この作品は2009年のアメリカの回復と再投資法を通じて授与資金を含むANI、、とNIH R01 GM87130でたたくのNIH R01 GM56244によってサポートされていました

1。胚の単離 注 ：マウスを含むすべての操作が適切な動物のケアと使用ポリシーとプロトコルに従い実施すること<ol><li>雌マウスの交配のプラグインの存在交配後の朝にチェックして、別のケージに入れて、スタッドの男性から交尾の雌を分離。嵌合プラグが観測された日の正午は、開発の胎生0.5（E0.5）とみなされます。 </li><li> E8.5で、（または必要な段階、異なる場合）、承認されたプロトコルを使用して、マウスを犠牲にする。 </li><li> 70％エタノールで安楽死させた動物の腹を濡らし、腹腔を開く。胚の存在を示す着床部位が各子宮角（図1A）の長さに沿って配置&quot;糸に通したビーズ&quot;として見られている。はさみを使用すると、両方の子宮角を取り除く分離するために個別に各移植部位を切断（図1B）と室温（RT）を含む100mMペトリ皿の中に置いてください解剖の培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、20mMのHEPES、pH7.4、中、60μg/ mlのペニシリン、2mMのストレプトマイシン）。 </li><li>鉗子を使用して、子宮組織（図1C）から各胚および周囲の膜を除去し、新鮮な解剖の培地の中に置いてください。 </li><li>鉗子を用いて解剖顕微鏡下で個々の胚を隔離する。開発のこの段階で、胚はコンタクトdeciduum組織、内臓卵黄嚢と羊膜頭頂卵黄嚢に囲まれています。羊膜は胎児と直接接触している透明な膜です。内臓卵黄嚢は、羊膜と頭頂卵黄嚢の間に位置しており、容易に胚を育てる著名な血管の存在によってE8.5 - E9.5の胚で区別される。その周囲の膜からそれぞれの胚を取り出して、余分な血液を除去するために解剖のメディアを含む新しいプレートに個別に転送する。発達段階は胚から胚へと同腹の間で異なることがあります。代表E8.5胚及び代表E9.5の胚は、図1Dに示されています。 </li><li>解剖のメディア（上記のステップ4で説明）の200μlを含む1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれぞれの胚を移す。 </li></ol> 2。隔離された胚の均質化<ol><li>各エッペンドルフチュー​​ブに、200μlの量（DPBS 1X Dubbeccoのリン酸で希釈緩衝生理食塩水）にコラゲナーゼII型の20台を追加。 </li><li>ゆっくりと20分間100rpmで37℃のシェーカーにサンプルを振る。 </li><li>細胞の塊を破壊するためにピペッティングしてよく懸濁します。 </li><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブの上に配置滅菌セルストレーナー（40μmのメッシュの大きさ）の上に細胞懸濁液を適用します。 </li><li>すぐに分離を完了するために、セルストレーナーの上に室温1X DPBS 600μlを適用する。ストレーナーを捨てる。 </li><li> 4で試料を遠心° Cを5分で4000 × gで。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> RT 1XのDPBS 1ml中にペレットを再懸濁する。 </li><li>室温で1分間4000 × gで試料を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> RT郭清のメディアを200μlにペレットを再懸濁します。 </li><li>胚細胞を数える。平均3〜5 × 10 6 cells/E8.5胚があります。 </li></ol> 3。クロスリンクしたクロマチン<ol><li> 1％のホルムアルデヒドの最終濃度の200μlをサンプルに37％ホルムアルデヒドの5.6μlを添加する。 </li><li>室温で10分間サンプルをインキュベートする。 </li><li> 4℃で3分間4000 × gで試料を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> 80μlの/ mlのプロテ​​アーゼ阻害剤カクテル（PIC）を含む冷1X DPBSで細胞を再懸濁します。 </li><li> 4で試料を遠心℃で3分間4000 × gで。 </li><li>上清を捨てる。このステップでは、サンプルは-80℃で凍結することができます冷凍、架橋試料は数ヶ月間安定です。 </li></ol> 4。超音波処理<ol><li> RT SDS溶解緩衝液（1μlのPIC/800液総量で新鮮な付加PICと50mMのトリス- HCl（pH 8.1）、10mMのEDTA及び1％SDS）100μlに細胞ペレットを再懸濁します。再懸ときは、再懸濁を促進するためのRT SDS溶解バッファーの追加の100 ulを加える。ピペッティングし、反転によってよく混ぜる。 </li><li>氷上で10分間細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li> 200〜DiagenodeのBioruptorを使用して500塩基対にせん断DN​​Aに溶解した細胞を超音波洗浄™UCD200（5分× 8回：高（320ワット）電源オン30秒on/30秒の振幅の設定はオフ）。サンプルは、氷スラリーで囲む必要があります。サンプルは4 ° Cを超える温めたり、フリーズしたりしないでください。利用可能なsonicatorsの多くの種類があります。超音波処理の条件は、約500 bpの長さに架橋DNAが切断されるため、各ソニケーターのために最適化する必要があります。 </li><li> 4で超音波処理試料を遠心℃で10分間、14000 × gで。 </li><li> T新鮮なエッペンドルフチュー​​ブを氷上で冷却した上清をケース温度。 </li><li> 5アリコートの最大に超音波処理サンプルを分ける。我々は経験的にone E8.5胚は5アリコートに分割できることを決定した。小規模または大規模なサンプルサイズは、それに応じて拡大縮小することができます。このステップでは、サンプルは-80℃で保存することができます℃でさらに使用するまで。 </li><li>クロスリンクが逆になるステップ6まで-20℃での入力や店舗として使用するための準備one分量。 1μl/800で新鮮な付加PICを含むチップ希釈バッファー（16.7 mMのトリス- HCl（pH 8.1）、1.2 mMのEDTA、1.1％トリトンX - 100、167 mMのNaClおよび0.01％SDS）で10倍、他のアリコートを希釈するμlのBuffer。 </li></ol> 5。事前にクリアし、免疫沈降<ol><li>サーモン、精子のDNA /タンパク質4時またはGアガロース- 50％のスラリー° C、回転と、1時間の75μlの事前クリア希釈上清。またはプロテインGビーズをチップに使用する抗体によって決定されるべきどちらタンパク質の使用。プロテインGビーズがヤギの抗体またはマウスIgG 1抗体のために推奨されているのに対し、例えば、タンパク質ビーズを、ウサギの抗体をお勧めします。詳細については、ビーズの製造業者の推奨事項を参照してください。 </li><li> 1分間2500 × gで4℃で遠心する。 </li><li>新しい、事前に冷却エッペンドルフチュー​​ブに上清を移す。 </li><li>事前にクリアアリコートに抗体（4μgの/サンプル）を追加し、4℃で一晩インキュベート° Cを回転した。 </li></ol> 6。クロマチンタンパク - ビーズ複合体を洗う<ol><li> 4時に各バイアルとインキュベートにサケ精子DNA /プロテインAまたはGアガローススラリーの60μlを加え、℃で1時間の回転とC。上記の手順3で事前にクリアするのに使用されるのと同じビーズの種類を使用してください。 </li><li> 1分間1,000 × gで4℃で遠心する。 </li><li>注意深く上清を除去して捨てる。氷の上にDNA -タンパク質 - ビーズ複合体をしてください。 </li><li>としての洗浄バッファー1、2、3、4で以下の指示ペレットを再懸濁し、洗浄する。 1〜3 ° Cとこれらのバッファで洗浄を4で実行する必要がある4に冷やしすべきバッファ℃を洗うバッファ4は、このバッファーで室温と洗浄にあるはず洗浄は室温で行ってください。各洗浄は適切な温度で回転で5分間です。 4℃（洗浄バッファー4回洗浄し、室温）1分間1000 × gでの各洗浄、遠心分離に続いて、その後、慎重に吸引したり、上清を取り除く。 </li></ol> バッファ1：低塩の洗浄緩衝液（20mMトリス- HCl（pH 8.1）、2mMのEDTA、1％トリトンX - 100、 150mMのNaCl及び0.1％SDS）、1ミリリットル× 2回洗浄。 バッファ2：高塩の洗浄緩衝液（20mMトリス- HCl（pH 8.1）、2mMのEDTA、1％トリトンX - 100、 500mMのNaCl及び0.1％SDS）、1ミリリットル× 2回洗浄。 バッファ3：塩化リチウム（LiCl）の洗浄緩衝液（10mMのトリス- HCl（pH 8.1）、1mMのEDTA、1％IGEPAL - CA630、 0.25 M塩化リチウム、1％デオキシコール酸（ナトリウム塩））、1ミリリットル× 1洗浄。 バッファ4：TE緩衝液（10mMトリス- HCl（pH 8.1）、1mMのEDTA）、1ミリリットル× 2回洗浄。 7。クロマチン - 抗体複合体の溶出<ol><li>新しく調製した溶出バッファー（1％SDS、0.1 M 炭酸水素ナトリウム）を250μlで洗浄したクロマチンタンパク-ビーズ複合体を再懸濁します。その後、回転で15分間室温でインキュベートする5秒間激しくボルテックスサンプル、。 </li><li>室温で1分間2500 × gで遠心し、新しいエッペンドルフチュー​​ブに溶出液を移す。 </li><li>ステップ1と2を繰り返し、同じエッペンドルフチュー​​ブに溶出液を組み合わせる。溶出液を室温で維持する必要があります。このステップの完了時に、溶出液をさらに使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol> 8。クロスリンクを逆にしてDNAを回収する<ol><li> 500μlの溶出液（入力制御のための40μL/ mL）について、20μlの5 M NaClを追加します。 </li><li> ℃で一晩に4時間、水浴で65℃溶出液を加熱する。 </li><li>各サンプル（入力制御を含む）10μlのDNA断片のサイズをチェックするために0.1から1 kbpの範囲をまたがるサイズマーカーの隣の2％アガロースゲル上で実行することができます。 DNAがスメアではなく鋭いバンドとして表示されます。ゲルの実行中にサンプルの残りは65 ° Cで残すことができます。 </li><li> QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて各サンプルからDNAを回収する。 QIAクイックスピンカラムと500μlのサンプルにイソプロパノール200μlのシリカメンブレンにDNAを吸着を最適化するために、600μlのQGのバッファを（キットに付属）を追加します。 QGのバッファは、サンプルのpHを簡単に測定が可能pH指示薬が含まれていることに注意してください。サンプルの色が紫に黄色から判明した場合（pH値&gt; 7.5）を混合した後、試料と混合するための3 M酢酸ナトリウム10μlの液（pH 5.2）に追加します。これは、列のビーズへのDNA結合を最大化するために混合物のpHを減らすことができます。 </li><li>列をロードする前に、任意のSDSの沈澱物が存在するかどうかを判断するために混合物を確認してください。 SDS沈殿が発生した場合、サンプルはで暖めすべき42℃の水浴沈殿が消えるまで。 </li><li> QIAクイックスピンカラム（キットに含まれる紫色の列）に混合物を700μlをロードし、1分間14000 × gで室温で遠心。先に進む前に、カラムからのフロースルーを捨て、残りのサンプルでこの手順を繰り返します。 </li><li>カラムを洗浄するために500μlのQGのバッファを追加。 2分間14000 × gで室温で遠心する。次に進む前に、カラムからのフロースルーを捨てる。 </li><li>メーカーの指示に従ってエタノール追加されているPE洗浄緩衝液（キットに付属）の700μlを持つカラムを洗浄します。 1分間14000 × gで室温で遠心する。次に進む前に、カラムからのフロースルーを捨てる。 </li><li>完全にカラムからPEのバッファの残りを除去するために遠心分離のステップを繰り返します。フロースルーとコレクションチューブを捨てる。 </li><li> 60μlのEBのバッファー（キットに付属の溶出バッファー）を加えることで新鮮なエッペンドルフチュー​​ブにカラムからDNAを溶出する。 </li><li> 1分間14000 × gで室温で遠心する。溶出したDNAを検出するまで-20℃で保存することができます。回収された物質260の測定値は通常、一定分量あたり〜6月7日UGの合計回復のために、90〜120 ngの/ ULの濃度を示している。しかし、これらのサンプルの280分の260比はRNAがサンプル中に存在することを示唆し、通常は&gt; 1.8です。こうして回収されたDNAの正確​​な量が少なくなることがあります。 </li></ol> 9。回収したDNAの解析<ol><li> SDSはPCR Taqポリメラーゼの活性を妨害することができます。 SDSはPCRを実行する前に完全に削除する必要があります。 1分間14000 × gで4℃、残存SDSと遠心° Cを沈殿させるために氷の上にDNAをインキュベートする。新しいエッペンドルフtube.Thisのステップに上清を移すことを強くお勧めします。 </li><li> DNAの溶出液は、従来のPCR法によって、または、解析を行うそれぞれの配列に特異的なプライマーを用いた定量的リアルタイムPCR（Q - PCR）のいずれかによって検出することができます。全DNAの溶出液から5〜10μlのは、1つのPCRまたはQ - PCR反応に用いることができる。入力制御を用いたPCRは、他の試料の量と比較してDNAの5〜10倍希釈で行うことができます。 PCRおよびQ - PCRの条件は、しかし、出発原料の限られた量は、追加のPCRサイクルを必要とする、変化します。従来のPCR検出のために、我々は40サイクルから始め、必要に応じて調整することをお勧めします。 </li></ol> 10。代表的な結果我々は、E8.5とE9.5の胚（図2）の両方からChIPを行うためにこのプロトコルを使用している。結果はmyogeninがE8.5とE9.5の胚におけるmyogeninプロモーター上に存在していることを示している。沈降精製DNAは、従来のPCR（図2A）および定量的リアルタイムPCR（図2B）によって分析した。これとは対照的に、myogeninが発現していない卵黄嚢、のmyogeninプロモーターへの結合myogeninの兆候はなかった。インターフェロン-γ（IFNγ）myogenin結合部位に一致するシーケンスが含まれているプロモーターは、負のシーケンス制御として使用された。予想通り、myogeninは、テストされた組織サンプルの任意のIFNγプロモーターに結合されていませんでした。骨格筋の前駆体である、、E8.5および9.5胚では、myogeninは、特に体節（6,10図3）で表されます。したがって、結果はmyogeninがE8.5とE9.5での体節にmyogeninプロモーターに結合していることを示している。 <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。E8.5胚の解剖。 （）絶縁子宮角（上部パネル、下部のパネルに示すように高い倍率）。 （B）子宮角は、個々の胚を含む個々の着床部位を分離するためにはさみで切る。 （C）胚は、解剖時の子宮組織から突出。矢印は、まだ余分な胚組織で覆われた胚をマーク。同じごみから（D）二E8.5胚。左の胚は回転のプロセスを開始していません。右側の胚は回転を受けています。右端 - 代表E9.5の胚。 <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。ChIPアッセイがE8.5とE9.5の胚におけるmyogeninプロモーターへの結合myogeninを示す。 myogenin抗体や非特異的IgGは転写の開始部位に-79から69の相対的にmyogeninプロモーターの部分を増幅するプライマーを使用して実行されたを使用してChIPの実験から精製したDNA5μlの中（上）従来のPCR解析その-12転写開始部位の〜1075塩基対上流に位置するmyogenin結合部位に一致するシーケンスが含まれているIFNγプロモーターの部分を増幅するプライマーに位置するmyogenin結合部位が含まれています。使用されるIFNγのプライマー配列は、5&#39; - GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC - 3&#39;および5&#39; - TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC - 3&#39;であった。 （）で使用したのと同じサンプルの（下）定量的リアルタイムPCR解析。市販標準偏差 - データが入力+ /の％としてプロットされます。 <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。Myogeninが特にE8.5及びE9.5の胚の体節に発現している。 myogeninのin situハイブリダイゼーション全体のマウントは、体節内の特定のmRNAの発現を示しています。 200μm程度 - E8.5画像のサイズのバー。 E9.5画像のサイズのバー - 500μmの。

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

動物実験は、マサチューセッツ医科IACUCの大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

説明したChIPのプロトコールでは、我々は、筋原性レギュレータmyogeninが単一のE8.5及びE9.5の胚に存在する骨格筋の前駆体の組織におけるmyogeninプロモーターに関連付けられていることを示している。先行研究では、広範囲にin vitroでのゲルシフト実験の初期にはin vitroで翻訳や細菌生産myogeninと11月20日標的遺伝子の調節配列の該当する部分をコードする放射性標識DNA...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

クロマチン免疫沈降（ChIP）はタンパク質を識別するための強力なツールです：1-3生きた細胞のコンテキストで発生するクロマチンの相互作用。この手法は、広く一次組織で、組織培養細胞の中で利用し、より少ない程度にされています。特に開発の早い時間にげっ歯胚組織、チップのアプリケーションは、組織の限られた量と胚の細胞と組織型の不均一性によって複雑になる。ここでは、解離胎生8.5（E8.5）の胚を用いてChIPを行うための方法を提示する。クロマチンの相互作用：単一のE8.5胚からの断片化クロマチンは、コントロールおよび特定の蛋白質の調査のための調査員に十分な材料を可能にするfiveアリコート、するに分けることができます。 組織特異的遺伝子発現プログラムの仕様中にクロマチンの相互作用：我々は、タンパク質を文書化し始めるためにこのテクニックを利用してきた。すべての相互作用が発生するかどうかといった区別なく、クロマチンの相互作用、のサブセット、または単セルのタイプ（S）：結果は、タンパク質の検出であるため、胚の細胞型の不均一性は、必ずしもこの手法の適用を制限する。しかし、組織特異的遺伝子発現の開始時または、以下の組織特異的遺伝子の検査は、2つの理由で実現可能です。最初に、組織特異的因子の免疫沈降は、必ずしも要因が発現する細胞の種類からクロマチンを分離します。遺伝子の活性化に関連付けられている第二に、コアクチベーターとヒストンの免疫沈降を含む翻訳後修飾は、遺伝子と遺伝子がされているか、アクティブ化された細胞のタイプの遺伝子調節配列で発見されるべきである。テクニックは、ほとんどの組織特異的遺伝子の活性化のイベントの調査に適用可能であるべきである。 後述の例では、我々は、骨格筋特異的遺伝子のプロモーターにおける結合因子を調べるためにE8.5及びE9.5のマウス胚を利用した。体幹と四肢の骨格筋が形成する元となる前駆組織である体節は、、E8.5 - 9.5 4,5で存在している。 Myogeninは、骨格筋の分化6月9日に必要な調節因子である。データはmyogeninがE8.5とE9.5の胚においてそれ自身のプロモーターに関連付けられていることを示しています。 myogeninが唯一の開発6,10のこの段階で体節で表されているため、データはそれ自身のプロモーターとmyogeninの相互作用は既にE8.5胚における骨格筋の前駆細胞で発生したことを示している。

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K ビュー.  University of Massachusetts Medical School. 我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。

ビデオ: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

アーリーステージのニワトリ胚に成長因子コートビーズの配置

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

生物学

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...