私たちは、スーザン·ファーマーやゼブラフィッシュケアのためのUABのゼブラフィッシュ研究施設のスタッフに感謝します。薬理学および毒物学の部門からの起動の資金が提供する資金調達。

注：このプロトコルは、バーミンガム機関動物実験委員会のアラバマ大学によって承認された。 1。ゼブラフィッシュの繁殖や卵コレクション<ol><li>三日間化学物質暴露を開始する前に、別々の男性と女性のディバイダーで飼育タンクを組み立てる。養殖システムの水を各タンクを半埋める。 NETを使用して、TG（5xERE：GFP）を転送する分周器で区切られた各タンクに2人の男性と3人の女性を配置し、繁殖水槽に魚をc262/c262。各タンクに蓋を置き、交差するように、日付と株と語り合う場です。 </li><li>翌朝は、すべての障壁を除去し、繁殖水槽の一端に浅い領域を作成するためにバッフルを傾けます。正確な発達のステージングを確保するために、10分間隔で胚を収集し、ゼブラフィッシュが交尾することができます。ペトリ皿にE3B媒体と優しくフラッシュ胚を用いて、茶こしを通して洗浄す​​ることによってきれいな卵。永久に成魚を返すタンク。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して、ソート、カウント、および任意の、未受精卵の異常または破損した胚を削除します。暗サイクル：午後02時10ライト付28.5℃でE3B媒体と家の中でペトリ皿に置き、胚。胚密度が発達に影響を与えることができる。 100×35mmディッシュと60×15 mmディッシュ中でせいぜい50胚では100以下の胚を置きます。 </li><li> 24 HPFにより、200μMの1 - フェニル-2 - チオ尿素（PTU）を含むE3Bでメディアを交換してください。 PTUは色素形成を防ぎ、ゼブラフィッシュの胚および改善された画像の鮮明さのための透明な幼虫を保持します。注意：集中PTUの株価は危険です。 E3B + PTU液を作るときは手袋を着用してください。 </li><li> 1日後受精（DPF）で、手動で細かい鉗子を使用して、各胚から絨毛膜を除去します。絨毛膜は、エストロゲンの浸透に影響を与えるようには見えない、しかし除去は画像の鮮明さを向上させます。メディアから絨毛膜を除去する必要はない。注：手動dechorionationの代わりに、胚のバッチはCHEすることができます以前に11を説明したようにmically、1 mg / mlのプロナーゼ処理を用いて絨毛膜を除去。 </li></ol>胚の2。化学処理<ol><li>治療前の日は、DMSO中の千倍の濃度（または適切な溶媒）で各化学物質のストック溶液を準備します。たとえば、10μMビスフェノールA（BPA）に胚を露出させるために、100％DMSO中の10mM BPAのストック溶液を調製する。これは、各処理において均一なDMSO濃度を保証し、DMSOの非毒性の1:1,000希釈ビヒクル対照として働くことを可能にする。 -20℃での店舗の原液このプロトコルでは、胚は1および10μMのBPA、18.5 nMおよび1.85μMのゲニステイン、367 nMのエストラジオール（ポジティブコントロール）、車両（0.1％DMSO、ネガティブコントロール）に公開されます。 注意：このようなBPA及びエストラジオールのような化学物質は有害であり、人間の胎児への有害な影響を持つことができます。注意して内分泌かく乱物質を処理し、常に適切な個人保護具を使用しています。</li><li>治療の日には、解凍、ストック薬液を用意しました。 1.5mlのマイクロチューブに1ミリリットルE3B + PTUをピペットや株価化学溶液1μlを追加することで1:1,000に希釈します。渦精力的に。車両制御としてE3B + PTUにDMSOを1:1,000に希釈します。未処理の対照として1.5mlのマイクロチューブに1 mLのE3B + PTUを使用してください。 </li><li> 96ウェルプレートの各ウェルに大口径のプラスチックトランスファーピペット、ペトリ皿からの転送の胚を用いて、胚あたり3ウェル、条件あたり3ウェル。長期治療中の蒸発を防ぐために、プレートの外側行と列（行AおよびE、列1および12）からの胚を省略する。外側のウェルはE3B + PTU300μlで充填することができる。適切にプレートの蓋にラベルを付けます。 </li><li>細かい傾いてプラスチック製のトランスファーピペットを用いて各ウェルからメディアを取り出します。胚を乾燥しないように迅速に働く。 </li><li>うまく対応に処理液を200μlを加える。未定義ふたをする適切なウェルに治療の追加を確実にするためのガイドとしてプレートをrneath。溶液中の化学物質を分配するためにピペッティングする前にボルテックス各チューブ。視覚的に各胚を処理液にあることを確認。胚は井戸の側にある場合には、処理液とよくにそれらを洗浄するためにクリーンなホールピペットを使用しています。 </li><li> 28.5℃のインキュベーターでプレートを置き胚を72ゼブラの蛍光について分析する。 </li></ol> 96ウェルプレートに胚の3。自動画像<ol><li>各ウェルに4 mg / mlのトリカイン10μlのを追加して、胚を麻酔。 注：以前の画像に胚を麻酔。 24-96ゼブラに、ゼブラフィッシュは、自発運動及び画像キャプチャ中に変化する光源への驚愕反応を示す。胚を麻酔して撮像中に動きを低減します。 </li><li>電動ステージで96ウェルプレートを置き、ステージを校正。顕微鏡自動的用ツァイス禅ブルー2011ソフトウェアを使用して、上と制御、 サンプルキャリアのオプションを選択し、 マルチウェル96を選択します。 調整]を選択します。舞台を校正するために段階的に指示に従ってください。 注：このステップの後のタイルボタンをオフにしないでください。タイルボタンをオフにすると、キャリブレーションの設定が失われる可能性があり、96ウェルプレートを再校正する必要があります。 </li><li>客観10倍と明視野（BF）の設定を使用して、陽性対照胚を特定し、蛍光シグナルがカメラが飽和していないことを確認して、BFとGFPのチャンネルのために適切に露出設定を設定します。シングル胚に焦点を当て、3トータルのZ-セクション、上記1の画像は50μmと現在の焦点面下の1が50μmを取得するための顕微鏡をプログラムします。 注：異なる組織、異なる焦点面を占有しているため、これは、それぞれのゼブラフィッシュの画像に焦点の心臓と肝臓で撮影されていることを確認します。 </li><li> GFP及び高炉channeを使用してタイル張りの画像を取得するために、ソフトウェアのパラメータを設定LS。 取得 ] タブで、[詳細設定 ] を選択します。 タイル領域を選択して、タイル。サークルウェルオプションを選択します。 NOTE：タイリングは、各ウェルの合成画像を作成するために使用される。単一のフィールド·オブ·ビューは、各ウェルの小部分のみを捕捉する。タイリング機能は、自動的に全体の十分の合成画像を作成して、各ウェルから複数の隣接するフィールド·オブ·ビューをキャプチャすることができます。各合成画像は、単一のウェルから数十個々の画像を含む場合、自動的にプレート当たり96合成画像をキャプチャすることが可能である。 </li><li> キャリアを選択し、[ 度90％を満たす 。 90％のフィルファクタを選択すると、各ウェルの面積の90％が合成画像に見えるように選択ウェルの複数の画像をキャプチャする。 NOTE：フィルファクタを選択すると、図は画像化される領域を表す表示されます。ウェルの面積が含まれる割合を選択それは、実験のために適切である。 </li><li> オプション ]で、必要なオーバーラップ量を選択します。 注：単一の代表的なイメージのために一緒にタイルをつなぎ合わせるときは5〜10％のオーバーラップは、画像間のスムーズな継ぎ目が可能になります。画像ステッチが不要な場合は、0％のオーバーラップを使用すると、撮影時間を減少させる。 90％のフィルファクタ及び5％のオーバーラップを使用して、単一ウエルの合成画像は、59の個々の画像からなる。 </li><li>撮影開始。顕微鏡は、画像を自動的に取得します。 </li><li>手動で組織特異的な蛍光（ 図1）のために、各ウェルの合成画像を検査します。 </li><li>注：化学物質曝露前実験的治療ウェルを観察しましたことを確認するための陽性対照で始めるのがベストです。 </li></ol> 96ウェルプレート内の胚の4。手動イメージキャプチャ注：結果を確認するためには、ACに20X長作動距離の対物レンズを使用手動帖より詳細な画像（ 図2）。 <ol><li>客観20Xと明視野（BF）の設定を使用して、陽性対照胚を特定し、蛍光シグナルがカメラが飽和していないことを確認し、適切にBFとGFPのチャネルに対して露出設定を設定します。 </li><li>手動で個々の胚とキャプチャ画像を識別。 注：露出設定が陽性対照胚用に選択されたら、設定を変更しないでください。各画像は、均一な条件下で捕捉されるように、これは蛍光強度の比較を可能にする。 </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

著者らは、競合する金融利害関係はありません。

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚で自動的に画像の組織特異的な蛍光の簡単な方法を説明します。プロトコルはツァイスアクシオオブザーバを使用して開発されました。禅ブルー2011ソフトウェアでZ1は、しかし技術は、合成画像を作成するためにタイリングを行うことができる電動ステージと顕微鏡制御ソフトウェアとの任意の倒立顕微鏡を使用して適合させることができる。電動ス?...

トランスジェニックゼブラフィッシュは、線維芽細胞増殖は1、レチノイン酸2因子 、ライブ胚において、3のエストロゲンシグナル伝達経路における活性を直接可視化を可能に開発されている。このようなツールは（蛍光強度の変化としてアッセイ）シグナル伝達経路を撹乱化学物質または組織特異的様式4（蛍光の局在の変化）でシグナル伝達を調節する化学物質のスクリーニングを可能にする。自動化された画像取り込みは、化学画面劇的5,6のスループットが向上します。ライブゼブラフィッシュにおける自動的アッセイ蛍光は、多くの場合、高価な、特殊な装置に依存している画面。いわゆる高含有量スクリーニングは、高分解能、定量的なイメージングが、共焦点顕微鏡、7,8のために装備、特殊なプレートリーダーを使用してのコストでの利点を提供します。このメソッドの目的は、ゼブラフィッシュ胚で自動的に分析組織特異的な蛍光である標準的な落射蛍光顕微鏡を用いて96ウェルプレート中。組織特異的蛍光は、この技術を用いて区別することができ、特殊なプレートリーダーまたはハイコンテントスクリーニング装置へのアクセスを欠いている実験室のための合理的なアプローチであり得る。 このプロトコルでは、3日後に受精（DPF）で組織特異的エストロゲン受容体（ER）ライブゼブラフィッシュにおけるアゴニストを検出するための自​​動化されたイメージングを使用する。トランスジェニック系統のTg（5xERE：GFP）c262/c262は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の上流に5タンデムエストロゲン応答エレメントDNA配列（ERE）を含む3。リガンドの非存在下で、ERは、通常は不活性である。リガンド結合は、受容体がERE DNAと結合し、転写9を調節することができるように、コンフォメーション変化を誘発する。 5xERE：GFP魚ERモジュレーターのための化学ライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、エストロゲン汚染物質の環境水サンプルをスクリーニングするために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

ゼブラフィッシュ胚は、小分子の大規模スクリーニングのための強力なツールである。蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、しばしば、遺伝子発現を調節する化学物質を同定するために使用される。ライブゼブラフィッシュで蛍光を分析化学の画面は、多くの場合、高含有量のスクリーニングのために高価な、特殊な装置に依存しています。私たちは、電動ステージ自動的に画像ゼブラフィッシュ胚に標準落射蛍光顕微鏡を用いて手順を説明し、組織特異的な蛍光を検出。 GFPの発現を介して、エストロゲン受容体活性を報告するトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、組織特異的にレポーターを活性化するエストロゲン受容体のリガンドをスクリーニングするための半自動化された手順を開発した。このビデオでは、96穴プレートに24〜48時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を配列し、エストロゲン受容体に結合する小分子を追加するための手順について説明します。 72〜96 HPFで、それぞれの画像は、ウェルからプレート全体が自動的に収集され、手動で組織特異的な蛍光検査される。このプロトコルは、心臓弁ではなく、肝臓での受容体を活性化エストロゲンを検出する能力を実証する。

図1は、96ウェルプレートの各ウェルからの合成画像を示している。各合成画像は、5％の画像の重複を有する59個々の画像から構成されている。ライブゼブラフィッシュは、各ウェル内でランダムに配向していることに注意してください、まだ我々は、肝臓から心臓内の蛍光を区別することができます。明視野画像は、ゼブラフィッシュの方向性を評価し、形態異常（ 図1A?...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。 

ビデオ: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

生物学

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

スモールハーツの半自動光ビート解析

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...