いて数回洗浄して鉱物油を除去した後、寒天ビーズ懸濁液をf準備ができているまたは気管内注入（B）によるマウスの肺における接種。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 3。寒天ビーズを用いたマウスの挑戦 倫理声明：このプロトコルおよび実験はサンラファエル科学研究所の動物のケアと倫理委員会からのガイドラインに従ってください。 <ol><li>寒天ビーズ懸濁液中にCFU / mlの数を決定するために、TSAプレート上でコロニー形成単位数（CFU）を数える。 50μlの1〜2×10 6の最適な接種物に到達するために2-4×10 7 CFU / mlに滅菌PBSで寒天ビーズを希釈する。 </li><li> 0.002ミリリットル/ g体重の容量で投与し、0.9％NaCl中C57Bl/6NCr（20〜22 gで6〜8週齢）雄性マウスにケタミン（50 mg / mlで）およびキシラジン（5 mg / mlで）を麻酔腹腔内注射。 注：麻酔がADEQ考えられている動物が静かに静止しuateは、外部刺激に反応しない、かつ一定の心臓や呼吸数を持っています。 </li><li>仰臥位でマウスを置きます。 70％エタノールでマウスのコートを消毒する。 </li><li>皮膚の縦カットで気管を露出し、無菌の、柔軟性のある22のG 0.9ミリメートル×25ミリメートルIVカテーテルで気管挿管、気管内に下降しながら、スタイレットを除去するために注意を保つ。あまりにも深く気管にカテーテルを挿入します。カリーナ（分岐部）に到達する前に停止します。 </li><li>すぐに1ミリリットルの注射器で寒天ビーズ懸濁液の50μlの容量を取得し、カテーテルに取り付けます。ビーズは穏やかに肺内に注入されることを可能にする、シリンジのプランジャを押す。縫合糸クリップを使用して切開を閉じます。 </li><li>完全に目覚めまで加熱パッド上に動物を配置します。 </li></ol> 4。マウス評価<ol><li>コー​​トの質、姿勢を含む臨床徴候について毎日マウスを観察し、歩行、および水和状態。毎日の体重を監視します。 ≥20％の体重を失うのマウスは安楽死させなければなりません。 </li><li> BAL、サイトカイン分析の合計と差分細胞数の面で気管支肺胞洗浄液（BAL）及び肺の収集と、総CFUの分析、組織学的分析、炎症反応のためのポイント6または7を収集するためのポイント5に従い、ミエロ（MPO）活性。 </li></ol> 5。 BAL液の収集と分析<ol><li> CO 2吸入によりマウスを安楽死させる。 </li><li>仰臥位でマウスを置きます。 70％エタノールでマウスのコートを消毒する。 </li><li>皮膚の縦カットで気管および胸郭を公開します。振動板を切断することによって肺を公開します。 </li><li>ピンセットを用いて気管の下に縫合糸を挿入し、滅菌した、柔軟性のある22グラム0.9ミリメートル×25ミリメートルIVカテーテルで気管挿管。約を結合するために縫合糸の両端を引っ張る気管にtheterや気管の周りの糸を結び目。 </li><li> 1ミリリットルの注射器を使用したRPMI 1640の1ミリリットルの容量を取得し、カテーテルに取り付けます。肺を洗浄し、すぐに15ミリリットルチューブに格納し、液体を回収するために、注射器のプランジャーを押してください。 NOTE：サイトカインが分析される場合には、RPMI 1640にプロテアーゼ阻害剤を加える。 </li><li>のRPMI 3ミリリットルの合計で、この手順を3回繰り返します。今後は、氷上でBAL液を保存する。肺の収集と分析のための手順6に進みます。 注：（2.8ミリリットル最大）すべての液体が取得​​されますのでご注意ください。 </li><li> BAL液中に存在する細菌の定量のために、少量のアリコート（300μl）をサンプリングし、直列TSAプレート上に、滅菌PBSでプレートを1:10に希釈し、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ビルケル細胞計数チャンバ内Tuerk溶液でBAL液を1:2のアリコートを希釈光倒立光学顕微鏡を用いて総細胞数を数える。 </li><li> Rを遠心分離4℃で8分間、330×gでBAL流体をemaining -80℃で保管する、ELISAサイトカイン分析用上清を取りサイトスピンによる差動細胞計数のためのステップ5.10から5.13に従ってください。 </li><li>ペレットが赤色の場合、RBC溶解緩衝液の250〜300μlにペレットを再懸濁し、赤血球を3分間超純蒸留水で1:10に希釈溶解する。 4℃で8分間330×gで2ミリリットルのPBSと遠心で中和</li><li>上澄み液を捨て、RPMI中、10％ウシ胎児血清（FBS）でペレットを再懸濁します。総細胞数に基づいて、1×10 6細胞/ mlを、提供するボリュームを使用する。 </li><li>段ボールフィルタはサイトスピンの中心を向くように、サイトスピンでの適切なスロットに顕微鏡スライドとフィルタを配置します。 5分間300×gで細胞遠心でのサイトスピンし、遠心機の適切なウェルに各サンプルの150μlのピペット。 </li><li> MAによると、ロマノフスキーは市販のキットを使用して染色することによって、スライドを染色するnufacturerの指示や、以前に説明したように12。手順MPO​​活性分析のための5.14から5.17に従ってください。 </li><li>遠心機で4℃で5分間、380×gでBALの残量上清を捨て、細胞を溶解するために超純蒸留水にヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロ250μlの0.5％でペレットを再懸濁します。懸濁液は、アッセイを行う前に、数日間-20℃で凍結することができる。 </li><li>遠心機4℃で30分間、16,000×gで試料の各ウェル場合に必要、また適切な希釈物を二重に試料を添加し、96ウェルプレート中でMPOアッセイを行うために上清を使用する。 </li><li>ウェル中の各試料に加える等量の3,3 &#39;、5,5&#39;ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン（TMB）。反応は、少なくとも5分間、そして色のさらなる発展がなくなるまで、暗所で起こることを可能にする。 </li><li> 2 H 2 SO 4 Aを添加して反応を停止させるND 450 nmでのODを測定する。 OD値は、ペルオキシダーゼ活性に正比例する。 </li></ol> 6。肺およびサイトカイン分析における細菌負荷の測定<ol><li>すぐにBAL液を採取後、マウスからの物品の肺には、、、滅菌PBSで別々のローブが、それらを洗い流し滅菌PBS 2mlで丸底チューブに入れ、氷上に保存します。 NOTE：サイトカインが分析される場合には、チューブにPBSにプロテアーゼ阻害剤を加える。 </li><li>無菌的に肺を均質化、ホモジネートから少量（300μl）を取る、シリアルにTSAプレートに、PBS中にプレートを1:10に希釈し、37℃で一晩インキュベートする。総気道細菌負荷は、BAL液および肺で見つかったCFUの合計になりますのでご注意ください。 </li><li> 4℃で30分間16,000×gで、残りのホモジネートを遠心分離ELISAのサイトカイン分析のために上清を取り、-80℃で保存</li></ol> 7。組織学的検査 &lt;OL&gt; <li>肺の側面とプロパティを保持するために、唯一のBAL液が収集されていない中で肺に組織学的分析を実行します。 </li><li> CO 2吸入によりマウスを安楽死させる。 </li><li>皮膚の縦カットで胸郭を公開、振動板を切断することにより、肺を公開します。 </li><li>物品肺を、光から保護し、4℃で5〜10 mlの10％中性緩衝ホルマリン（4％ホルムアルデヒド）およびストアを含むチューブに入れ、ローブを分離し、PBSでそれらをすすぐ。 </li><li>標準的な手順を用いて、パラフィンに埋め込ま肺、。 </li><li>ミクロトームを用いて5μmの厚さの切片を切った。 </li><li>ヘマトキシリン​​およびエオシンで染色し、スライドを標準的な手順に従って、カバースリップを有するスライドをカバーする。 </li><li>倒立明視野顕微鏡を用いてスライドを検査し、カメラに顕微鏡を接続して画像を取得する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis.">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li><li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens.">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li><li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li><li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia.">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li><li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres.">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model.">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li><li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection.">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM.">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li><li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+the+host+response+using+murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection.">Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection.</a> Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).</li><li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 .</li><li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment.">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, .</li><li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells,+their+cytokines+and+mediators.">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence..">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence..</a> AJRCCM. In press, (2009).</li><li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains.">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response.">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, .</li><li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa:+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection.">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

P.における重要なステップ緑膿菌ビーズの準備とマウスの課題を以下に報告されています。 マウスの挑戦のために使用される緑膿菌株は非常に重要です。死亡率、慢性感染症やクリアランスは挑戦のために使用された細菌株によって大きく異なる可能性があります。 P.それは、比較的低い死亡率、より深刻な病変、および高い慢性感染をもた?...

嚢胞性線維症（CF）は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝病である。この遺伝子は、ほとんどの上皮細胞の膜上に発現するクロライドチャネルをコードする。気管支拡張症、粘液詰まりおよび実質破壊は徐々にCF患者1のほとんどの深刻な肺疾患と死亡につながる緑膿菌感染が主な原因。 CFの病因と新しい治療法のさらなる発展を理解することは、CFの特徴を持つ動物モデルに依存しています。遺伝子操作のためのCFTR遺伝子改変いくつかのマウスは、生成されたが、CF-のような肺疾患およびCF患者に見られるいくつかの他の臓器の異常を再現するためにこれらの種の能力には限界が広く2実証されている。 感染症の発症は、CF動物モデルにおける主要な課題の一つである。文献CL初期のマウスは、寒天、アガロース、アルギン酸または海藻までの時間として固定化剤中に埋め込 ​​まれた細菌を接種している場合にのみ、一ヶ月以上持続する慢性感染を達成することができることを示唆している。これらの固定化剤は、細菌が、同様にCF患者6の粘液の成長のために、微小コロニーの形で成長させる微好気/嫌気条件を提供しています。慢性感染症のこのモデルは、気道炎症および損傷7を引き起こす肺における細菌の持続性をもたらす。しかしながら、使用される方法細菌株および肺に接種用量に応じて、異なる時点で、肺で回収慢性感染マウスのパーセンテージおよび細菌負荷はかなり異なることができる。具体的には、長期的な慢性感染症のための主な課題は、P.により低細菌量のままチャレンジ後の緑膿菌感染したマウスの週の低い割合、THAを示すT菌体を徐々にホストによってクリアされます。 P.を選択することによりCFのコレクションから、 緑膿菌の RP73臨床株は8我々は成功し、低死亡率を得、より重度の病変を分離し、C57Bl/6NCrlマウスにおける1ヶ月まで安定細菌負荷による慢性感染の割合が高い。 本論文では、Pを埋め込 ​​むための方法論を詳述寒天ビーズ中緑膿菌 、我々は、気管内注入によりマウスを感染させた肺中の細菌負荷およびサイトカインを測定し、BAL液を採取し、組織学的検査を行った。全体的に、このプロトコルは、病因の8,9に根本的に重要な問題に対処するとP.に対する新規治療法をテストする際に研究者を支援します緑膿菌慢性感染10,11。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">211823</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Difco Agar, granulated</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">214510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Heavy mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">330760-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">S-(+)-Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">K1884</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">X1251</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">1 ml syringe 25 G 5/8&#39;&#39;&#160;0.5 x 16 mm</td>
			<td style="width:191px;">PIC</td>
			<td style="width:143px;">3071250300350</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Catheter 22GA 0.9 x 25 mm</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">381223</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">11152-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Scissors, Iris, 11 cm, straight</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:143px;">501758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture clips</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">12040-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture thread</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">18020-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:143px;">11836145001</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td>
			<td style="width:191px;">Biosigma</td>
			<td style="width:143px;">390497</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Tuerk solution</td>
			<td style="width:191px;">Fluka</td>
			<td style="width:143px;">93770</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:143px;">420301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">EZ cytofunnel</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78710021</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">J3800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Diff-Quik Romanowsky staining set</td>
			<td style="width:191px;">Medion Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">130832</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Hexadecyltrimethylammonium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">52366-10G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">96-well EIA/RIA plate</td>
			<td style="width:191px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">3590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;- tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8665-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">320501-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-01005Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Harris haematoxylin non Papanicolau</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M06004</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Eosin plus alcoholic solution</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M11007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Shaking incubator</td>
			<td style="width:191px;">Amerex Instruments</td>
			<td style="width:143px;">Steady Shake 757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Water bath</td>
			<td style="width:191px;">Grant</td>
			<td style="width:143px;">SUB14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Precision balance</td>
			<td style="width:191px;">KERN</td>
			<td style="width:143px;">440-47N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Low Cost Heating Pad</td>
			<td style="width:191px;">2biol</td>
			<td style="width:143px;">LCHP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:272px;">Homogenization probe</td>
			<td rowspan="2" style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;">2366931(great)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:143px;">2366925(small)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted optical microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axioplan2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Camera (microscope)</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axiocam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Rotary microtome</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM2255</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice

モデル自体に関する懸念の数があるが、慢性気道感染症のマウスモデルは、嚢胞性線維症（CF）の研究における重要な資産である。少数の報告は、インビボで長期の慢性感染症に焦点を当ててきたが、炎症および感染の初期相は広く、 緑膿菌寒天ビーズマウスモデルを用いて研究されている。長期的な慢性感染症のための主な課題は、P.により低細菌量のまま細菌細胞が徐々にホストによってクリアされていることを示すチャレンジ後の緑膿菌感染したマウスの週の割合が低い。 本論文では、マウスでは、効率的な長期慢性感染を得るための方法を提示します。この方法は、Pの埋め込 ​​みに基づいていますC57Bl/6NCrlマウスの気管内注入に続いて、in vitroで寒天ビーズ中緑膿菌臨床株、。両肺感染はSEVと関連している体重減少、死亡率、慢性感染症、および炎症性応答を含むERAL測定可能なリードアウト。 P.それは、比較的低い死亡率、より深刻な病変、および高い慢性感染をもたらしたため、 緑膿菌 RP73臨床株はPAO1の参照実験室株よりも好まれた。P.緑膿菌のコロニー形成は、3ヶ月以上の肺に固執することができる。マウス肺の病理は、高度な慢性肺疾患を持つCF患者のそれに似ている。 このマウスモデルに最も近いヒトの疾患の過程を模倣および病原性の研究および新規な治療法の評価のための両方に使用することができる。

プロトコルは、P.、正しく行われているときシュードモナス寒天ビーズは100〜200ミクロンの間を測定し、スライド上の寒天ビーズ懸濁液少量のピペッティングすることによって倒立光学顕微鏡で観察することができる。 図1に詳細に示すように、単一の細菌細胞は、寒天ビーズに見える。 Pの選択寒天ビーズ調製に使用される緑膿菌株</...

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

我々は、マウスモデルにおいて、長期持続性の慢性緑膿菌気道感染を確立する寒天ビーズ法を記載している。

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

22.2K ビュー.  San Raffaele Scientific Institute. 我々は、マウスモデルにおいて、長期持続性の慢性緑膿菌気道感染を確立する寒天ビーズ法を記載している。 

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

免疫・感染学

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...