NTA の結果は、オペレータバイアスが非常に発生しやすいものです。このプロトコルは、NTA パラメータの変更が得られた結果に及ぼす影響を示しています。標準化された方法は、NTA解析における厳格さと再現性を高めるのに役立ちます。
キュベットでサンプルを分析すると、各ビデオで統計的にランダムなサンプルをキャプチャできます。これにより、より再現性の高いデータと、さまざまなサイズにわたるパーティクルの視覚化が可能になります。推奨される粒子濃度範囲でサンプルを得ることは困難な場合がありますので、理想的な希釈因子を特定するためにシリアル希釈を実行してください。
この手順のデモンストレーションは、アンソニー・フェランテの研究室の博士課程の学生、クンゲンカイです。ナノ粒子追跡解析用のキュベットを準備するには、繊維がキュベットに入るのを防ぐために、糸くずのない材料でワークスペースを覆います。手袋を着用し、磁気キュベットジグに攪拌棒を含むキュベットを置きます。
フックツールを使用して、挿入物をキュベットの前部に表示されるインサートのノッチでキュベットに配置します。ピペットを使用して、インサートの穴を通してキュベットに400〜500マイクロリットルの精製細胞外小胞をゆっくりと加え、気泡を入れずに穏やかにピペットしてサンプルを混ぜ、キュベットをキャップし、必要に応じて泡をタップし、糸くずのない布を使用してキュベットの外面を拭きます。希釈剤またはサンプルの粒子濃度を解析するには、コンピュータのワークステーションと計器をオンにして、粒子追跡解析プログラムを開始します。
メッセージが表示されたら、[NTA] をクリックして[録音]タブを開きます。画面の指示に従って、必要なサンプル情報をすべて入力します。EV 追跡分析の場合は、希釈剤を PBS に設定します。
このサリニティは、希釈剤またはサンプル粒子濃度を得るために9%に自動投入し、器具の蓋を開け、キュベットが配置される保護キャップカバーを取り外します。カメラに面したインサートのノッチで、正しい方向でキュベットをインストルメントにロードし、キャップとインストルメントの蓋を交換します。ストリーミング矢印をクリックしてカメラの電源をオンにし、シェブロンの矢印をクリックしてレコード設定を展開します。
比較的小さな粒子がはっきりと見えるまで焦点を合わせます。小さなEV定量の分析を設定するには、フレームレートを毎秒30フレーム、露出を15ミリ秒、3秒に、待ち時間を3秒、青、緑、赤のレーザーパワーをそれぞれ210、12、および8ミリワットに、ゲインを30デシベルに設定します。比較的小さな粒子がはっきりと見えるまで焦点を合わせます。
ズームやゲインを増やすと、パーティクルのフォーカスを得ることができます。しかし、ゲインを増やす場合は、録音前に30デシベルに設定してください。パーティクルがフォーカスされたら、ズーム設定を 0.5X に設定して帯域幅を節約し、フレームの損失を防ぎ、[記録] をクリックしてビデオの録画を開始します。
ビデオが録画されたことを示すプロンプトが表示されたら、[OK] をクリックして記録を完了し、プロセスタブを選択します。録画中に非常に大きなパーティクルがビデオに表示されていた場合は、録画したビデオのディレクトリに移動し、処理前に問題のあるビデオを削除します。[オーディオ検出の無効]の[優先]ボックスをオンにして、機能の直径を 30 に設定します。
[プロセス] をクリックしてビデオ処理を開始し、ライブ配信グラフを表示します。処理が完了したら、[OK]をクリックして[印刷]タブを選択します。EV の場合は、メイン チャートをログビンシリカとして表示します。
グラフの他の特徴は、x軸を変更して、生成された図形の統合領域を設定するなど、カスタマイズすることができます。結果の PDF レポートを作成するには、レポートボタンをクリックします。希釈係数と分布幅に合わせて調整された平均、中央値、モードサイズ、および濃度が表示されます。
希釈剤のNTAは、このブランクの濃度がEVサンプル粒子濃度から差し引くことができるように、任意のサンプルの前に行われるべきである。分析後にキュベットを洗浄するには、キュベットを空にし、キュヴェットを脱イオン水で10〜15回、70〜100%エタノールで3回完全に充填し、残留試料を除去します。キュベットの外側を糸くずのないマイクロファイバー布で乾燥させ、圧縮空気ダスターで内側を乾燥させます。
インサートを洗浄し、バーをかき混ぜるために、70〜100%エタノールを含むガラスシンチレーションバイアルに材料を入れ、バイアルを激しく振ります。その後、インサートをすすいで、デモンストレーションのように振盪して脱イオン水でバーをかき混ぜ、糸くずのない布を使用して乾燥させます。乾燥後、次の分析まで、すべてのクリーン成分をすぐに保管します。
分析を行う前に、器具校正をポリスチレンビーズを用いて試験し、取得したデータの妥当性を確認した。観察されたように、粒子追跡装置は100ナノメートルのマノ分散ビーズのサイズを正確に報告したが、400ナノメートルビーズのサイズを正確に報告しただけだった。したがって、このプロトコルの機器設定は、サイズが100ナノメートルに近い、より小さな粒子に対してより正確でした。
これらの設定を用いて、報告された粒子濃度は、装置が技術的な複製物間の変動性をほとんどなく様々な希釈で粒子濃度を正確に検出できることを示す希釈因子を伴ってそれに応じてスケールする。ミリリットルマウス組織由来EVサンプル当たり10番目の粒子に対して4.41倍の10倍の希釈液を、1,000と3,000の間であると判断した。この分析では、ゲインを増加させることで、カメラの感度が高くなり、より多くの小さな粒子の視覚化が増加しました。
青いレーザーパワーを70から210ミリワットに増やしながら、緑色と赤のレーザーパワーを一定に保ちながら、報告された平均粒子径を122ナノメートルから105ナノメートルにシフトし、報告された総粒子濃度を1.1倍から8番目の10倍に1.7倍に増加させました。赤色レーザーのパワーを上げると、報告された平均粒子サイズが175ナノメートルから246ナノメートルに増加し、報告された総粒子濃度が低下した。緑色のレーザーパワーを増加させると、報告された平均粒子サイズの減少と報告された総粒子濃度の増加が生じた。
最適な検出範囲内にサンプルを配置する適切な希釈を見つけると、サンプルごとに数回の試みが必要になります。キュベットのクリーニングはまた余分な注意深い処理を要求する。EV粒子径や濃度測定には、複数の直交法を適用することをおすすめします。
動的光散乱、抵抗パルスセンシング、透過電子顕微鏡、および単粒子干渉反射率イメージング検出も、EVの特徴付けに行うことができます。
