私たちは、反リフトバレー熱ウイルスの血清を提供するためのCISA-INIAからアレハンドロ·ブランに感謝します。私たちの研究室での作業はForschungsförderung宝石でサポートされています。 2腹筋を§。 3 KooperationsvertragUniversitätsklinikumギーセンウントマールブルグ、新興ウイルス性疾患のためのライプニッツ研究科（EIDIS）、DFG Sonderforschungsbereich（SFB）1021、およびDFG Schwerpunktprogramm（SPP）1596。

感染のA549細胞の1。シーディング<ol><li>細胞培養培地中でCO 2、37℃でA549細胞をT75フラスコを育成し、5％（DMEM、10％FCS、526.6ミリグラム/ lのL-グルタミン、50.000 U / lのペニシリン、および50mg / Lのストレプトマイシンを補充した）。 </li><li>細胞を回収し始める前に、37℃に加熱した水浴中で細胞培養培地、PBSおよび0.05％トリプシン-EDTAを温める</li><li>培地を除去し、10mlのPBSで細胞を洗浄。再びPBSを削除します。 </li><li>トリプシン-EDTAの3ミリリットルを加え、フラスコ内に均等に分配する。 37℃のインキュベーターにフラスコを移し、5％のCO 2。 </li><li>すべてのセルが切断されるときに、細胞培養培地7mlの投稿、細胞を再懸濁し、15mlのファルコンチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> RTで5分間、800×gで細胞を遠心し、上清を除去し、10mlの新鮮な細胞培養培地中でペレットを再懸濁する。 </li><li>カウンティングチャンバーで細胞を数える。 </li><li> 2 T25フラスコ中の各細胞培養培地5mlに2.5×10 6個の細胞を加える。 37℃で16時間インキュベートし、5％CO 2。一つのフラスコを模擬対照とCl 13感染症の1のために提供しています。 </li></ol>リフトバレー熱ウイルスクローン13（CL 13）と2。感染<ol><li>注：Clで13は、ドイツでのBSL-2の条件下で処理することができる弱毒化ウイルスの変異体である。該当する国のガイドラインを参照してください。他の典型的なインターフェロン誘導物質は、センダイウイルス（菌株Cantell）またはニューカッスル病ウイルスだろう。 </li><li> 5％FCSを含有するプレ暖かいPBS、無血清培地および細胞培養培地。 </li><li> 5の感染多重度（MOI）で2.5×10 6個のA549細胞を感染させるために無血清培地中でClで13の1.25×10 7 PFU / mlに調製する。を考慮するために必要とされるよりもわずかに（約10％）より多くの量を準備ピペットのエラー。 </li><li> 1.3で説明したように、PBSで細胞を洗浄。 </li><li> Clで13希釈液1ミリリットルを追加したり、無血清培地（未感染の対照、モック）細胞に、37℃で1時間、5％CO 2でインキュベートする。それぞれ、Clで13希釈および無血清培地の平等な分配を確保するために、15分毎に丁寧にフラスコを移動します。 </li><li>感染の1時間後、接種物を除去し、5％FCSで予め温めておいた細胞培養培地5mlを追加し、37℃で5時間、5％CO 2でインキュベート。 </li></ol>細胞溶解物の3。準備<ol><li> 4℃でPBS / 0.5％トリトンX-100を調製セリンプロテアーゼ阻害剤を追加しないでください。 </li><li>冷PBSで細胞を洗浄し、新しいPBSの10ミリリットルを追加。 </li><li>細胞を掻き、ファルコンチューブに細胞懸濁液を移し、RTで5分間800×gで遠心する。 </li><li>上清を除去し、30μlのPBS / 0.5％トリトンX-100で細胞ペレットを再懸濁します。新しい1.5 mlチューブにライセートを移し、4℃で少なくとも10分間インキュベート</li><li> 10.00で溶解液を遠心分離0〜4℃で10分間xgで新しいチューブに清澄化した細胞溶解物（上清）を転送する。 </li><li>他の場所で説明したように33 Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定します。 </li><li> -20℃で保存するか、トリプシン消化（4.1）またはネイティブPAGE（5.1）に進みます。 </li></ol>パターン認識受容体の構造変化4。決定<ol><li>細胞溶解物のTPCK-トリプシントリートメント<ol><li> 2μgの/μLの最終作業濃度にPBS中に、L-1-トシルアミド-2 - フェニルエチルクロロメチルケトンで処理​​した（TPCK）トリプシンを希釈する。 </li><li> 2本の新しいチューブにPBSで9μlの最終体積（モックまたはCl 13）各タンパク質溶解物の25μgの最終タンパク質濃度を調整します。したがって、25μgの溶解物それぞれ、2回モックと2回Clで13に感染した4本のチューブである必要があります。一つは、入力コントロール（未処理）およびTPCK-トリプシンを用いた治療のための1セットとして設定してください。 </li><li> （未処理）のPBS 1μl加えまたは12μgの/μLTPCK-トリプシン（最終濃度0.2μgの/μL）のμL細胞溶解物にピペッティングにより反応を混ぜる。それは、消化の効率が損なわれるため、TPCK-トリプシン分量を凍結融解しないでください。 </li><li> 25分間37℃で溶解物をインキュベートする。 5×変性サンプル緩衝液（250mMのトリス-HCl、pH6.8、10％SDS、50％グリセロール、25％のβ-メルカプトエタノール、0.5％ブロモフェノールブルー）と95℃で5分間煮沸を添加することにより反応を停止それは、トリプシンインキュベーション時間を延長しないことが重要です。何プロテアーゼ耐性断片が検出されない場合には、トリプシン消化の時間を短縮する必要があります。 </li><li>煮沸後、サンプルを-20℃で保存することができる</li></ol></li><li> SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）およびウェスタンブロッティング<ol><li> 12％分離ゲル上の5％スタッキングを含有するドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル上でサンプルをロードする。まで、ゲルあたり25ミリアンペアでタンパク質を分離ブロムフェノールブルーがなくなる。 </li><li>メタノールを用いてポリフッ化ビニリデン（PVDF）で30秒間膜を活性化し、転送バッファに入れ（48 mMトリス、39 mMのは、1.3mMのSDS、20％メタノールをグリシン）。 </li><li>セミドライブロッティングシステムとブロッティングを準備し、1時間10 Vでのタンパク質の移動を可能にします。メンブレンを取り出して水で簡単にそれをすすぎ、それが乾燥させます。 </li><li>まもなくメタノール中に移すことによって、膜を再活性化。 TBSで5分間洗浄します。 RTでまたは4℃のCO / Nで1時間、TBSが10％スキムミルクでブロック5分、TBSでそれぞれの膜3回洗浄します。 </li><li>表1で推奨されるように、抗体希釈液を調製し、室温でまたは4℃のCO / Nで1時間膜をインキュベート</li><li> TBS-Tで10分間ずつの膜3回洗浄します。 TBS中の1％スキムミルク中の1:20,000の希釈で西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した適切な二次抗体を加える。室温で45分間インキュベートする。 </li><li> 10分、TBS-Tでそれぞれの膜3回洗浄し、OTBSでNE追加の時間。 </li><li>信号検出のため、市販の化学発光キットとデジタルゲル画像システムを使用しています。 </li></ol></li><li>クマシーブリリアントブルーG-250染色<ol><li> 4.2.1で説明したように、SDS-PAGEを実行します。ブロモフェノールブルーがなくなるまで負荷SDSポリアクリルアミドゲル上のサンプルとは、ゲルごと25ミリアンペアでゲルを実行します。 </li><li> RTでクマシーブリリアントブルーG-250染色を行う。一定の振盪しながら全てのインキュベーションを行います。 </li><li> 30分間、40％メタノールおよび10％酢酸を含有する定着液にゲルを移し。 </li><li>脱色液（25％エタノール、8％酢酸）にバッファーを交換し、5分間インキュベートする。 </li><li> 1時間、40％メタノールおよび10％酢酸中の0.2％クマシーブリリアントブルーG-250のゲルを染色。 </li><li>脱色液でゲルを脱色し、10分、30分、および60分後にバッファーを交換する。 </li><li> 4℃で25％エタノール、8％酢酸、および4％グリセロール中でゲルを記憶する</lI&gt; <li> 4.2.8で説明したように画像化し、分析を行う。 </li></ol></li></ol>パターン認識受容体のオリゴマー状態の5。分析<ol><li>未変性PAGE <ol><li> PBSで最終容量10μl中で、細胞溶解物の50μgのを準備し、最終濃度を5×ネイティブ試料緩衝液（250mMのトリス-HCl、pH6.8、青色1％デオキシコール酸ナトリウム、50％グリセロール、0.5％ブロモフェノール）を追加1X。 </li><li>スタッキングとして5％、ゲルの解決など、8％ネイティブポリアクリルアミドゲルすぐにサンプルをロードします。任意の遅延は、ネイティブの複合体34が失われます。 </li><li> 50mMのTris-NaOHでpHを9.0と4℃でゲルあたり20 mAでゲルを実行し、384 mMのアノード及び50mMのTris、pH8.3、384 mMのグリシン、陰極バッファーとして1％デオキシコール酸ナトリウムなどのようなグリシン。 1.5〜2時間後の電気泳動が終了した（ブロモフェノールブルーバンドは、約45分以前の、ゲルを残している）。 </li></ol></li><li>ウエスタンブロット法<ol><li> polyvをアクティブメタノールで30秒間inylidene化ビニリデン（PVDF）膜とトービン緩衝液（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、20％メタノール）に入れて下さい。 </li><li>メーカーの指示に従って、ウェットブロットチャンバーを組み立て、Towin緩衝液でタンクを埋める。 </li><li> 4℃で1.5時間、250ミリアンペアでブロッティングを行う</li><li>ブロッティングした場合は、上の4.2.3から説明したように進んで終了する。 </li></ol></li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

ウイルスや私は、システムをIFNの抗ウイルスタイプの活性化の存在を感知すると、成功した自然免疫応答22に重要である。ウイルス検出することにより迅速な応答および抗ウイルス防御機構の活性化を可能にする、RIG-IおよびPKRなどの病原体認識受容体（PRR）によって媒介される。ここでは、直接RIG-IおよびPKRの活性化状態を評価するために二つの方法を記載している。 <p class="jove_...

抗ウイルス宿主防御において重要な出来事は、いわゆるパターン認識受容体（PRR） の1,2による病原体の迅速な検出である。 RNAウイルス感染の細胞内検出は、2細胞質RNAヘリカーゼ、RIG-I（レチノイン酸誘導性遺伝子I）およびMDA5（メラノーマ分化関連タンパク質5）3-5に依存している。 RIG-Iは、2つのN-末端カスパーゼ動員ドメイン（カードなど）、中枢DECHボックス型RNAヘリカーゼドメイン、およびC末端ドメイン（CTD）4,6とから構成されている。 CTDおよびヘリカーゼドメインが非自己（ウイルス）RNAの認識に必要で​​あるのに対し、カードが抗ウイルスホストのステータスの確立につながる下流のシグナル伝達を仲介する。 RIG-Iが無音状態である場合、 すなわち、特定のRNAリガンドの非存在下で、第二のCARDは、中央ヘリカーゼドメインと相互作用し、自己阻害コンフォメーション7-11にRIG-Iを保つ。 RIG-Iは、短い二本に結合する5&#39;-三リン酸（5&#39;PPP）、長いdsRNA、およびポリU / UC豊富なRNA、多くのRNAウイルス12から16のゲノム上に存在する古典的な署名の構造を持つ鎖（DS）のRNA。 RIG-I活性化の二つの主要な特徴は、閉じたコンフォメー6,17およびホモオリゴマー6,18,19に切り替えている。コンフォメーションスイッチは、RNAが結合を増強下流のシグナル伝達のためのカードを公開し、活発なATPアーゼサイト8,9,11,20を再構成する。オリゴマーRIG-I複合体の形成は、抗ウイルスシグナル伝達のためのプラットフォーム11を形成するために、下流のシグナル伝達アダプター分子の増強された動員をもたらす。 RIG-I-調節されたシグナル伝達鎖は、最終的にアップレギュレーションインターフェロン（IFN-alpha/beta）遺伝子、完全な抗ウイルス応答21,22インターフェロン刺激遺伝子（ISGの）の、従って遺伝子発現のための転写因子IRF-3を活性化する。最も特徴ISGの一つは、RNA活性化proteiですNキナーゼ（PKR）23。 PKRは、真核生物翻訳開始因子2アルファ（eIF2αリン）キナーゼのファミリーに属し、N末端の二本鎖RNA結合ドメインおよびC-末端キナーゼドメインから構成される。キナーゼドメインは、PKR活性化のための二量体化界面が重要で構成しており、タンパク質の触媒機能を実行する。ウイルスのdsRNAのPKRの結合は、他の残基の間のThr 446で二量体化および自己リン酸化を可能にする、そのコンフォメーション変化をもたらす。 PKRは、それによってウイルスmRNA 23〜27の翻訳をブロックする、eIF2αリンのリン酸化を仲介する。 RIG-IおよびPKRの両方は、主要な構造再配列を受けるオリゴマー複合体を形成し、翻訳後リン酸化/脱リン酸化およびユビキチン化10,11,19,23,24,26-29によって修飾される。ウイルスのRNA構造がRIG-IおよびPKRを活性化している（どのような段階でウイルスのアンタゴニストをbの可能性がより良い理解のためにe）に干渉し、それは正確に活性化状態を決定することが重要である。両方のPRRのために、予め活性化は、トリプシン耐性タンパク質断片6,17,30及び高次オリゴマー6,18,19の出現をもたらすことが記載されている。しかし、抗ウイルス宿主応答1,2,24のこれらの重要な要因に関する文献が豊富に与えられ、直接法の適用は比較的まれと思われる。より広範な使用状況を刺激するのを期待し、我々は強固に、RIG-Iと、PKRの活性化状態を分析するために便利で敏感なプロトコルを提供する。 IFN有能なヒト細胞株A549は、RIG-IおよびPKR弱毒リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）31,32の確立された活性化因子に感染している。単純な溶解手順の後、感染細胞の抽出物は、コンホメーションのスイッチングを評価するために、制限されたトリプシン消化/ウェスタンブロット分析によって試験され、青色ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）/ウェスタンブロットによるanalysオリゴマーの形成を測定することである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

ウイルス感染に対する宿主防御は、自然免疫系のパターン認識受容体（PRR）による迅速な検出に依存している。細胞質内に、PRRは、RIG-IおよびPKRは、特定のウイルスRNAリガンドに結合する。これは、最初のコンホメーションのスイッチングおよびオリゴマー化を媒介し、その後、抗ウイルスインターフェロン応答の活性化を可能にします。抗ウイルス宿主遺伝子発現を測定するための方法は十分に確立されているが、直接、RIG-IおよびPKRの活性化状態をモニターする方法は、部分的にのみであり、以下で十分に確立。 ここでは、確立されたインターフェロン誘導剤、リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）の感染の際に、RIG-IおよびPKR刺激を監視するために二つの方法を説明します。限られたトリプシン消化は、PRRはの立体構造変化を示す、プロテアーゼ感受性の変化を分析することができます。 RIG-IとPKR、whereaの急速な劣化を模擬感染細胞の結果から溶解物のトリプシン消化S Clで13感染はプロテアーゼ耐性RIG-I断片の出現につながる。また、PKRは、Thr 446で、その特徴的なリン酸化と一致し、トリプシン消化にウイルス誘導部分の抵抗を示している。RIG-IとPKRオリゴマーの形成は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により検証された。これらのタンパク質は疑似感染サンプル中の単量体として残るのに対し、感染の際に、RIG-IとPKRのオリゴマー複合体の強力な蓄積がある。 限られたプロテアーゼ消化し、ネイティブPAGE、ウェスタンブロット分析に連結された両方が、RIG-IとPKR活性化の2多様な段階の感度で直接測定を可能にします。これらの技術は、実行するのが比較的容易かつ迅速であり、高価な装置を必要としない。

RIG-IまたはPKRによるウイルス薬の認識は、コンホメーションのスイッチング6,17,30およびオリゴマー6,18,27をトリガします。我々は、それぞれ、限られたプロテアーゼ消化およびネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって、これら二つの活性化マーカーをアッセイした。 ヒトA549細胞は、IFNアンタゴニストのNS 35,36の突然変異によ?...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

ウイルス感染に対する自然の防御はパターン認識受容体（PRR）によってトリガされます。ウイルスシグネチャのRNA、変更高次構造、オリゴマー化する2細胞質のPRR、RIG-IおよびPKRに結合し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化する。方法は、都合のコンホメーションスイッチングと、これらの細胞質のPRRのオリゴマー化をモニタリングすることを可能にする記述されている。

抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K ビュー.  Philipps-University Marburg. ウイルス感染に対する自然の防御はパターン認識受容体（PRR）によってトリガされます。ウイルスシグネチャのRNA、変更高次構造、オリゴマー化する2細胞質のPRR、RIG-IおよびPKRに結合し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化する。方法は、都合のコンホメーションスイッチングと、これらの細胞質のPRRのオリゴマー化をモニタリングすることを可能にする?...

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

の稀なケースでIgAおよび組織トランスグルタミナーゼ2抗体による表皮トランスグルタミナーゼの認識アカゲザル炎

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

免疫・感染学

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

C型肝炎ウイルスに対するヒトラクトフェリンの細胞取り込みおよびそれに関連する抗ウイルス活性を監視するために、免疫蛍光

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...