我々はSで私たちを提供するためのレオニー·デ·ボーアとバZaat（アカデミックメディカルセンター）に感謝しています表皮のO-47株。私たちは、COPAS XLおよびVASTバイオイメージ解析分析のヘルプやアドバイスをリコボンガーツ、フランシス·スメットとアンジェラ·コマス（ユニオンBiometrica）に感謝。我々は有用な議論のためにライデン大学からデービー·デ·ウィット、ウルリケNehrdich、および魚の留守番用のローラ·バンヒュルスト、および他の同僚に感謝します。本研究では、生体材料研究所、オランダ経済省が共同出資の研究プログラムのプロジェクトP5.03 IBIZAの一部を形成し、経済のオランダ省のスマートミックスプログラム（NWOA_6QY9BM）のとのオランダ教育省、文化科学。追加のサポートは、EUのプロジェクトZF-ヘルス（FP7健康 - 2009から242048）から入手し、そしてRMJは、EU初期トレーニングネットワークFishForPharma（PITN-GA-201で経験研究者としてマリー·キュリー·フェローシップによってサポートされていました1から289209）。 SJRは、付与契約に基づいて革新的な医薬品イニシアティブ共同事業からの資金提供を受け、N 115337を°、親切contribution.The著者の欧州連合（EU）の第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）とEFPIA会社から資金拠出によって構成されているのリソースがさらに認めるロボット工学のためのライデン大学基金（LUF）からCyttronからの財政支援、ひいては財政的に画像化施設の科学研究費オランダ機構によってサポートされてBesluit補助金Investeringen Kennisinfrastructuurプログラム内。 COPASシステムの取得は、部分的に科学研究費オランダ機構（NWO、834.10.004）からの資金援助と地球と生命科学（ALW）のための部門によってサポートされていました。

1。細菌株および増殖条件<ol><li> Sを準備する表皮接種<ol><li> Sから、いくつかの個々のコロニーを取る表皮株O-47、pWVW189を含有する補充した25ミリリットルのLB培地中で37℃で一晩10μg/ mlのクロラムフェニコールと文化を補ったルリアベルターニ（LB）寒天プレートからmCherry発現ベクター（未発表デ·ボーアL.）に由来舞台を中間対数増殖する10μg/ mlのクロラムフェニコール。 </li><li> 1分間、12,000×gで、続いて培養物の遠心1mlを、それらを0.3％（v / v）のTween-80をながら1 mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄する。 </li><li> 600度（OD 600）での光学密度を測定し、PBS中の2％で0.3のOD 600に細菌懸濁液（w / v）ポリビニルピロリドン40（PVP 40）を希釈する。注：OD 600×10 8〜1.0に相当する0.3のコロニー単位/ ml（cfu / mlで）を形成する。 </li></ol&gt; </li><li> Mを準備するmarinumの接種<ol><li> Mから、いくつかの個々のコロニーを取る安定して10mlに28℃で一晩、10％（V / V）ミドルOADCを50μg/ mlのハイグロで補充濃縮および文化にミドル7H10寒天プレートからmCherry 10を表現pSMT3-mCherryベクターを含むマリナム菌株MまたはE11 50μg/ mlのハイグロを補足した10％（V / V）ミドルADC濃縮したミドル7H9ブロス。 </li><li> 1分間、12,000×gで、続いて培養物の遠心1mlを、それが0.3％（v / v）のTween-80を用いて1mlの滅菌PBSで3回洗浄する。 </li><li> OD 600を測定し、PBS中の（W / V）PVP 40 2％OD 0.3の600に細菌懸濁液を希釈。注：1のOD 600が 1.0×10 8 CFU / mlに相当する。 </li></ol></li></ol> 2。ゼブラフィッシュの卵を準備<ol><li> 70男性と50女性の野生のTYの最大値を置き大繁殖容器に別々にゼブラフィッシュをPE。注：大規模な繁殖容器の下部にメスの魚を置きます。 </li><li>ゼブラフィッシュは飼育を開始できるように、午前中に次の日のセパレータを削除します。 </li><li>卵の水（60μg/ mlのインスタント海洋海塩）で満たされた50ミリリットルチューブ内の卵のコレクタに大繁殖容器の底に卵を収集します。 </li></ol> 3。注射針<ol><li> 10μmの内径を有する市販のカスタムメイドのガラスキャピラリー針を取得します。 </li></ol>注射の4。実験概要<ol><li>約40ºCのまで、1％の100ミリリットル（w / v）の卵、水にアガロース、とクールを沸かす自動化されたmicroinjectorsプレートにアガロース注ぎ、アガロースに1024ウェルスタンプを配置します。注意：プレートを冷却するときに使用する準備ができています。 </li><li> 「校正段階」に自動化されたマイクロインジェクターオペレーティングソフトウェアをクリックしたときに、その後、&#39;1024 &#39;だけでなくグリッドをクリックして、マイクロインジェクターでアガロースプレートを置き、ウェルの中心位置に画面をクリックすることで、プレートのキャリブレーションを行います。 </li><li> 「針メニュー」に移動し、「校正針ホルダ」をクリックしてください。 </li><li> 100 CFU / NL Sを含む10μlのPVP 40のいずれかでmicroloaderチップを使用して注射針を埋める表皮または30 CFU / NL M.マリヌム 、または偽注射剤としてPVP 40を使用しています。 </li><li>自動化されたマイクロインジェクターに針を置き、下げたり、針を上に移動すると、針の位置で画面をクリックすることで、Y位置をXのキャリブレーションを行います。次いで、針の先端の位置で画面をクリックすることによって、針のz位置を較正する。 </li><li>プラスチック転送ピペットを用いてアガロース、グリッド上で卵を配布し、余分な卵の水を除去する。自動化されたマイクロインジェクターでアガロースグリッドを配置します。 </li><li> 「充血に行くNメニュー &#39;と調整」Femtojet設定メニューで、1 NLと相関する」200ヘクトパスカルに設定し、「射出圧力射出時間」0.2秒と「報酬圧力&#39; 15ヘクトパスカルを。 </li><li>プレート全体を注入するために「すべてを注入」をクリックします。 </li><li>ペトリ皿当たり70胚の最大で、ペトリ皿（92×16 mm）のにそれらを洗浄することによって、注入後に卵を収集し、28℃でインキュベート</li></ol> 5。フローサイトメーター解析<ol><li>製造業者の指示に従って大粒フローサイトメーターを調製し、卵の水と試料カップおよびシース液容器を充填する。 </li><li>オペレーティングソフトウェアでは、「PMT」メニューに移動し、以下の設定を使用します。「グリーン」と「イエロー」のチャネルに対して650「赤」チャネル用のVと0Vに。そして、「しきい値」メニューに移動し、以下の設定を使用します &#39;視神経をデブリの影響を低減するために、lの密度」閾値信号：975 mVの（COPAS XL値：50）および「320マイクロ秒（800 COPAS XL値）飛行時間」（TOF）最小。 </li><li>胚は、分析のために、5.4に進み、ソートやシャーレに胚をソート5.5または分析のためのステップに移動し、96ウェルプレートに胚をソートすることなく、分析のための5.6に進みます。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、分析を開始する「スタート」をクリックしてください。すべての胚を分析する場合は、「停止」をクリックして、分析を停止。 「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして保存されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、「並べ替え」メニューに70を入力することによってソートされるプレート当たり70胚の最大値を定義します。ソーターの下に空のペトリ皿を置き、「手動で並べ替え」をクリックしてください。ときはペトリディ<html> SHは満たされている、「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして格納されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、「並べ替え」メニューで1を入力してソートするウェルあたり1胚の最大値を定義します。左プレートホルダーに空の96ウェルプレートを配置し、「プレート塗りつぶし」をクリックしてください。 96ウェルプレートがいっぱいになると、「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして格納されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>ソートモジュール &#39;ステータスのソート」を使用して40を、もし：&#39;ステータスを選択し「次のデータのフィルタ設定を使用して、生データを処理するためにTXTファイルを入手してください。6その後「赤から全蛍光信号から番号を使用平均値と平均値の標準誤差を計算する」チャンネル。バーや散布グラフにこれらのデータセットをプロットします。 </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6。薬物療法<ol><li>分析し、並べ替えで3日間注射後（DPI）、M. marinumのは、大きな粒子流サイトメータ（工程5.5）を用いて二つの等しいグループ内の胚を感染させた。そのキャリア溶媒中で関心のある化合物と1グループを扱い、キャリア溶媒のみ（コントロール）を持つ他の。抗生物質の副作用をテストするために注入されたコントロールモックを作成する同様の処理を適用します。 </li><li> 4と5 dpiの分析（ステップ5.5）で繰り返して化合物を含有する卵の水または卵水をリフレッシュ。 </li></ol> 7。高分解能イメージング<ol><li> （w / v）の10分分析の前に、卵の水に3 - アミノ安息香酸エチルエステル（トリカイン）を緩衝0.02％で胚を麻酔。 </li><li>メーカーの指示に従って脊椎動物自動スクリーニング技術システムと大粒子サンプラーを準備します。 </li><li> 「イメージングから胚の時代に対応する参照画像を選択 - オブジェクト211;検出の設定」メニュー。 </li><li>メニュー - 「自動保存画像イメージング」から脊椎動物自動スクリーニング技術システムによってなされる写真の量と方向を選択します。 </li><li>大パーティクルサンプラの左プレートホルダーに（ステップ5.6から）の胚で満たさ96ウェルプレートを配置し、「実行プレート」をクリックしてください。 </li><li>胚が検出され、位置が合っていれば;画像ヘッドとCLSMは10X無地ドライ対物レンズを用いて、画像処理ソフトウェアを使用して、後で画像をパノラマで別々にテール。 </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery.">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence.">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li><li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., &amp; Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li><li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos.">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JSは、この記事で使用する楽器を作り出す生命科学の方法BVの所有者である。

このホワイトペーパーで説明した高スループットの方法論は、感染症のさまざまな種類の魚の胚および幼虫の多数をスクリーニングする迅速かつ費用対効果のパイプラインを提供しています。代わりに、伝統的な単一または家族繁殖タンクの大繁殖容器を使用すると、生成されているプロセスの制御および同期の卵より多数の生成を容易にした。自動化されたマイクロインジェクション装置7の改良版では、1時間以内に同一の細胞の段階でほぼ全て2,500個もの卵を注入することができる。これらの更新及び改良されたソフトウェアを使用してそれを読み出すなどの細菌増殖に大きな薬物スクリーニングを行うために使用することができ、以前可能であったよりも多くの卵を注入することが可能である。しかし、この方法は依然として注射、ベナードセルらにより記載され、例えば、他の注射経路を卵黄に限定される。 （2012）6、願わくは近い将来に自動化されたマイクロインジェクション装置に組み込まれます。 &lt;これらのメソッドは、ゼブラフィッシュをスクリーニングするためにベンチマークされていますが、Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;、それは同様に他の魚種とするアプリケーションのために有用であろう。例えば、コイ、薬物スクリーニングのための利点を有することが示されている。ゼブラフィッシュのように、コイの卵や初期段階の胚は透明ますが、その大きな卵の卵の百何千もの大きさと、より一定の遺伝的背景16を提供する近交系の可用性の主な利点である。 感染した胚の大量の分析は、ハイスループット大粒フローサイトメーターを用いて行われる。このデバイスは、ソート、マルチウェルプレートまたは多数の化合物を試験するためには特に適してペトリ皿に胚を分析することができる。セットアップが技術サイトメーター大きな粒子流が予備スクリーニングするために使用し、続いて媒体を介して、サンプルを分析することができるような方法で適合されているよりも高い撮像分解能が必要な場合高い解像度で置く。これは、脊椎動物の自動スクリーニング技術17,18を用いて行うことができる。このデバイスは、自動的にマルチウェルプレートまたはバルクコンテナ、画像CLSMまたはステレオ顕微鏡法を用いて、毛細管を通して360度から2〜7日後に受精の間、ライブまたは固定胚を収集し、ベースの胚の手選別を可能2バルクコンテナに再処分することができます顕微鏡画像上。将来の改善は、CLSMで経時的に個々の胚を自動的多数をスクリーニングすることがことが可能となる、マルチウエルプレートに結像した後、胚の選別を可能にする。将来の用途において脊椎動物自動スクリーニング技術のシステムはまた、マルチウェルプレートに分配前の幼虫の技術を必要とせずにサイトメーター大きな粒子流に接続することができると仮定すると、より高度な並べ替えにつながる。 本論文では、確立ANを説明S.を研究するための高スループット·セットアップのD最適化表皮とM.創薬のためのモデルとしてmarinumの感染症。それは、卵黄に注入されたこれらの細菌の結果は、注射時の卵の発達段階に依存していることを示しています。 Mを注入する16-64細胞期の16から128細胞期またはM株のマリヌム E11が尾静脈注射2、6と同じ感染パターンにつながる。しかしながら、このセットアップでのみ細菌性病原体の増殖に限定されるものではない。それはロボットでそれぞれ13、過剰発現および遺伝子ノックダウン研究を形質転換するためのDNA、RNAまたはモルホリノを含有する溶液を注入することが可能であることが以前に示された。さらに、このセットアップはまた、癌細胞の増殖および遊走を研究するために有用であることが示された。したがって、このパイプラインは、コンテキスト内の信号の様々なメカニズムのハイスループットスクリーニングのための汎用的な方法を提示し自然免疫の、感染症および癌の開発に適用。これらの画面は、薬剤発見のための他のユーザーにも適用可能な薬剤の同定可能な毒性効果の分析と組み合わせることができる。

現在までにゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が正常に感染症1の様々な研究する効率的なモデルとして確立されている。ゼブラフィッシュ胚は、その透明性及び蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック既存のレポーター株の多数のインビボイメージングの可能性に固有の提供。この強力な組み合わせは、 マイコバクテリウムmarinumの、M.最も近い相対などの病原体と相互作用しつつ、即座に別の免疫細胞タイプを追跡することを可能にする結核2、または表皮ブドウ球菌 、生体材料関連感染3-5の主な原因となる。感染の異なる経路は、試験6の目的に応じて、ゼブラフィッシュ胚において使用することができる。 これらの感染経路の一つは、細菌の卵黄注射である。他の人に比べてこの方法の主な利点は、卵黄infectiです上では有意に噴射時間を短縮し、感染7,8の高い再現性を可能にする、ロボット注射を介して自動的に行うことができる。 前作、Sの研究のための生体モデル系において 、高スループットなどのゼブラフィッシュを用いて、 表皮とM. marinumの感染は7,8成功したことを示した。このシステムは、初期胚の卵黄ロボット注射を介して疾患の進行をスクリーニングすることが可能であり、細菌負荷の尺度として蛍光読み出しを使用する。この概念と一致して、このセットアップでは、最適化され、均質に感染した胚を大量に生成し、多くの化合物で処理した後の時間の間、感染の進行を追跡する可能性を秘めた非常に効率的な高スループットパイプラインを確立した。確立された設定で、それは画面に8000同期胚まで発生させることができる病気の進行のために、時間あたり2,500胚まで、このように処理。胚は、感染した幼虫の均質なグループを確保し、自動化されたシステムを使用して、細菌の負荷に基づいて並べ替えられています。さらに、セットアップを検証するために、哺乳動物における結核の進行を防ぐために、既知の基準の影響は、M.に感染した胚でテストされていますマリヌム E11株以上の病原性のM株9。 本研究では、詳細に開発中に、化合物処理後に、感染した胚および細菌の進行のその後の分析を大量に生成することができるように確立されたハイスループット·パイプラインを記述する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

ゼブラフィッシュは、ハイスループットスクリーニングの可能性と全体の動物モデルとして、創薬スクリーニングの前臨床段階での貴重なツールになりつつあります。彼らは、このようにして、還元、はるかに高価なげっ歯類モデルでのテストを通過する多数の化合物を初期段階での哺乳動物モデルにおけるインビボの検証における細胞ベースのアッセイの間のギャップを埋めるために使用することができる。この観点から、現在の原稿に表皮ブドウ球菌およびマイコバクテリウムmarinumの感染症の研究のためのin vivoモデル系としてゼブラフィッシュを使用して、新しい高スループットパイプラインを説明している。このセットアップでは、同期胚の多数の生成と解析が均一に感染したことができます。また、パイプラインの柔軟性により、ユーザは必要なときに容易に分析の分解能を改善するための他のプラットフォームを実装することができます。一緒に革新的な高スループットTEでゼブラフィッシュの組み合わせchnologiesために全動物モデルを用いての強度だけでなく、ために新規化合物の作用様式を解読するために使用することができる利用可能なトランスジェニック系統の多数だけでなく、新たな可能性への薬物検査と発見の分野を開く。

本結果は、高スループット·パイプラインはS.を研究することを示す表皮とM. marinumの感染は正常に確立されており、それは、他の感染モデルに拡張することができる。まず、Adatto らによって公開システムに基づいて大規模な飼育容器（ 図1A）、（2011）11の使用は、生成されているプロセスの高い制御を与える一つのイベントに同期の卵を大量に生成することができます。以前に開発された自動化されたマイクロインジェクションシステム7の改良版は、（ 図1A）を使用し、短時間で多数の胚を注入することができることが急ぎ。卵黄の感染のための最高の発達段階でロバ、Sと注射へ表皮とM. marinumのはキンメルらによって行われた説明によれば、1〜512細胞期の間のすべての異なる段階で実施した。（1995）12 </suP&gt;。 100 CFU Sに注射表皮は、16〜128細胞期の間の最良の感染パターン（ 図2）を得た。細菌は3日間、卵黄の中に増殖し、以降3解像度から体内に広がった。 256細胞期胚の体内に広がってほとんどの細菌と卵黄の中に、主に細菌の成長を示した後16細胞期の前に注射を行うことにより、4 DPI、および射出から高い死亡率につながった。細菌負荷の定量はベネマンらによって記載されるように、大きな粒子がフローサイトメーターを用いた蛍光強度分析により行った。（2013）8（ 図3）。 観測は30 CFU Mの注入のための最適な発達段階あることを示したマリヌム注入はE11株（ 図4A）のために、より毒性の強い男straiで16-64細胞期間16から128細胞期の間にあるN（ 図4B）。これらの段階で注入した胚は卵黄の中に細菌の増殖を示し、胚（ 図7）を介して細菌の広がり。早い段階での両株の感染は4 dpiの後に死ぬために胚をリードする非特異的な一般化された細菌の増殖を発表した。一方、後の段階で注入した胚で細菌量は卵黄に限定されていた。 次に、大きな粒子との事前ソート（ 図1B）フローサイトメーターは、非または高度感染した胚（ 図5A及び6A）を除いた、感染した魚を大量に均質なグループを生成した。事前ソートした後、M. marinumの感染した胚を、リファンピシン、最初のラインの抗結核薬で処理した。これまでの研究では、200μMの用量のリファンピシンによる治療が効果的にMを減少させることを実証しゼブラフィッシュ7、13 マリナム感染。 advantagを取っハイスループット設定で生成均質に感染した胚の大多数の電子は、異なる用量での処置を行った。 M.に感染した胚M marinumの株および12,24、および200μMリファンピシンで48時間処理は、用量依存的に（ 図5B）で効率的にマイコバクテリア感染を低減することが示された。この濃度は、将来の実験のために使用した200μMの用量でリファンピシンを用いて、感染の効率的な低減の点で好ましい。前の結果に沿って、Mを使用して細菌負荷の進行を研究マリヌム E11株を大幅に削減、24時間目以降200μMのリファンピシンで処理した後には、（ 図6B）が観察された。 高倍率撮影をこれらの胚が要求される場合にはさらに、それらは、サンプルが使用して分析することができ、そこから、96ウェルプレート（ 図1C）に自動的に表示することができる大きなパーティクルサンプラ脊椎動物自動スクリーニング技術システムは、CLSM上に実装。 大粒子サンプラー脊椎動物自動スクリーニング技術システムのいずれかCLSMや実体顕微鏡に取り付けることができるシステムです。このデバイスは、自動的にガラスキャピラリーを介して96ウェルプレートまたはバルク容器から、ライブまたは固定された胚のローディングを可能にし、所望の角度（ 例えば 、背側または横方向）でのカメラの前でそれを配向させる。すべての向きでの胚の画像は、オンボードカメラで、または外部CLSM（ 図7）を用いて行うことができる。胚はその後、収集されたか、廃棄物コンテナに転送されます。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> 図1。主流の実験OUTLINE。大によるA）成魚が卵を集め、アガロースプレートに整列して注入され、結合するように一緒に入れている。B）が注入された卵は28℃でインキュベートされ、可能な薬物治療のために事前にソートされます。C）その後の分析粒子は、フローサイトメーターおよび/ ​​またはCLSMと大きなパーティクルサンプラ/脊椎動物自動スクリーニング技術。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> 図2。S.のための最高の細胞期の確立表皮は、注射卵黄。ゼブラフィッシュ胚は、Sの100 cfuの1〜512細胞期までさまざまな発生段階の卵黄に注入した表皮ブドウ 。 1 Aとの間で注入された胚ND 8細胞期は4解像度から卵黄と高い死亡率で細菌の増殖を示した。 16および128細胞期の間に注入胚は卵黄中の3 dpiで始まる体内に細菌の増殖を示した。 256および512細胞期の間に注入胚は卵黄の中に多くの細菌の増殖を示した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> 図3サイトメーター大きな粒子流を用いて細菌負荷の定量 S.の100のcfu 表皮は、ゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。A）5解像度まで、毎日、10胚のグループが2つの生物学的レプリカ（エラーバーに基づいて平均指数関数的な成長を見せ、均質化し、直接播種した分析サイトメーター= SEM）。B）大粒子流は、非注入し、S.からの平均蛍光シグナルを示してい表皮は、胚を注入した。条件あたり30から160胚（エラーバー= SEM）を分析した、異なる文字はTukeyの事後検定（P &lt;0.001）、NSが続く一方向ANOVAによって統計的有意差を示す：CFUの間には有意ではない差異C）の相関をと10 S.の群の平均蛍光シグナル表皮は、胚（エラーバー= SEM）を感染させた。この図は、ベネマンらから変更されている。（2013年）8。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> 図4。EstablisM.のための最高の細胞期のhment マリヌム卵黄注入。ゼブラフィッシュ胚がMの30 cfuの1〜512細胞期までのすべての異なる発生段階で注入したmarinumの E11およびM株はA、B）は、胚を示した8細胞期から注入同様の拡散及びそれらが注入されながらE11株は肉芽腫および全身性感染症の形成を示した両方の株による死亡率は、A）胚は、16〜128細胞期の間に注入256から512細胞期は、卵黄に細菌負荷を保った。B）の胚が128〜512細胞期から注入されたものは、卵黄に細菌負荷を保ちながら、様構造肉芽腫および全身感染症の形成を示し、M株と16-64細胞期の間に注入。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt;：FOコンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; 図5。M.の治療ファーストラインの抗結核薬とマリヌム急性感染。胚はMの30 cfuの16-64細胞期の間に注入マリヌム M株は両群で、個々の胚の非および/ ​​または高度に感染した胚。A）の蛍光を捨てた後2つのグループにソートする3 dpiでフローサイトメーター大きな粒子を介して実行された。B）の胚は、リファンピシン（RIFで処理）12、24の用量で48時間、および200μMのは4 dpiで分析した。その細菌負荷が大幅に。C）代表COPASの12の用量でDMSOおよびリファンピシンで処理された胚のプロファイル、24、および24時間200μmで還元される。細菌負荷および分布は、赤いピークで表示されます。青い線は、ゼブラフィッシュの電子DPF要素替え（4のプロファイルを表すmbryo）COPASによる。条件あたり60〜90の胚を分析した。各データポイントは、個々の胚を表す。値は平均±SEMとして示されている。 NS：有意ではない差異。差異の統計的有意性の解析は、ANOVAはTukeyの事後検定に続く1の方法により実施した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> 図6。M.の治療最初の行の抗結核薬とマリヌム慢性感染症。胚はMの30 cfuの16-64細胞期の間に注入マリヌム E11株は大きな粒子非および/ ​​または高度に感染した胚を破棄した後に2つのグループにソートされている3 dpiでフローサイトメーターに通した。<html> A）両群における個々の胚の蛍光。B）4日間、200μMのリファンピシン（RIF）で処理された胚は、治療の1日後の細菌負荷の大幅な減少を示して分析した。条件ごとに90の胚を分析した。値は平均±SEMとして示されている。異なる文字は、同じ治療の時点の間に有意な差を示す。 *対照群との有意差を示している。 NS：有意ではない差異。差の統計的有意性の分析は、ANOVAはチューキーの事後検定に続く片道により行った。 （P &lt;0.05）。図B）はSpaink らから変更されている。（2013）13。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> hres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; 図7。M.の結果マリヌム E11卵黄注入は、脊椎動物の自動スクリーニング技術とCLSMを使用して画像化した。Mの5解像度FLI1-EGFP 14胚。A）ライブ胚を示す増殖の共焦点Zスタック（ステッチ3画像）体全体マリヌム E11菌（赤）。B）は、M. を示す5 dpiのFLI-EGFP胚を修正しました体全体マリヌム E11菌（赤）白血球のL-プラスチンが15を免疫染色によって検出された（水色）との共局在化する。

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K ビュー.  Leiden University. このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。 

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

免疫・感染学

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化

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