1。標準オペレーティング·プロトコル 1.1装置のセットアップとサンプル調製<ol><li>インストールIZONコントロールSuiteソフトウェアを使用してコンピュータに楽器を接続します。 </li><li>使用するナノ細孔のサイズを選択します。サイズとEVの濃度測定NP150のために（ターゲットサイズの範囲85から300 nm）以下NP200（ターゲットサイズ範囲100から400 nm）で最も頻繁に使用されている。 220nmのフィルターを通して試料を通過させることによって、例えば、より大きな電気自動車の除去を伴うプロトコルを用いて単離されている電気自動車を操作する場合、NP100孔（目標サイズ範囲70から200 nm）を使用することができる。異なるプロトコルを使用して単離された生物学的試料または電気自動車における電気自動車を操作するときにはあまり頻繁に詰まるように、NP200を使用することができる。 （ - 600nmの目標サイズ範囲150）またはNP400 NP300などのような他のナノ細孔（目標サイズ範囲200から800ナノメートル）、あるいはさらに大きなナノ細孔は、EVの大きなタイプに使用することができる。 </li><li>ポリスチレンcalibrを選択してくださいステップ1.1.2で選択されたナノ細孔を補完ation粒子。 NP100、NP150とNP200ナノ細孔の場合はそれぞれ、CPC100、CP100とCPC200粒子を使用する。正確なサイズの推定には、キャリブレーション粒子は未知の粒子のような同じような大きさを持っていることを確認してください。 </li><li>キャ粒子、渦短時間（30秒）の均質性を確保するために。必要に応じて、凝集物を除去するために超音波処理を適用します。 </li><li>少なくとも40μlの容量で標的濃度にPBS中のキャリブレーションの粒子を希釈する。注：目標濃度は、ステップ1.1.2で選択されたナノ細孔によって異なります。標的濃度は、ナノ細孔が供給される。 </li><li>適用し、直接下流体セルにPBSを78μlの削除;ナノポア位置にあるときに下側流体セルに電解液を適用するときに下側流体セルのこの濡れは、ナノポアの下に気泡形成のリスクを減少させる。 </li><li>楽器の4腕上にナノ細孔を置きます。使用デジタルノギスは、2つの反対のアーム間の距離を測定し、「ストレッチ」入力フィールドにmm単位の距離を入力して、ナノ細孔のストレッチを校正するために「ストレッチを校正」をクリックします。 </li><li>低い流体セルに78μlのPBSを再適用する前に、サイドホイールを回すので、楽器の対向するアームとの間の距離を増加させることにより、47ミリメートルに、ナノポアを伸ばす。 注：電気的干渉が実質的測定の質に影響を与えることができる。 IZONコントロールSuiteソフトウェアを実行するためにラップトップを使用する場合は、ノートパソコンが接地ソケットとプラグを使用して、電力網に接続されていることを確認してください。携帯電話はまた、電気的干渉の原因になる可能性があり、機器の近くに保った。電気的な干渉は、多くの場合、ルートを持つ平方根（RMS）ノイズ&gt; 10 pAの平均、ベースライン電流の絶えず繰り返さピークとして観測される。 注：ほとんどすべてのバッファがTRPS characteriための校正粒子やEVを希釈するために使用することができzation。塩の存在は、電流の確立のための前提条件である。 EV測定ではバッファーとしてPBSを使用しています。較正粒子が常に正確な測定を保証するために、電気自動車と同様の緩衝液で希釈されるべきである。 </li></ol> 1.2。測定のための最適な設定を決定します注：記録する前に、最適な測定設定を確立することが重要である。ナノ細孔を通過する粒子によって引き起こされる封鎖大きさが適用され、ストレッチと印加電圧に依存する。信頼性の高い測定のために、RMSノイズは0.1 nAの&lt;10 Paとモードブロッケード大きさでなければなりません&gt;でなければなりません。 <ol><li>ナノ細孔に上限流体セル遮蔽ケージを置き、上部流体セル内に希釈された校正用粒子40μlのをご紹介します。 ≥0.8キロパスカル陽圧を適用するためにVPMを使用してください。 </li><li>キャリブレーションによって引き起こされる封鎖イベントを分析しながら、ゆっくりと44ミリメートルに向かって適用されるストレッチを削減粒子。注：細孔径を小さくするとナノポアを通る粒子の移動性が低くなり、したがって、粒子速度が低下する。しかし、細孔の相対的な増加遮断に大きな封鎖イベントが改善された信号対雑音比が得発生する。電圧を増加させると、さらに封鎖大きさを増加させることができるだけでなく、RMSノイズを増加させることができる。 </li><li>適切な封鎖イベント（ 図1c）は 「信号トレース」パネルで観察されるまで、ストレッチを減らします。 （モード&gt; 0.1 nAの）と対応する粒子の速度は&gt; 100 /分である。注：粒子速度がそれほど厳しくカットオフで、少なくとも500個の粒子の測定が理想的であるように、しかし、&lt;100 /分の粒子速度は、少なくとも5分の持続時間を記録する原因となる。 （現在、サンプル希釈が行われるべき場合）2,000 /分よりも高い粒子速度はより正確な測定をもたらすことができる。 </li></ol>キャリブレーションの1.3測定粒子、のスーパー流体セルの洗浄とサンプル測定<ol><li>多形神経膠芽腫細胞株U87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清からのこのセクションのEVを特徴とする。これらの電気自動車の単離および調製は、先に説明し18を可視化されている。 </li><li>上部流体セル内の校正粒子を配置します。 VPMとレコード&gt; 500粒子を用いた（例えば、0.8キロパスカルのための）圧力を適用します。 </li><li>マルチ圧力測定を行う場合には、（1.0キロパスカルまでなど）に加えられる圧力を増加させ、第2の較正ファイルを記録する。注：0.2キロパスカル差の最小値が必要になります。 </li><li>上部流体セルからのキャリブレーションサンプルを削除します。残留粒子を除去し、100μlのPBSで上部流体細胞を3回洗浄する。上部流体細胞内への試料の導入の前に、上部流体セルから残留PBSを除去するために、糸くずの出ないティッシュを使用しています。 </li><li>上部流体セルにサンプルを紹介。ベースライン電流が較正粒子を測定する場合に観察されたベースライン電流の3％以内であることを確認します。そうでない場合には3％以内、ベースライン電流を安定化するために、以下に説明戦略を適用します。キャ粒子に適用されるような正確な圧力を適用し、サンプルファイルを記録します。 注：パーティクル率プロットは、一定の粒子検出（ 図2a）を表示する必要があります。粒子検出の突然の中断、ベースライン電流の急激な低下、またはRMSノイズの急激な増加の場合には、細孔が目詰まりすることができる。このようにして、録音を一時停止。ベースライン、タップを復元するか、シールドキャップをひねり、プランジャーを適用するか、完全にナノ細孔を除去し、脱イオン水で洗浄し、楽器でそれを交換するために。 注：または、約5分間VPMから最大圧力との組み合わせで47ミリメートルにナノ細孔のストレッチを増加させる。 </li></ol> 1.4データ解析<ol><li>をクリックして「;ソフトウェアの分析セクションに入るために、データ &quot;タブを分析します。 「未処理のファイル」と選択する「プロセスファイル」を右クリックすることでキャリブレーションし、サンプルファイルを処理します。 </li><li>キャリブレーションの録音に結合するために「校正済み」欄にサンプルの横にあるサンプルファイルをチェックボックスをクリックします。対応するサンプルと較正ファイルを選択し、「OK」をクリックします。注：マルチ圧力校正オプションは、複数のキャリブレーション·ファイルに結合する複数のサンプルを左の「マルチ圧力キャリブレーション」タブを選択し使用した場合。 </li><li>一度成功した結合された、IZONコントロールSuiteソフトウェアは、このようなサイズ分布（ 図2b）、ベースラインの持続時間、半値幅（FWHM）と濃度分析などの異なるサンプルの特性を表示します。オプション：各サンプルについて、個別のデータポイントは、カンマ区切りのファイルとしてエクスポートすることができます。 </li></ol> 2 Alternativeプロトコル - キャリブレーションビーズでサンプルをスパイク注：単離された電気自動車を操作する場合、一般に、標準的な操作手順を使用することができる。生物学的サンプル、または大規模なタンパク質凝集物で汚染された孤立したEVの製剤中の非絶縁電気自動車を操作する場合、機器を操作することは困難な場合があります。これらの課題は、主にナノ細孔ブロッキング（ベースライン電流の急激な低下）、キャリブレーション測定または同一のサンプル（ 図3a）の間の粒子率の有意差の3％以内にベースライン電流を回復することができない率の高さで構成されています。電気自動車を定量化するための代替プロトコルこれらの問題を表示するサンプルについては17を開発した。この方法は、目的のサンプル（ 図3b）に大きなポリスチレンキャリブレーションビーズの導入に依存している。この代替プロトコルの詳細な手順については後述する。 2.1。サンプル準備注意：代替方法を使用してサンプルを調製する、それはまた、周囲の1のEV対ビーズ比を確立することが望まれる場合には、サンプル」のみのキャリブレーションビーズ」を含めることが不可欠である、正確な「ゲーティング」を可能にするために緩衝液中に存在する（例えば、タンパク質凝集のため）バックグラウンド粒子の数を決定するためのキャリブレーションビーズ。 <ol><li> 300×gで7分間、細胞培養上清の遠心100μlの</li><li> 20μlのPBSに20μlの上清を加え、75回の10μlの335 nmのポリスチレンビーズ（在庫7e10 / ml）で希釈。 </li></ol> 2.2。サンプルの測定<ol><li>最適な計測器の設定を決定するために、1.2節で説明した戦略を使用してください。 </li><li>最初のサンプル &#39;のみのキャリブレーションビーズ」を測定します。小さな非ビーズ粒子のバックグラウンドの検出が可能な限り低くなっていることを確認し（ビーズの&lt;10％）。 </li><li>各個別のSAを測定しますmple一度均等に異なるサンプルにわたってナノポア条件の変動を分配するために、反復を記録する前に。各サンプルの少なくとも3回の反復を測定する。 </li><li>全てのサンプルの記録が終了した後に「キャリブレーションビーズのみを &#39;サンプルを再測定。 </li></ol> 2.3。データ分析注：代替プロトコルを使用する場合は、IZONコントロールSuiteソフトウェアを排他的に使用が濃度計算のために十分ではない。付加的な表計算ソフトが必要となる。 表1は、図3に示すサンプルの濃度計算の例を示している。 <ol><li> 「キャリブレーションビーズのみ」のサンプルと1つ以上のサンプルファイルを開きます。 </li><li> （nAの中で）イベントサイズがEVやポリスチレンビーズとを区別するためのカットオフとして使用することができる封鎖決定する。ポリスチレンビーズ集団の左ベースに対応する封鎖値（NA）を決定する（ <st栄&gt; 図3b）。注：すべての測定値のビンのサイズの等しい設定を確認します（「個人ブロッケード·トレース」下の「ポップアップ」ボタンをクリックしてアクセスされる「ViewSettings」で調整することができます）。 </li><li>試料の「粒子解析の概要」タブをクリックすることで各サンプルの総粒子数の値を取得します。 </li><li>ステップ2.3.2で決定したカットオフレベルを使用してデータセットをフィルタ処理する。 「データのフィルタリング」ポップアップを選択することによって。表示のみのカットオフよりも小さい粒子。 </li><li> 「粒子解析の概要」から各サンプルについて、EV·カウントの値を取得します。 </li><li>キャリブレーションビーズの量を決定するために、総粒子からEVの量を引きます。 </li><li>キャリブレーションビーズカウントでEV数を割ることによって、EV対ビーズ比を決定します。 </li><li>各＆について決定比率を平均して平均バックグラウンド比を決定する＃8220;唯一の &quot;キャリブレーションサンプルをビーズ。各個別のサンプルからこの値を引きます。 </li><li>各サンプルの電気自動車の濃度を決定するためのキャリブレーションビーズの濃度によって調整されたEV対ビーズ比を乗算する。 </li><li> EVサンプルにキャリブレーションビーズを添加することによって導入されたEV希釈係数によってステップ2.3.9に見られる濃度を掛ける。注：例サンプルセットアップでは、PBSおよびキャリブレーションビーズ中の試料の全希釈は2.5倍であり、従って、ステップ2.3.9に見られる濃度は、生のEVの試料濃度を決定するために2.5を乗じれるべきである。 </li><li>そのような平均、標準偏差およびレプリケートの各グループの平均値の標準誤差などの統計を計算します。 注：いくつかのケースではEVやスパイクポリスチレンビーズ間で重複が観察される。 EV濃度の過小評価のための補正が必要な場合、スパイクされたポリスチレンビーズなしの試料は、測定されるべきである。同じカットを使用してくださいスパイクされたポリスチレンビーズの範囲内EVの比を計算するために、「ビーズ対EV」比を決定するステップ2.3.2で決定されるようにオフ。このビーズ対EV比率はステップ2.3.8で決定し、EV対ビーズ比に追加する必要があります。 </li></ol> 2.4。オプション：別の方法を使用して、EV径分布。 <ol><li>コントロールSuiteソフトウェアで二度記録したサンプルを開きます。 </li><li>上記決定されるカットオフよりも大きいだけ表示粒子への試料の一つのフィルタオプションを設定します。これは、キャリブレーション粒子が表示されます。 </li><li> 「キャリブレーションファイル」を濾過した試料を設定し、キャリブレーションビーズのモードサイズを入力してください。 </li><li>カップルサンプルファイルおよび1.4.2で説明したようにステップ2.4​​.3で作成した「キャリブレーションファイル」。サンプルファイルは現在、スパイクされたキャリブレーションビーズに基づいてEVやキャリブレーションビーズの両方のサイズ分布が表示されます。 注：標準のオペラティンプロトコルは、ほとんどの場合、EVのサイズ分布を決定するために十分であろう。時には、しかし、正確な緩衝液成分は不可能興味のある電気自動車と同じ緩衝液中にキャリブレーションビーズのサンプルを調製することを可能にするどの（血漿または尿中など）未知である。較正粒子でスパイクEVサンプルは、これらの特定の条件でEVサイズ推定のために使用することができる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.+Nature+reviews.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews.</a> Drug discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer--the+emerging+science+of+cellular+'debris'.">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'.</a> Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+function:+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology.">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9, 871-881 (2008).</li><li>Bobrie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+supports+exosome-dependent+and+-independent+mechanisms+that+modify+the+tumor+microenvironment+and+can+promote+tumor+progression.">Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression.</a> Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET.">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nature medicine. 18, 883-891 (2012).</li><li>Al-Nedawi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+transfer+of+the+oncogenic+receptor+EGFRvIII+by+microvesicles+derived+from+tumour+cells.">Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells.</a> Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).</li><li>Dommelen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+exosomes:+opportunities+for+cell-derived+membrane+vesicles+in+drug+delivery.">Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).</li><li>Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+detection+of+microparticles+and+exosomes.">Innovation in detection of microparticles and exosomes.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).</li><li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+sizing+of+nano/microparticles+with+a+tunable+elastomeric+pore+sensor.">Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor.</a> Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).</li><li>Kozak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+size+and+zeta-potential+measurements+of+individual+nanoparticles+in+dispersion+using+size-tunable+pore+sensors.">Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors.</a> ACS. 6, 6990-6997 (2012).</li><li>Willmott, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+tunable+nanopore+blockade+rates+to+investigate+colloidal+dispersions.">Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions.</a> Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).</li><li>Roberts, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+pores+for+measuring+concentrations+of+synthetic+and+biological+nanoparticle+dispersions.">Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions.</a> Biosensor. 31, 17-25 (2012).</li><li>Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variable+pressure+method+for+characterizing+nanoparticle+surface+charge+using+pore+sensors.">A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors.</a> Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).</li><li>Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Particle+Velocity+and+Measurement+Sensitivity+by+Changing+Pore+Sensor+Dimensions.">Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions.</a> Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).</li><li>Vrij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+nanosized+extracellular+membrane+vesicles+with+scanning+ion+occlusion+sensing.">Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing.</a> Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. (3037), (2012).</li><li>Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+nanoparticulate+drug+delivery+system+using+scanning+ion+occlusion+sensing.">Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing.</a> Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).</li></ol>

概説したプロトコルと、この原稿の執筆の開発は、財政的にオランダの脳財団、シューマッハクレイマー財団、Bohnenn基金によって、部分的にサポートされています。このビデオ記事の生産は、部分的にIZONによってsponsortedた。

定量化とのTRPを使用して、電気自動車の大きさの特徴付けのためにこの原稿募集の方法論に記載されているプロトコルを。のTRPプラットフォームの主な利点は、小さなサンプルサイズ、比較的短い測定時間と必要なサンプル操作の欠如である。 正確なのTRP測定のための前提条件は、校正とサンプルの測定値の間で同一の条件を維持することです。これは、同一のバッファの使用方法ならびにそのようなナノ細孔の大きさ、電圧、印加された圧力と同一の機器の設定を包含する。オリジナルのVPMは、それによって、サンプル間の印加圧力のわずかな違いを引き起こし、加えられた圧力の正確な設定のためのメカニズムを欠いている。異なる時点で測定したときにも、VPMにおけるプライミング液の蒸発はわずかな圧力差を誘発することができ、VPMは、したがって、多くの場合、再プライミングされるべきである。これらの制限は、潜在的にVPM2の導入によって解決されているクリックベースのスケーリングを有し、空気圧基づいている。 この原稿に記載されて代替プロトコルは、非精製された生物学的サンプル中17 EVの測定に特に適している。私たちは、例えば、糖、脂質、タンパク質および他の大きな破片などの緩衝成分は、いくつかの場合に適用可能にする標準プロトコルのためのあまり測定条件に影響を与えることができると考えている。 2個別の測定値を比較するサンプルにキャリブレーションビーズを添加するというよりは、「リアルタイム·キャリブレーション」を紹介します。異なるおよび/ ​​または未知の流体背景含量を有するサンプル（異なるドナーの、例えば血漿）を比較する場合は、この方法が特に適している。違いはEVやポリスチレン粒子（ 例えば、粒子密度及び表面電荷）との間に存在するが、理論モデルならびに実験データは、EVの定量化およびサイズプロファイリングのためのポリスチレンビーズの有用性を強調するかなりの圧力が15,19適用されていることを前提条件の下で。動電力の影響を最小限に抑えるために、比較的大きなNP150 / NP200のナノ細孔と有意な正の圧力の使用が推奨されます。 EVやキャリブレーションビーズは大きさによって区別される。したがって、ナノポアは、EVや大きな校正粒子の両方の検出が観察される直径に、ストレッチを適用することによって開かれなければならない。気孔の開口部が、より小さい粒子に対する感受性が減少するので（335 nmのキャリブレーションビーズを使用する場合&gt;しばしば電気自動車120 nm）を、特定のサイズよりも大きいのみ電気自動車が記録される。電気自動車の最小検出限界は、NP150のナノ細孔に203 nmのキャリブレーションビーズを用いて、90nm程度まで小さくすることができる。より大きな電気自動車のナノ細孔を頻繁に目詰まりを誘発しかし、このセットアップは実行不可能かもしれません。これらの妨害EVの存在はどこにレアには小さすぎるEVの人口、セットアップの利用を強制することが検出閾値をCHであり、検出されません。 サイズが100nm未満の粒子を測定しようとすると、システムを操作する困難さは増大する。このような場合において、検出は、電解質の塩濃度を増加させることによって改善することができる。増大したイオン濃度は、小さな粒子（より大きな信号対雑音比）が相対的に増加封鎖大きさを誘導する。 EVの測定のためのこの技術の実行可能性が増加塩濃度は、EVの容積に影響を与える可能性がある、しかし、検証されなければならない。 結論として、TRPをプラットフォームは、EVの直接定量およびサイズ​​特徴付けのために使用することができる。全く隔離またはEV操作（抗体結合または蛍光標識）が必要ないので、プラットフォームは生物学的液体中の直接のEV定量化に適しています。代替プロトコルは、緩衝液成分が有意な細孔clogginを誘導サンプルのために有益であり得るが提供される実行不可能な標準プロトコルの信頼性の高い使用率を作るグラムイベント。

細胞起源からの小胞は、体液1において非常に豊富である。これらのいわゆる細胞外小胞（電気自動車）（50 - サイズ1,000 nm）を細胞膜と多小胞状体のいずれかの融合によって、または細胞膜の外側に直接出芽により形成されている。近年では、電気自動車での科学的関心が大幅にEVの新たな機能や特性を1に記載されているEVに焦点を当てた出版物の過多で、その結果、増加している。電気自動車は、現在、シグナル伝達、免疫調節、および血液凝固1-4のような生理学的および病理学的プロセスの広い配列に関与すると考えられている。癌では、電気自動車はpremetastaticニッチ5,6、血管新生8のプロ癌コンテンツ7,8の移転や刺激の形成に役割を果たしているようだ。このほか、電気自動車は、治療剤9の送達剤として検討されている。 これらのデにもかかわらずvelopments、EVの信頼性の高い定量が困難なままである。伝統的に、間接的な定量法は、全タンパク質含有量または特定のタンパク質の定量化に依存している、使用されている。広く用いられているが、これらの技術は、タンパク質あたりのEVの違いを考慮していないし、電気自動車におけるタンパク質凝集体および混入タンパク質を区別しません。さらに、これらの技術は、多くの場合、生物学的サンプル中のEV濃度の比較を不可能にする電気自動車の単離を必要とする。 したがって、努力がより正確で直接的なEV測定10を可能にする新規な方法を開発するために行われている。このレポートは、信頼性の高い定量化やEVのサイズのプロファイリングのための調整可能な抵抗パルス検出（TRPS）の使用が記載されている。 現在、qNano装置（ 図1a）は、TRPSのための唯一の商業的に入手可能なプラットフォームです。 TRPSでは、非導電性弾性膜は、Wiを中断ナノサイズの細孔番目の二つの流体細胞を分離している。他の細胞は、粒子を含まない電解質で満たされ、一方、流体セルの一つは、目的の試料が充填されている。電圧を印加して、イオン流/電流が細孔（ 図1b）を介して粒子の移動時に変更される、確立される。この電流の遮断（「抵抗パルス&#39;）の大きさは、粒子11（ 図1c）の体積に比例する。封鎖持続時間は、電荷または12形状の粒子の特性に依存して、粒子のゼータ電位を評価するために用いることができる。未知の粒子の大きさプロファイリングは、既知の直径を有する較正粒子による抵抗パルスで未知の粒子による抵抗パルスを比較することによって行うことができる。封鎖事象の大きさに加えて、これらが生じるの速度が測定される。この計数率reli粒子濃度でのES。封鎖の濃度および割合は、13直線的に比例しているので、既知の濃度および粒子サイズの粒子を有する単一の較正サンプルを用いて、濃度14および未知試料のサイズ分布11の測定を可能にする。 ナノポアを通る粒子の移動は、電気キネティック（電気泳動および電気浸透）と流体力15によって決定される。可変圧力モジュール（VPM）流体セル間の圧力差を使用して、追加の力として誘導することができる。正の圧力を適用すると、粒子濃度が低い場合に有益であり得る粒子の流量を増加させる。また、圧力は、動電学的な力の影響を低減するために適用することができる。としてしばしば電気自動車を検出するために使用される相対小さな孔径（NP100、NP150およびNP200おそらく）でナノ細孔を使用する場合に特に重要である。これらのナノ細孔のために、かなりの圧力を加える場合であっても、動電学的力は、粒子の表面電荷に依存して、16無視できないままであり得る。複数の圧力での粒子速度を測定することにより、電気を動力学的に補正し、より正確な、EV濃度を算出することができる。 ここでは、詳細なプロトコルはEVのサイズ分布および濃度を決定するために提供される。サンプルは既知のサイズ及び濃度17のポリスチレンビーズでスパイクされた場合、通常動作プロトコルの隣には、別のアプローチが記載されている。このリアルタイムの較正技術は、尿、血漿および細胞培養上清のような生物学的流体、直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的課題のいくつかを克服するために使用することができ、または測定長期間にわたってナノポアの安定性であることができない場合確実にした。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Variable pressure module</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>NP100, NP200</td>
			<td>Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration Particles</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>CPC100, CPC200, CPC400</td>
			<td>Calibration particles are available in different sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td>Basic sonication bath is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mini) vortexer</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-free tissues</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows based computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Control Suite 2.2</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Software</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification and size-profiling of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing

「微小胞」と「エキソソーム」を含む細胞外小胞（電気自動車）は、体液中の非常に豊富である。近年、電気自動車への関心が驚異的な増加を目撃した。電気自動車は、凝固、免疫応答、および癌を含む、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。また、電気自動車は、治療薬として、例えば、薬物送達ビヒクルとして、又は再生医療などの可能性を有する。サイズが小さいため（50〜1,000 nm）でのEVの正確な定量とサイズプロファイリングが技術的に困難である。 このプロトコルがどのように調整可能な抵抗パルス検出（のTRP）技術について説明し、qNanoシステムを使用して、電気自動車の濃度とサイズを決定するために用いることができる。ナノサイズの細孔を通じて転送するとEVの検出に依存する方法では、比較的高速であり、少量の試料を使用することで十分とPURを必要としませんificationやEVの濃度。次の別のアプローチは、サンプルを使用して記述されている通常動作プロトコルに既知のサイズおよび濃度のポリスチレンビーズでスパイクした。このリアルタイムの較正技術は、生物学的液体中の直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的ハードルを克服するために使用することができる。

のTRP器具を使用するには、非導電性ナノ細孔は、マシン（ 図1a）の4腕の上に配置する必要があり、電圧（ 図1b）が適用されなければならない。電気ベースライン電流が確立されると、図1cに示されるように、細孔を通過する粒子に起因する抵抗のパルスが検出される。 電気自動車は、超遠心分離による神経膠芽腫細胞株U87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清から精製した。 NP100のナノ細孔に孤立した電気自動車（ 図2a）を測定する際に安定な粒子速度プロットが観察される。この安定した粒子速度プロットは、信頼性のEV濃度測定のために必要とされる。 115nmのポリスチレンキャリブレーションビーズの記録への録音EV-サンプルのペアリングした後、粒度分布（ 図2b）とEV-サンプルの濃度の推定値を得ることができる（データは示さず）。 （Figrue 3aの ）変動をもたらす。これは、不正確なEV濃度の推定をもたらす。既知の濃度およびサイズのポリスチレンビーズでサンプルをスパイクすることによって、EV対ビーズ比を決定することができる。 図3bは、サイズが 335ナノメートルのポリスチレンビーズを細胞培養上清をスパイクした後に得られた結果を示している。二つの明確な集団が観察される。少ないし、0.46 nAの体の遮断を誘発する粒子はより大きな粒子は、ポリスチレンビーズを決定し、決定した電気自動車である。ポリスチレンビーズに対するEVの比は、電気自動車（ 表1）の原料濃度を計算するために使用される。 図3cは、スパイクされたポリスチレンビーズに基づく2つの集団のサイズ推定を示す図である。再使用されるナノ細孔のセットアップサイズの電気自動車&gt; 140nmの検出においてsulted。これは、ナノポア開口部を減少させることによって低下させることができるが、これはまた、より詰まり事象をもたらすであろう。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> 図1：qNano機器と動作モード。 （A）装置の写真。ナノポアは、上部流体セルから低い流体セルを分離する、器具上に位置決めされる。流体セルは、遮蔽キャップによる環境の電気的干渉から保護されています。（B）イラストチューナブル抵抗パルス検出（TRPS）を概説する。非導電性弾性ナノ細孔は、2つの流体細胞を分離します。電圧を印加して電流がナノポアにパンクチャ細孔を介して確立される。細胞外小胞がナノポアを移動すると、イオンの流れが変更され、抵抗性のパルスとして検出される。のTRPにナノポアの開口寸法は、器具の対向するアームの間の距離を増大するか、この距離を減少させることにより、ナノポアを延伸することにより（減少または増加）を調整することができる。（C）、抵抗パルスの具体例。単一の抵抗パルスの大きさは、粒子の体積に比例する：より大きなパルスが大きな粒子を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> 図2：粒子カウントプロットとU87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清から分離された電気自動車の測定から得られたサイズ分布全体の一定の粒子検出を示す（A）粒子カウントプロット。粒子フィルタの簡単な減少ルの検出は、記録の80と100秒の間で観察された。録音を一時停止し、シールドキャップをタッピングした後、粒子速度は、記録が再開された。（B）単離されたEVのサイズ分布は、115 nmのポリスチレン較正ビーズに未知試料（電気自動車）を校正した後にプロットした後に安定化した。 （5nmのビンサイズ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> 図3：代替プロトコルを用いて細胞培養上清中のEVのTRPを定量化。 （A）生物学的流体中に直接電気自動車を測定したときに得られる典型的な粒子速度のプロット。細孔の目詰まりは、粒子検出率の短い中断や変動の原因となる。それぞれプロットは、同じサンプルの複製の測定値を表す。（B）335 nmのポリスチレン較正ビーズを細胞培養上清をスパイクした後に得られる3つの複製のサイズ分布のグラフ。 0.46未満の抵抗nAのパルスを誘導する全ての粒子が電気自動車として選択される。（C）スパイクされたポリスチレンビーズは、サンプルのサイズ分布を得るために用いることができる。 （5nmのビンサイズ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 測定 </td><td> キャリブレーションのみで第1位 </td><td> キャリブレーションのみ＃2 </td><td> 上清＃1 </td><td> 上清＃2 </td><td> 上清＃3 </td></tr><tr><td>平均電流（NA） </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;TD&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td>粒子速度</td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td>カットオフ使用（NA） </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td>総粒子</td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td>細胞外小胞</td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td>スパイクのキャリブレーションビーズ</td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td>電気自動車/キャリブレーションビーズ</td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> 0.788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td>サンプル - バックグラウンド</td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> Extracelullar小胞（10 7）/ mlの</td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td>サンプル2.5倍に希釈</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生の濃度電気自動車（10 7）/ mlの</td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> 表1：代替プロトコルを用いてEV濃度の計算例カットオフ値は、キャリブレーションビーズから電気自動車を区別することが決定される。続いて、EVやビーズの総数は、検索することができる。測定毎にEV対ビーズ比を算出する。 （例えば、タンパク質凝集のため）、電解質中のバックグラウンド粒子の量は、「キャリブレーションビーズのみ」試料の個別の測定のためのEV対ビーズ比を平均することによって計算される。各サンプルについてバックグラウンド比が得られる比から減算される。このadjuste（：9.33e7 / mlのこの例では）d比は、サンプル中のキャリブレーションビーズの濃度が乗算される。 EVの生の濃度を決定するために、得られた濃度は、（：2.5この例では）総電気自動車の希釈率を掛けている。

Watch this Scientific Journal Video about Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing at JoVE.com

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

細胞外小胞は、凝固、免疫応答、および癌または薬物送達又は再生医療のような潜在的な治療剤を含む生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。このプロトコルは、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いた各種流体中の絶縁および非単離された細胞外小胞の定量化とサイズ特性評価のための方法を提示します。

調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.2K ビュー.  University Medical Center Utrecht. 細胞外小胞は、凝固、免疫応答、および癌または薬物送達又は再生医療のような潜在的な治療剤を含む生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。このプロトコルは、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いた各種流体中の絶縁および非単離された細胞外小胞の定量化とサイズ特性評価のための方法を提示します。 

ビデオ: Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

生物工学

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

多重経皮電気化学センシングのための中空マイクロニードルベースの​​センサ

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

有機電気化学トランジスタにバリア組織破壊の検出

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

細胞外小胞の単​​離および特徴のための紙ベースのデバイス

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

バイオメディカル応用のための機械的に調整可能な生物活性金属スキャフォールドの作製

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、DNA修飾された粒子を用いました

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

細胞外小胞の保存性の評価

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

シュワン細胞表現型仕様を評価するための細胞外マトリックス微小環境の調製

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...