このプロジェクトは、（AJBとLGAのため、R01 AI076246）健康NIAIDの国立研究所のための助成金によって部分的にサポートされていました。 サルモネラ変異体のコレクションの一部は、HAP、R21のために（部分的に健康補助金の国立研究所によって、（MM、U01 A152237-05、R01 AI07397-01、R01 AI039557-11およびR01 AI075093-01用）健康補助金の国立研究所によってサポートされていましたAI083964-01、1R0 1AI083646-01、1R56AI077645、R01 AI075093）。私たちは、レプリカ平板法とコレクション内の変異体を確認するためのシュテフェンProwollikに感謝します。

1マウスマクロファージRAW264.7細胞培養<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中でT-75細胞培養フラスコ通気フィルタキャップに低い継代数マウスマクロファージ細胞を増殖、RAW264.7（ATCC®番号、TIB-71） 5％CO 2インキュベーター中、37℃で0.5％のNaHCO 3、および1％100×非必須アミノ酸（NEAA）。 </li><li>細胞がフラスコ中の60〜80％コンフルエンスに達したら、細胞を採取し、血球計で細胞を計数し、細胞濃度を計算するために、細胞スクレーパーを使用する。 </li><li>細胞を再懸濁し、新鮮なDMEM細胞培養培地中で2.5×10 5 / mlの細胞濃度に希釈する。 96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに5×10 4細胞を含有するDMEM細胞培養培地200μlをプレートにマルチチャンネルピ ​​ペットを使用する。 </li><li>各サルモネラ株の 4つのウェルをプレート。 1セットのために3つの個別のプレートをセットアップします食細胞浸潤アッセイの、それぞれ、「会合」、「侵略」と「複製」でそれらをマークします。 </li><li>マクロファージ細胞をウェルの底に付着させ、37℃ON、5％CO 2インキュベーター内でプレートを置きます。 </li></ol> サルモネラ野生型および変異体の作製<ol><li>マクロファージRAW264.7細胞を調製する同じ日に、野生型（WT） サルモネラ菌血清型ネズミチフス菌の14028s、DinvA変異体、DphoP変異体、および所望の試験変異株、およびルリア-ベルターニ（文化、それらを単一のコロニーを選択必要に応じて抗生物質を添加したLB）培養液。 10変異株（DinvA変異体とDphoP突然変異体は、それぞれ、浸潤および細胞内複製に欠陥がある）までテストするために食細胞浸潤アッセイの各セットを使用してください。 </li><li>秒、37℃で14時間、細菌を育てる丸底チューブにゆるく蓋をし14ミリリットルポリプロピレンで5ミリリットルのLBブロスのそれぞれにおいて220 rpmでhaking。 LBブロスは、50μg/ mlの、私たちの場合には、変異株のほとんどが、カナマイシンに耐性を示す、適切な抗生物質が含まれています</li><li>次の日、220 rpmで振盪しながらさらに4時間、1:50の比率でのLBブロスの平野5ml中のサルモネラ菌株の培養物に対するサブカルチャーをそれぞれ。 </li><li> ODを分光光度計で、各細菌培養の600の値を読み、それぞれの読み取りはサルモネラ病原性島-1 III型分泌系（SPI-1 TTSS）侵略のための遺伝子発現を最適化するために、0.6から1.2の範囲であるべきである。 </li><li>新鮮なDMEM細胞培養培地中のmlの5×10 6 CFU /の濃度に菌を希釈、その後、細菌濃度を推定するために1 OD 600 = 7.5×10 8 CFU / mLの計算式を使用してください。 </li></ol> 96ウェル培養プレート中で3浸潤アッセイ<ol><li> 3 96ウェルセル画を削除するCO 2インキュベータからL培養プレートおよび1×PBS緩衝液200μlで一回各ウェルを洗浄する。 </li><li>洗浄およびPBSを完全に除去した後、各ウェルに200μlの細菌DMEM培地（上記参照）を追加する。 1：これは20の感染の各ウェルと多重度が1×10 6 サルモネラ細胞 （MOI）になる。 </li><li> 10分間の密閉されたキャリアは1,000×gで遠心分離し、プレートを、その後、37℃、30分間、5％CO 2インキュベーターでプレート（時間ゼロ）を交換してください。各株については、少なくとも4つの連のウェルを設定します。 </li><li> 30分後、インキュベーターからプレートを取り外して、関連付けられていない細菌を除去するために1×PBS200μlで3回洗浄。 </li><li>洗浄後、更なる処理のための「会合」で標識されたプレートを保存します。オーダーT内の「侵略」と「複製」でマークされたプレートの各ウェルに100μg/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM培地200μlを追加O。外サルモネラ菌を殺す追加の時間、37℃、5％CO 2インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>マクロファージ細胞数を記録するための各感染株から1つのウェルに保存する、10分間、1％トリトンX-100を含有する1×PBS200μlで「会合」プレート上のウェルの残りの部分を扱う。トリトン溶液は、マクロファージ細胞を溶解し、関連したサルモネラをリリースします。 </li><li>各ウェルから収穫サルモネラおよび1.5mlのエッペンドルフチューブに入れます。各ウェルから採取したサンプルに900μL1×PBSで3 10倍連続希釈を行い、渦は、各希釈の間で実行される。 </li><li>どちらLB（WT）またはLB館（突然変異体）プレート上に第3の希釈、10 -3を 、プレート。適切なサルモネラ株名、希釈番号、時刻と日付のプレートにラベルを付けます。 </li><li>第三の希釈チューブをボルテックスした後、寒天の表面に10μlのサンプルを分注するとfを繰り返します5滴の合計のための私達の回。 510μlをペトリ皿プレート7上に均一に落下空間にいることを確認してください。 </li><li>滴が寒天に浸透した後、上の板を回し、37℃、5％CO 2インキュベーターで一晩インキュベートする。 </li><li> 10分間、0.25％トリプシン-EDTAを含む150μlのを1×PBSとマクロファージの計数のために保存された井戸を扱います。 </li><li>トリプシン処理後、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに場所マクロファージとは、トリプシン/ EDTA溶液を中和するために、FBS50μlとそれらを扱う0.4％トリパンブルーを用いて細胞を染色し、血球計を使用してを介してそれらをスコア。 </li><li> 1時間のインキュベーションが経過すると、CO 2インキュベータからの「侵略」と「複製」のプレートを取り外してから、「ステップ3.4」として、各ウェルを洗浄する。 </li><li> 「ステップ3.6から3.12」として更なる処理のための「侵略」のプレートを保存します。 </li><li>に10μg/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM培地200μlを追加します。培地中で細胞外サルモネラのクリアランスを維持するための「複製」のプレート。 37℃、追加の22.5時間、5％CO 2のインキュベーターにプレートを返します。 </li><li>次の日、37℃、5％CO 2インキュベータから「複製」のプレートを取り外して、「ステップ3.4」として、各ウェルを洗い、「ステップ3.6から3.12」として扱う。 </li><li>最後に、37℃のインキュベーター中で一晩インキュベートした後、寒天プレートを除去し、細菌コロニーの数をスコア。 </li><li>良いコロニー分布は10〜100個のコロニーの間でなければなりません、各スポットは、約2から20個のコロニーが含まれている一つの場所に20以上のコロニーがあった場合、それが得点するのは難しいだろう。カウントが低すぎたり高すぎると、必要に応じて10倍高いまたは低い希釈でサンプルをreplate。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>メッキに基づいて、各プレートのCFU（1ml当たりのコロニー形成単位）を計算するボリュームと希釈係数。 </li><li>各株から記録されたマクロファージ細胞数を通してマクロファージあたりのサルモネラの数を確認。 </li><li>それぞれ、細胞結合、浸潤または複製のための少なくとも3つの独立した実験からのマクロファージあたりのCFUの幾何平均を計算し、相対値をWTにさらに正規化する。 </li><li> WTの各菌株を比較することで、それぞれのスチューデントのt -testによる関連、浸潤、およびレプリケーションのためのデータを分析し、p値による統計的有意性を決定する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. 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J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

ゲンタマイシン保護アッセイが広く、宿主細胞内の細胞内細菌性病原体の侵入および複製を研究するために使用され、それは、特に、その侵入感染1を確立するための前提条件のステップであるサルモネラのように、病原体を研究するための重要な生物学的ツールである。 サルモネラ研究コミュニティにおける標準ゲンタマイシン保護アッセイを24ウェル培養皿<sup...

非チフス性サルモネラは、すべての脊椎動物の腸内疾患の重要な原因である。ヒトでのサルモネラ症は、トップ細菌性食品媒介疾患1つである。彼らの動物宿主でサルモネラとの相互作用を支える分子機構の特性は、主に、感染の組織培養および動物モデルでのサルモネラ菌血清型ネズミチフス菌（STM）の研究によって達成される。 STM-ホスト相互作用に洞察を得ることは、私たちはサルモネラ菌が生存し、宿主細胞の内部成長をどのように理解するのに役立ちます。これらの相互作用を研究する最初の課題は、ホストと病原体の両方から可能な限り多くの参加要因を特定することであるが、これらの努力は、主に、同時に2つの独立した複雑な生物学的システムを扱う、 すなわち 、ホストとサルモネラの重要な難しさによって妨げている 生理的条件下で。さらに、大規模なrepertサルモネラのoire、潜在的にホストの相互作用に関与する因子をコードする宿主遺伝子は、この課題に取り組むために、ハイスループットの生物学的なプラットフォームを必要とします。 サルモネラの関連付けを表現型に変更され、標準化されたアッセイは、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける侵略と複製が可能性が高いサルモネラ -host相互作用に従事した遺伝子の大規模なセットを調べるために開発されました。ゲンタマイシン保護アッセイは、1973年2で開発されましたが、最初に徹底的に1994年3,4にElsinghorstによって記述されていた。今では、サルモネラ 5,6を含むex vivoで多くの細胞内細菌性病原体を、研究するための標準的なツールとなっています。内部化細菌は真核細胞3に浸透することはできませんゲンタマイシンのようないくつかの抗生物質、によって殺されることを避ける。この現象を利​​用することによって、ゲンタマイシン保護アッセイは、細胞内のBAの生存および増殖を測定するcterial病原体。感染の間の3つのイベント、 すなわち 、真核細胞浸潤及び複製との関連、感染症、ゲンタマイシン処理、およびさらなるインキュベーション（ 図1）との間の時間間隔に基づいて、細胞内細菌性病原体について評価することができる。真核細胞系は、宿主 - 病原体相互作用の研究のための適切な動物モデルよりも複雑で、生理的環境を提供する。 ゲンタマイシン保護アッセイは、STM-宿主の相互作用を研究するための適切なプラットフォームであるが、24ウェル培養皿中の標準アッセイは、ロースループット容量を有する。 インビボでのデータセットのコンピューター分析は、約300宿主遺伝子産物（未発表データ）と相互作用することが予測される149 サルモネラ遺伝子産物を同定した。標準ゲンタマイシン保護アッセイを効率的に突然変異体のこの数を表現型に能力を持っていません。 ADDITでイオン、ゲンタマイシン保護アッセイは、理論的には単一の細菌の侵入を検出することができる。異なる時間に繰り返されるときこのため、固有の感度で、生データは、技術的差異の影響を受けやすい。内部統制および正規化後の相対的なデータの提示は、結果の意味の解釈のために不可欠である。これらの考察を考慮すると、修正された、標準化されたゲンタマイシン保護アッセイは、試験能力を向上させ、精度を高めるために開発された。 以下のプロトコルを詳細かつ96ウェル培養皿及びマウスマクロファージRAW264.7細胞株を使用して変更ゲンタマイシン保護アッセイを行うことが示されている。 24ウェル培養皿中の標準プロトコルと比較して、修正されたプロトコルは、以下の利点を有する：1）96ウェル培養皿を使用すると、十分な統計的検出力を有する内部陽性対照および陰性対照を含む表現型を決定するために10の異なる変異株まで使用でき;変異体株は、同一の培養皿に、同時に試験するため、2）結果の分散が大幅に低減される。オペレータの疲労を軽減しながら3）マルチチャンネルピペットの使用は、スループットを増加させる。最後に、24ウェル培養皿に比較して、96ウェル培養皿中でウェルあたり少ない宿主細胞の懸念は、プロトコルの最適化および標準化することで解決した。 要約すると、食細胞におけるインビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、侵入および複製に変更された、標準化されたアッセイは、精度が向上し、オペレータの疲労を低減しつつ、高スループット能力を達成する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

サルモネラ種は、人畜共通の病原体とヒトや家畜1における食品媒介性疾患の主要な原因である。 サルモネラ -host相互作用のメカニズムを理解することは、 サルモネラ感染症の分子病態を解明するために重要である。食細胞におけるサルモネラ関連付けを表現型にゲンタマイシン保護アッセイ、浸潤及び複製は、RAW264.7マウスマクロファージを用いて宿主相互作用におけるサルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌の欠失変異体の役割を定義するためのハイスループットスクリーニングを可能にするように適合させた。このプロトコルの下で、分散野生型および複数の変異株が同一の培養皿に、同時に試験することができるので、測定値に有意に、標準プロトコルと比較して低減される。マルチチャンネルピペットの使用は、スループットが向上し、精度を向上させる。さらに、懸念が少ない鎬使用に関連96ウェル培養皿中でウェルあたり番目の細胞が対処された。ここでは、食細胞を使用して修正インビトロサルモネラ浸潤アッセイのプロトコールに成功協会、浸潤および細胞内複製のための38の個別サルモネラ欠失変異体を表現型に採用された。 インビトロ表現型は、そのうちのいくつかは、その後、動物モデルにおいてin vivo表現型を持っていることが確認された、提示される。このように、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける修正された、 サルモネラの関連付けを表現型に標準化されたアッセイ、浸潤および複製は細菌-宿主の相互作用を研究するために、より広く利用することができる。

データが変更された食細胞浸潤アッセイに基づいてプロットされた後、代表的な結果（ 図2）を参照してください。データは複製8欠陥があることが知られている5の異なる株、WT、ΔinvA、ΔphoP、変異体A、および侵入のための欠陥があることが知られている突然変異体B.ΔINVA、およびΔphoPを含む、実験的な妥当性を評価するための陽性対照として使用され...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

インビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、浸潤、および高スループット能力を有する食細胞での複製にハイスループットアッセイを開発した。方法は、宿主-病原体相互作用におけるそれらの関与がためにサルモネラ遺伝子ノックアウト変異株を評価するために使用した。

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K ビュー.  Texas A&M University.  インビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、浸潤、および高スループット能力を有する食細胞での複製にハイスループットアッセイを開発した。方法は、宿主-病原体相互作用におけるそれらの関与がためにサルモネラ遺伝子ノックアウト変異株を評価するために使用した。 

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

識別のためのアレロタイプ化PCRサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

免疫・感染学

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...